黄酒是以糯米、粳米等为原料,麦曲等糖化剂和酵母等发酵剂为辅料,经双边发酵酿造而成的低酒精度饮料酒[1]。麦曲为黄酒的酿造过程提供淀粉酶和蛋白酶等丰富的酶系,还含有丰富的微生物及其代谢产物[2-4]。然而,麦曲的苦涩味影响了消费者饮用的舒适度[5]。因此,需要一种酒体清亮、口感清爽、风味柔和的清爽型黄酒来满足现代人的消费喜好。

由于传统黄酒工艺十分复杂,生产周期较长,出酒率低[6],将酶制剂和液化法相结合生产黄酒的方式已成为生产黄酒的新工艺[7-8]。但在液化法生产黄酒的过程中,不仅缺少了含酸的浆水来调节酒醅的酸度,而且在发酵过程未添加麦曲,缺少了产酸微生物,这就需要接种调酸微生物来调节黄酒中的总酸含量。黄酒中有机酸主要是由乳酸菌发酵产生乳酸菌与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)共同参与黄酒的发酵,是黄酒酿造的最重要的2种微生物[9-10]。

本试验以液态法黄酒酿造工艺为研究基础[11],开发一种不添加麦曲,而是利用生物酶制剂对酿造原料先进行糖化,再接种微生物进行发酵的新型黄酒酿造方法。以黄酒的基本理化指标及感官评价为依据,筛选黄酒酿造用乳酸菌,优化淀粉的液化、蛋白休止、糖化、酿酒酵母和乳酸菌协同混合发酵工艺,酿造一种酒体清亮、口感清爽、风味柔和、符合现代人消费嗜好的清爽型干黄酒,为黄酒酿造提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯米,无锡当地超市；耐高温α-淀粉酶、中性蛋白酶、糖化酶,帝斯曼(中国)有限公司；生麦曲、黄酒发酵液,绍兴某酒厂；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)N85,中国黄酒国家工程研究中心(绍兴)。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌的分离

取黄酒后酵时期的发酵醪液,在含有CaCO3指示剂的MRS固体培养基上,37 ℃厌氧培养3 d；可由有无透明圈来判断是否为产酸菌,再挑取不同形态特征的单菌落进行纯化。

1.2.2 黄酒酿造用乳酸菌的筛选

将分离筛选出的乳酸菌进行黄酒酿造,以黄酒的理化指标和感官评价[12]为依据,选取最适的黄酒酿造用乳酸菌。

1.2.3 乳酸菌的分子学鉴定

将乳酸菌的16S rDNA序列通过NCBI BLAST与Gene bank中已知细菌的16S rDNA序列进行同源性比对,再利用MEGA6软件建立该菌种的系统发育树[13]。

1.2.4 黄酒酿造工艺的单因素试验

黄酒初始酿造工艺：2目的糯米粉,料水比为1∶2.5(g∶mL),α-淀粉酶添加量10 U/g,95 ℃液化70 min；中性蛋白酶添加量为1 050 U/g,50 ℃酶解120 min；糖化酶添加量60 U/g,60 ℃糖化2.5 h。向米汁中接入1.2×107 CFU/mL酿酒酵母N85和4.8×105 CFU/mL植物乳杆菌,30 ℃发酵。当酒体失重<0.2 g时,黄酒前酵完成,再转入15 ℃生化培养箱,静置发酵14 d。

从料水比、α-淀粉酶添加量、液化时间、糖化酶添加量、糖化时间、酿酒酵母接种时间、酿酒酵母接种量、乳酸菌接种量8个因素对黄酒工艺进行优化。

1.2.5 响应面试验

通过Design-Expert V8.0.6进行响应面分析,得到最优解,再进行验证,确定黄酒最佳工艺参数。

1.2.6 传统工艺黄酒的酿造

以黄酒最佳工艺的料水比和酿酒酵母接种量为基础,进行传统工艺干黄酒的酿造[12]。

1.2.7 数据分析

数据分析采用 SPSS 25进行,每个试验均重复3 次,数据以平均值±标准偏差表示,并进行单因素方差分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 黄酒酿造用乳酸菌的筛选

从黄酒发酵液中分离到形态不一,差异性较大的7株乳酸菌,编号为F1～F7。将筛选出的7株菌用于黄酒酿造,其相关指标如表1所示。菌株F2酿造的黄酒各指标与其他组均有显著差异(P<0.05)。在酒精度、总酸、氨基酸态氮、感官得分方面,菌株F2与菌株F5均占有较大优势,其中,F2酿造的黄酒的氨基酸态氮和感官得分均最高。综合整体因素,选择菌株F2作为黄酒酿造用乳酸菌最为合适。

2.2 乳酸菌系统发育树的建立

将菌株F2的16S rDNA序列与NCBI基因数据进行同源性分析,分析得到的系统发育树如图1。该菌株与登录号为MT613628的植物乳杆菌处于同一分支,再根据同源性分析,该菌株与登录号为MT613628、NR_042254、MW165843的植物乳杆菌同源性为100%。根据上述结果可知,可确定该菌株为植物乳杆菌。

2.3 单因素试验

2.3.1 淀粉液化工艺控制点的选择

由图2可知,随着料水比的减小,米汁总糖和黄酒总糖含量均呈逐渐下降的趋势,这是由于原料稀释倍数逐渐增加的缘故。酒精度随料水比的减小先小幅度上升后呈下降的趋势,这可能是由于料水比太高时,醪液粘度大,水解不彻底,导致发酵不彻底。米汁总糖和黄酒酒精度随着α-淀粉酶的增加均随之上升,当酶量超过10.0 U/g后,两指标的变化不显著(P<0.05)。在液化时间为30～50 min范围内,随着时间的增加,淀粉酶与糯米的接触和反应较充分,产生的寡糖含量增加,黄酒酒精度也相应地上升；液化时间超过50 min后,两指标含量趋于平稳。综合经济因素,液化工艺中选定料水比为1∶2.5(g∶mL),α-淀粉酶添加量为7.5～10.0 U/g,液化时间为50 min。

2.3.2 淀粉糖化工艺控制点的选择

从图3可知,米汁总糖含量随糖化酶的增加先迅速升高,超过60 U/g后,米汁总糖含量增幅不显著(P<0.05)。酒精度随酶量的变化趋势与米汁总糖相近,黄酒总糖含量随酶量的增加在60 U/g前逐渐下降,60 U/g后无显著差异(P<0.05)。米汁总糖含量在糖化过程中随糖化时间的增加在3 h前逐渐升高,3 h后趋于稳定。这表明随着糖化时间的延长,酶与底物充分接触,还原糖含量增加。黄酒酒精度随糖化时间增加先迅速升高,3 h后无显著差异(P<0.05)。综上所述,选定60 U/g为最佳糖化酶添加量,3 h为最佳糖化时间。

2.3.3 发酵工艺的单因素试验

在黄酒发酵过程中,先向米汁中接种乳酸菌,再设定不同的酿酒酵母接种时间,研究其对黄酒指标的影响。由图4可知,黄酒总酸含量随酵母接种时间的延长在12 h前迅速增加,12 h时,总酸含量达到12.82 g/L。

酒精度随酵母接种时间的延长在12 h前迅速下降,12～36 h范围内,下降幅度变缓,36 h后,变化幅度不显著(P<0.05)。综上所述,酿酒酵母和植物乳杆菌同时接种最佳。在酿酒酵母和植物乳杆菌同时接种的情况下,随着酿酒酵母接种量的增加,黄酒的酒精度和总酸含量变化幅度均无显著差异(P<0.05)。因此,采取黄酒初始酿造工艺的酿酒酵母接种量。

由图4-c可知,黄酒总酸含量随着植物乳杆菌的增加而升高,当菌体超过19.2×105 CFU/mL后,总酸含量增幅不显著(P<0.05)。黄酒酒精度随着菌体的增加而逐渐下降,这可能是由于乳酸菌的增加,总酸也逐渐增加,酵母的生长代谢受到抑制,酒精度也随之下降[14]。根据黄酒国家标准中(GB/T 13662—2008)优质清爽型半干黄酒的总酸含量为2.5～7.0 g/L的规定,植物乳杆菌接种量在0.6×105～4.8×105 CFU/mL范围内最佳。

2.4 响应面试验及验证结果

以黄酒的酒精度(Y1)和总酸(Y2)为响应值,料水比、α-淀粉酶添加量、糖化酶添加量、乳酸菌接种量为响应因素,对黄酒的制备工艺进一步优化,结果如表2所示。对表2中的试验结果进行多元回归拟合后,得到相应的回归方程：

Y1=13.80+1.42A+0.05B+0.50C-0.09D+0.62AB+0.17AC+0.46AD-0.27BC+0.17BD+0.03CD-0.71A2-0.47B2-0.84C2+2.50×10-3D2；

Y2=3.84-0.59A+0.20B-0.25C+0.70D+0.03AB-0.10AC-0.08AD-0.46BC-0.01BD-0.06CD+0.32A2+0.04B2+ 0.07C2-0.28D2。

通过表3可知,2个模型Y1和Y2的P值都<0.000 1,表明2回归模型差异极显著。失拟误差在0.05水平上不显著(P = 0.261 0>0.05和P=0.106 2>0.05),表明试验结果与回归模型之间具有良好的拟合度。相关系数R2分别为0.942 4和0.961 9,表明该模型与实际试验的拟合度较好。F值越大,各因素对酒精度和总酸的影响越强。因此,4个因素对黄酒酒精度和总酸的影响次序分别为A>C>D>B和D>A>C>B。

通过Design-Expert V 8.0.6软件对黄酒的工艺条件进行优化分析后,得到最佳条件为：料水比为1∶2.0(g∶mL),α-淀粉酶添加量为12.5 U/g,糖化酶添加量为41.36 U/g,植物乳杆菌接种量为 2.4×105 CFU/mL,黄酒酒精度和总酸含量的预测值分别为14.13%和5.04 g/L。利用上述条件进行3组平行验证试验后,得到的黄酒酒精度和总酸的实际值分别为(13.96±0.18)%和(5.12±0.10)g/L,与预测值的相对误差分别为1.20%和1.59%,进一步说明本模型的拟合度较好。

采用优化工艺酿制的黄酒酒精度为13.96%,总酸为5.12 g/L,总糖为8.80 g/L,氨基酸态氮为0.32 g/L,非糖固形物为26.38 g/L。从表4可知,清爽型干黄酒的总高级醇和总酯分别为6 303.42 μg/L和967.04 μg/L,与黄酒1相比,总酯提高了15.35%,与黄酒2相比,总高级醇提高了57.73%。其中,癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、棕榈酸乙酯相比黄酒1和黄酒2较高,这主要是由于在发酵过程中,酸性物质在酿酒酵母中的乙酰转移酶等酶类作用下与乙醇发生酯化反应生成的。清爽型干黄酒的酒体清亮,口感清爽,柔净醇和,符合黄酒国标GB/T 13662—2018中清爽型干黄酒的要求。

3 结论

从黄酒发酵液中分离出7株乳酸菌,根据黄酒的理化指标和感官评价为依据,进一步筛选出最适黄酒酿造用乳酸菌菌株F2(植物乳杆菌)。以糯米为原料,采用液态法酿造黄酒,通过单因素和中心组合试验,获得最佳酿造工艺条件为：料水比为1∶2.0、α-淀粉酶添加量为12.5 U/g,液化50 min；中性蛋白酶添加量为1 050 U/g,酶解120 min；糖化酶添加量为41.36 U/g,糖化3 h；酿酒酵母和植物乳杆菌同时接种,接种量分别为1.2×107 CFU/mL 和2.4×105 CFU/mL。优化后的黄酒柔净醇和,清爽,无异味,符合黄酒国标中清爽型干黄酒的要求。

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Development of a novelbrewing technology for dry Huangjiu with light aroma production

FU Chunyan1,2,3,WU Dianhui1,2,3,XIE Guangfa4,LU Jian1,2,3*

1(Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education (Jiangnan University),Wuxi 214122,China) 2(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology (Jiangnan University),Wuxi 214122,China) 3(School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China) 4 (School of Biological and Environmental Engineering,Zhejiang Shuren University,Hangzhou 310015,China)

ABSTRACT In this study, a brewing technology of light-aroma style Huangjiu (Chinese rice wine) was developed through the strategy of separate hydrolysis and fermentation. During the brewing process, the raw materials were not soaked, and no wheat koji was added. Biological enzymes were applied to hydrolyze glutinous rice to obtain rice juice, which were then inoculated with yeast and lactic acid bacteria for synergistic fermentation. Firstly, seven lactic acid bacteria strains were isolated from the fermentation broth of Shaoxing Huangjiu. Based on the physical and chemical indicators and sensory evaluation of Huangjiu, L. plantarum F2 was considered as the optimal lactic acid bacteria strain for Huangjiu brewing. According to the single factor test and response surface test, the optimal conditions for Huangjiu brewing process was obtained: material-liquid ratio, 1∶2.0; the addition amount of α-amylase, 12.5 U/g, liquefaction at 95 ℃ for 50 min; the dosage of neutral protease, 1 050 U/g, enzymatic hydrolysis at 50 ℃ for 120 min; the amount of saccharification enzyme, 41.36 U/g, saccharification at 60 ℃ for 3 h. Finally, the total sugar of rice juice was 275.59 g/L. The fermentation was then synergistically proceeded by S. cerevisiae N85 and L. plantarum F2 with the inoculation amounts of 1.2×107 and 2.4×105 CFU/mL, respectively. Under this condition, the alcohol degree, total acid, total sugar, amino acid nitrogen, non-sugar solid, total higher alcohol and total ester contents of Huangjiu sample was 13.96% vol, 5.12 g/L, 8.80 g/L, 0.32 g/L, 26.38 g/L, 6 303.42 μg/L and 967.04 μg/L, respectively. The production of Huangjiu displayed pure body and refreshing taste, which met the requirements of refreshing dry Huangjiu in the national standard.

Key words light-aroma style Huangjiu; liquid fermentation; response surface methodology; lactic acid bacteria selection; process optimization

第一作者：硕士研究生(陆健教授为通讯作者，E-mail: jlu@jiangnan.edu.cn)

基金项目：国家自然科学基金青年基金项目(31701588)；浙江省公益技术研究计划项目(LGN20C200016)；高等学校学科创新引智计划(111计划)资助项目(111-2-06)；江苏高校优势学科建设工程资助项目

收稿日期：2021-01-04,改回日期：2021-02-02

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.026610

引用格式:付春艳,吴殿辉,谢广发,等.新型清爽型干黄酒的酿造工艺[J].食品与发酵工业,2021,47(11):165-170.FU Chunyan,WU Dianhui,XIE Guangfa,et al.Development of a novelbrewing technology for dry Huangjiu with light aroma production[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(11):165-170.