活性羰基化合物(reactive carbonyl species，RCS)是一类有害活泼性小分子，如丙烯醛(acrolein，ACR)、丙酮醛(methylglyoxal，MGO)、巴豆醛(crotonaldehyde，CRO)、5-羟甲基糠醛(5- hydroxymethylfurfural，5-HMF)、甲醛(formaldehyde，FOR)、乙醛(acetaldehyde，ACE)。RCS主要存在于环境污染[1]、动植机体内源性代谢[2]和食品加工贮藏过程中[3-4]。脂质氧化、磷脂和脂肪酸氢过氧化物分解、还原糖和蛋白质的美拉德反应均为食源性RCS的主要产生途径。RCS具有强亲电性能，可与不同的细胞成分(大多数为亲核物质)发生强烈反应[5]。生物分子的巯基、咪唑基、羟基以及嘌呤和嘧啶碱基中的氮、氧原子等强亲核位点是其最易攻击的目标，RCS与其相互作用可能导致蛋白质、核酸和氨基磷脂的化学修饰，从而导致细胞毒性和诱变作用[6-7]。研究证明，RCS与癌症、神经退行性疾病、糖尿病并发症、阿尔茨海默症、衰老、动脉粥样硬化等多种疾病密切相关[8]。因此，食品加工和贮藏过程中产生的RCS，给食品安全带来潜在危害，成为目前关注的热点。
白酒是以粮谷为主要原料，以大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏、贮存而制成的蒸馏酒。白酒作为我国特色蒸馏酒，产量逐年递增，饮用白酒的人口也十分庞大，因此，白酒的质量安全状况与我国人民的生命健康息息相关[9-10]，关注白酒加工过程中潜在的有害物质愈发重要。国外已在葡萄酒[11]、啤酒[12]、水果蒸馏酒、威士忌、龙舌兰、白兰地、朗姆酒[13-15]等酒精饮料中检测到甲醛、乙醛、乙二醛、丙酮醛、丙烯醛、巴豆醛、糠醛、5-羟甲基糠醛等RCS。目前白酒中有毒有害物质研究主要集中在氨基甲酸乙酯[16]、生物胺[17]、氰化物[18]等内源性物质，以及塑化剂[19]、重金属[20]、农药残留[21]、真菌毒素[22]等外源性物质，而针对小分子RCS尚未引起足够重视。研究发现，微生物发酵以及粮食发生的美拉德反应极大提升了酒体中RCS的形成,因此监控白酒中的有害RCS至关重要。
近年来国内外针对RCS的检测分析主要有荧光光谱法[23]、分光光度法[24]、同位素稀释质谱法[25]、液相色谱法[26]、气相色谱质谱联用法[27]、电化学法[28]等。虽然质谱联用可以同时检测多种醛类物质，但质谱成本较高，企业普及和推广受限。因此有必要建立同时检测多种RCS的普通色谱方法。由于白酒中挥发性物质较多，采用气相色谱法分析RCS，干扰较大；而且气相色谱选用的共衍生化试剂成本较高；而液相色谱法既能对多种成分实现有效分离，衍生化试剂简单易得，成本低，且方法稳定性较好、检测限灵敏度均能达到预期效果，在行业中易于普及推广。故而本研究拟以2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)作为衍生化试剂，采用HPLC-二级管阵列检测器(diode array detection，DAD)建立一种同步测定白酒中多种RCS(ACR、MGO、CRO、5-HMF、FOR、ACE)含量的方法，为白酒产品中多种有害RCS的同步检测以及对白酒酿造加工过程有害RCS产生途径的监控提供有利手段。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
丙烯醛(95%)，萨恩化学技术(上海)有限公司；丙酮醛(40%)，美国Sigma-Aldrich公司；巴豆醛(99%)，Adamas-beta试剂；5-羟甲基糠醛(99.7%)，毕得医药；甲醛(100 mg/L)，生态环境部标准样品研究所；乙醛(40%)，上海展云化工有限公司；2,4-二硝基苯肼(98%)，上海麦克林生化科技有限公司；乙腈(色谱纯)，德国Merck公司；实验用水为超纯水；其余试剂均为国产分析纯。
实验样品均通过市售或酒厂取样方式获得。酒样1～3为浓香型(42%vol～52%vol)，由酒厂A、B、C提供；4～6为酱香型(43%vol～53%vol)，由酒厂D、E提供；7～9为清香型(42%vol～53%vol)，由酒厂F、G提供；10～12为凤香型(42%vol～55%vol)，由酒厂H提供；13～15为芝麻香型(42%vol)，由酒厂I、J提供；16～18为兼香型(40.2%vol～42%vol)，由酒厂K、L提供。浓香型不同加工阶段样品由酒厂J提供，酱香型不同取酒次数样品由酒厂M提供。
1.2 仪器与设备
e2695液相色谱仪(配有2998二极管阵列检测器)，美国Waters公司；Thermo Biofuge Stratos超速冷冻离心机、N-EVAP氮气吹干仪，美国Organomation公司；Nanopure超纯水机，美国Thermo公司；PWC 254型分析天平，英国ADAM公司。
1.3 试验方法
1.3.1 溶液的配制
1.3.1.1 标准储备液的配制
精确吸取适量ACR、MGO、CRO、5-HMF、FOR、ACE标准品于100 mL棕色容量瓶中，加入磷酸盐缓冲溶液(0.1 mol/L，pH 4.0)溶解并定容后配制成质量浓度分别为0.01、0.02、0.01、0.01、0.01、0.50 mg/mL的标准品储备液，置于4 ℃条件下避光保存备用。
1.3.1.2 系列标准溶液的配制
精确吸取1.3.1.1中储备液适量于容量瓶中，用磷酸盐缓冲溶液(0.1 mol/L，pH 4.0)逐级稀释至标准系列溶液，其中ACR、CRO、5-HMF、FOR的质量浓度为0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、1.5 μg/mL，MGO的质量浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3 μg/mL，ACE的质量浓度为0.625、1.25、2.5、5.0、12.5、25、50、75 μg/mL。
1.3.2 样品前处理
1.3.2.1 成品酒、原酒样品
参考文献[29-30]并进行优化，取适量液体样品用磷酸盐缓冲溶液(0.1 mol/L，pH 4.0)将其酒精度稀释至10%vol，涡旋混匀，精密吸取3 mL加入4 mg/mL DNPH-乙腈溶液 0.3 mL，加盖混匀，于50 ℃恒温水浴振荡器中避光反应1.5 h后冰水冷却。加入3 mL二氯甲烷，涡旋2 min，10 000 r/min离心15 min，萃取2次，合并二氯甲烷层，氮气吹干后用200 μL乙腈复溶，0.22 μm有机滤膜过滤后HPLC检测。
1.3.2.2 固体原料、酒醅样品
取一定量固体样品粉碎，精密称取5 g，加入50 mL 磷酸盐缓冲溶液(0.1 mol/L、pH 4.0)，加盖混匀，浸泡过夜，冰浴超声30 min后10 000 r/min离心15 min，精确吸取上清液3 mL按1.3.2.1中方法处理样品，HPLC检测。
1.3.3 色谱条件
色谱柱为Beconsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温40 ℃；流速1.0 mL/min；进样量5 μL；检测波长360 nm(ACR、MGO、CRO、FOR、ACE)/400 nm(5-HMF)；流动相为超纯水与乙腈梯度洗脱(0～3 min，乙腈50%；3～12 min，乙腈50%～90%；12～12.5 min，乙腈90%～100%；12.5～15 min，乙腈100%)。
1.4 数据统计及图表绘制方法
所有实验均平行3次，采用Excel 2010、SPSS 17.0 分析实验数据，结果以
表示。采用One-way ANOVA模式分析, 显著性差异采用Duncan检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 色谱峰确立
由图1可知，通过对RCS共衍生化条件及色谱条件的优化，各待测物质在液相色谱中分离度良好，空白无杂质峰干扰，达到分析要求。
1-DNPH；2、2′-5-HMF；3-MGO；4-FOR；5-ACE；
6-ACR；7-CRO
A-空白溶液；B-混合标准品溶液；C-白酒样品
图1 空白溶液、混合标准品溶液及白酒样品的色谱图
Fig.1 HPLC chromatograms of blank sample、mix standard solution and liquor samples
2.2 方法学考察
2.2.1 标准曲线、线性范围和检出限及定量限测定结果
取系列标准溶液按1.3.2.1进行衍生化，按1.3.3进行HPLC分析。以质量浓度为横坐标x，以RCS衍生物峰面积为纵坐标y，分别绘制标准曲线并计算回归方程。根据信噪比确定检出限(RSN=3)以及定量限(RSN=10)。如表1所示，6种RCS呈现良好的线性关系，相关系数在0.999以上，检出限和定量限满足分析要求。
表1 六种RCS的标准曲线、相关系数、线性范围、检出限和定量限
Table 1 Regression equation, correlation coefficient, linear range, limit of detection and limit of quantitation of 6 RCS by HPLC
名称标准曲线相关系数线性范围/(μg·mL-1)检出限/(ng·mL-1)定量限/(ng·mL-1)ACRy=8.953×105x+4.86×1030.999 60.012 5～1.5310MGOy=6.163×104 x+9.54×1010.999 10.025～3.0825CROy=1.088×106x+1.38×1030.999 90.0 125～1.53105-HMFy=5.866×105x+3.04×1030.999 80.012 5～1.5310FORy=2.454×106x+6.86×1040.999 50.012 5～1.513ACEy=1.291×105x+6.038×1040.999 30.625～75.013
2.2.2 样品稳定性测定结果
将混合RCS标准溶液按1.3.2.1方法处理后，分别于25、4 ℃避光放置0、1、2、4、8、16、24 h后在1.3.3的色谱条件下测定各RCS衍生物的峰面积，计算相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。表2结果表明在室温贮存条件下，ACR、MGO、CRO、5-HMF、FOR、ACE的RSD均<5%，但MGO的RSD略高，总体在室温下24 h内稳定。而在4 ℃下，6种目标物的RSD均<2%，表明4 ℃条件下稳定性更好。
表2 稳定性实验结果(n=3) 单位：%
Table 2 Results of stability assay (n=3)
名称ACR MGOCRO 5-HMF FOR ACE25 ℃1.154.030.951.103.892.424 ℃1.121.040.500.601.571.30
2.2.3 加标回收率和精密度测定结果
向白酒样品中分别加入低、中、高3个浓度水平的混合标准溶液，混合均匀后将样品酒精度稀释至10%(体积分数)，取3 mL按1.3.2.1方法处理，每个加标水平平行做6次实验，计算相应组分的加标回收率和RSD，结果见表3。6种RCS平均加标回收率为85.39%～105.78%，RSD均<4%，表明该方法精密度良好，准确度高。
表3 加标回收率和精密度结果(n=6)
Table 3 Results of average recoveries and precision (n=6)
名称本底值/(μg·mL-1)加标量/(μg·mL-1)测定值/(μg·mL-1)平均回收率/%RSD/%0.470.250.70±0.0392.59ACR0.500.97±0.0399.502.553.690.751.24±0.04102.072.890.310.150.44±0.0185.39MGO0.300.57±0.0187.242.512.450.450.72±0.0290.153.021.340.701.97±0.0790.26CRO1.402.68±0.0595.691.953.342.103.39±0.0797.702.030.170.080.25±0.0194.105-HMF0.160.33±0.01101.222.682.990.240.42±0.01105.783.121.140.601.71±0.0495.31FOR1.202.36±0.09101.903.852.341.803.00±0.06103.252.02136.2265.0192.5±5.2286.60ACE130.0253.9±6.8390.512.692.71195.0316.3±8.7992.332.78
2.3 不同香型成品酒中RCS的含量解析
选取18种白酒样品进行测定，包括浓香、酱香、清香、凤香、芝麻香和兼香型6种香型。采用上述方法测定ACR、MGO、CRO、5-HMF、FOR和ACE含量。结果见表4，ACR含量为0.21～0.88 μg/mL，MGO含量为0～0.45 μg/mL，CRO含量为0.10～0.94 μg/mL，5-HMF含量为0.03～0.29 μg/mL，FOR含量为0.30～2.73 μg/mL，ACE含量为85.36～215.04 μg/mL。其中大部分样品中未检出MGO，检出部分MGO含量为0.31～0.45 μg/mL；此外所有样品中均含有85 μg/mL以上的ACE，平均含量高于伏特加(3 μg/mL)、朗姆酒(18 μg/mL)和威士忌(28 μg/mL)等国外蒸馏酒[27]。同时我们发现酱香型和芝麻香型白酒中ACR、MGO、FOR和ACE含量明显高于其他香型，芝麻香型和酱香型白酒均采用高温发酵工艺，尤其酱香型白酒生产遵循“四高两长”工艺，即高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温馏酒，发酵周期长、贮存期长，高温处理明显加快美拉德反应、甘油脱水及糖分解等反应[1, 21]，由此推测高温工艺是导致这2种香型白酒中有害RCS含量高于其他香型白酒原因之一。
表4 白酒中6种RCS的含量(n=3) 单位：μg/mL
Table 4 The content of 6 RCS in liquor(n=3)
样品香型ACRMGOCRO5-HMFFORACE10.41±0.01GcND0.57±0.03Gc0.09±0.01Ea0.92±0.02Fc105.26±2.65Hc2浓香型0.67±0.02CaND0.53±0.03Ga0.03±0.01Gc0.83±0.01Fa100.56±3.40Ib30.52±0.03EbND0.09±0.01Ib0.14±0.02Cb0.31±0.01Kb85.36±2.50Ka40.72±0.03Ab0.37±0.03B0.92±0.03Aa0.20±0.02Bb1.35±0.04Db215.04±4.26Ac5酱香型0.47±0.01Fc0.31±0.02D0.88±0.02Bc0.17±0.02Bc1.14±0.01Ea136.22±3.38Fb60.86±0.04AaND0.94±0.03Ab0.29±0.02Aa2.28±0.01Cc115.17±4.15Ga70.54±0.03E0.38±0.01B0.10±0.01Ia0.08±0.01Ea0.64±0.03Ha108.72±2.70Ha8清香型0.55±0.03END0.10±0.01Ic0.07±0.01Fb0.57±0.02Hb94.56±0.27Ec9NDND0.10±0.02Ib0.05±0.01Fc0.30±0.02Kc105.22±2.56Ib100.34±0.03Hb0.34±0.01C0.41±0.03Ha0.09±0.01Eb0.55±0.04Ib109.98±3.57Hc11凤香型0.24±0.02IcND0.37±0.03Hb0.09±0.01Ec0.52±0.03Ja166.66±2.79Cb120.21±0.03IaND0.84±0.03Cc0.08±0.01Ea0.40±0.03Jc100.24±2.90Ia130.66±0.01Cb0.38±0.04B0.91±0.02Aa0.12±0.01Da2.57±0.03Ba166.83±8.42Ca14芝麻香型0.88±0.02Aa0.45±0.02A0.93±0.03Ab0.17±0.03Bc2.54±0.05Bb178.90±5.21Bb150.73±0.03BcND0.84±0.02Cc0.12±0.02Db2.73±0.03Ac148.71±2.33Dc160.85±0.03AcND0.74±0.01Fb0.14±0.02Cb0.66±0.01Gc132.69±2.14Fa17兼香型0.61±0.02DaND0.76±0.02Ea0.17±0.03Ba0.50±0.01Jb108.33±2.61Hc180.79±0.03AbND0.81±0.02Dc0.19±0.04Bc0.62±0.01Ha141.69±1.90Eb平均0.560.120.600.131.08128.90
注：ND，未检测到；采用Duncan′s 多重比较法进行显著性检验，不同小写字母代表相同香型不同酒之间差异性显著(P<0.05)；不同大写字母代表18种样品之间差异性显著(P<0.05)
2.4 酱香型白酒多次取酒RCS的含量变化
酱香型白酒作为我国主体香型之一，占据较大消费市场，采用2次投料，8轮次发酵，7次取酒，“四高两长”工艺。由表4可知酱香型白酒中RCS含量最高，因此对2～7次取酒样品中RCS进行分析。由图2可知，不同次数所取酒样中RCS含量存在显著性差异。我们知道酿造完成取酒过程中，第3、4次取酒产量最高[31]，第3、4、5次的酒口感、香气最佳。但是我们分析结果发现，除乙醛外，5种RCS总量最高的为第5次，总量为12.80 μg/mL；第4次与第5次无显著性差异，为12.49 μg/mL。在这些酒体样品中，乙醛含量远高于其他4种醛类。其中第3次取酒乙醛含量远高于其他取酒样品，推测随着发酵时间的延长，微生物发酵过程产生的RCS化合物含量存在增加趋势，到后期这些醛类随着取酒产量和酒体内容物含量的降低而降低。
A-5-HMF、FOR、CRO、MGO含量；B-ACE含量
图2 酱香型白酒不同取酒次数对RCS含量的影响
Fig.2 The contents of RCS of different times in taking Maotai-flavor liquor
2.5 浓香型白酒不同加工阶段RCS的含量变化
在我国所有白酒香型酒中浓香型的产量最大，生产采用混蒸续粮固态发酵法，中偏高温发酵，采用“跑窖”、“原窖”、“老五甑”工艺；“两高一长三适当”(即入窖淀粉高，酸度高，长期发酵，适当的水分、温度和糠壳用量)。浓香型白酒在发酵结束开窖时，将大部分糟醅取出，在窖池底部留少部分糟醅进行再次发酵，经过2轮发酵期满的这部分酒醅，即称为“双轮发酵糟”，所酿出的酒为“双轮底发酵酒”，此为延长发酵期的一种工艺方法。为考察浓香型白酒加工过程中RCS产生的规律，对白酒加工不同阶段取样进行测定，前期固体样品包括：润料、入窖发酵前原料、出窖堆积原料；液体酒样品包括：发酵上层、发酵中层、发酵下层、双轮底酒样。结果见图3，固体原粮从润料到出窖堆积产生的RCS总量升到最高值，而液体发酵馏出酒液中双轮底样品RCS含量最高；其次是中层发酵酒样含量较高。推测其原因为出窖堆积过程中发生的美拉德反应导致RCS上升；而双轮底为2次发酵，中层酒样发酵也是发酵过程相对比较充分，使得两者产生的RCS较多。除含量最高的ACE之外，针对不同种类的RCS，上层酒样中MGO含量最高，中层酒样中CRO含量最高，双轮底样品中ACR、FOR和5-HMF最高。其原因有待进一步研究。另外，我们发现经润料后的酿酒原料，也含有一定量的RCS。
RS-润料样品；FS-入窖发酵前；DS-出窖堆积；UL-发酵
上层酒样品；ML-发酵中层酒样品；LL-发酵下层酒样品；SL-双轮底发酵酒样品；mg/kg-固体样品RS、FS、DS的单位；μg/mL-液体样品UL、ML、LL、SL的单位
A-ACR、MGO、CRO、FOR、5-HMF含量；B-ACE含量
图3 浓香型白酒各加工阶段RCS的含量
Fig.3 The contents of RCS in each processing stage in Luzhou-flavor liquor
3 结论
本研究建立了一种同时测定ACR、MGO、CRO、FOR、ACE的方法，以DNPH为衍生化试剂，在50 ℃条件下反应1.5 h，采用Beconsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以纯水为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温40 ℃，二极管阵列检测器，检测波长360 nm(ACR、MGO、CRO、FOR、ACE)/400 nm(5-HMF)。各RCS的线性范围较宽，相关系数均在0.999以上，检出限1～8 ng/mL，定量限3～25 ng/mL，加标回收率为85.39%～105.78%，RSD均<4%，该方法准确度高，回收率好。对白酒成品样品和加工过程中原粮和发酵酒原液分析发现，酱香型和芝麻香型成品白酒的RCS物质明显高于其他香型，推测与其高温发酵工艺相关；酱香型白酒8轮发酵，7次取酒过程中，RCS总体含量最高的为第3、4和5次。浓香型白酒原料出窖堆积过程中产生的RCS升至最高，液体发酵酒原液中双轮底和中层发酵酒样品含量分列前2。由于白酒微生物发酵过程相当复杂，高温反应与发酵过程交织，活泼羰基化合物的形成机制还有待进一步研究。
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