梁平柚是我国三大名柚之一,与沙田柚、文旦柚齐名。其果肉淡黄色,酸甜可口,营养丰富。每100 mL梁平柚果汁中含蔗糖6.4 g、还原糖3.4 g、总酸0.21 mg、Vc111.7 mg和可溶性固形物14.1%[1]。柚子具有健脾胃、润肺、补血、清肠、利便等功效,是具有食疗效果的水果[2-3]。目前柚子主要用于鲜食,而一些次果被当作垃圾处理。若将次果加工成柚子果酒,则可促进柚类产业的多元化发展。

柚子果酒富含丰富的营养成分,较高地保留了原有的维生素、类黄酮等功效成分,更利于人体吸收。但目前影响柚子果酒品质的重要指标为酸味和风味,在一定程度上影响了消费者对产品的喜好程度,改善柚子果酒口感和风味已成为亟待解决的问题[2]。目前改善果酒酸味多采用化学降酸[3]、物理降酸[4-5]和生物降酸[6-7]。化学降酸法主要有中和法(向果酒体系加入碱或碱式盐)、离子交换树脂等,但化学降酸很容易导致酒体不稳定或酒体风味损失[3]。物理降酸又称低温冷冻降酸,主要原理是随着温度的降低,酒体中的酒石酸及其盐类结晶沉淀。但该法仅能降低酒石酸盐的含量且降酸幅度较小,不适于其他有机酸的去除,且应用较有限,常用于酸度较高的葡萄酒生产[8]。生物降酸是利用微生物的生长代谢分解有机酸,从而达到降酸的目的,同时还能改进果酒体系的风味,成为现代降酸和提升风味的主要研究发展方向[9]。

目前,主要是添加酒酒球菌进行混菌发酵来降低酸度和提升风味。但WANG等[6]研究发现,添加酒酒球菌在果酒发酵过程中会产生大量的生物胺,引起安全问题。植物乳杆菌具有优秀的酶学特征和短暂的滞后期,可替代酒酒球菌,且能降低因发酵引起的生物胺含量增加的风险[6,10]。在含有大量柠檬酸的果实中如柠檬、柑橘、山楂等,植物乳杆菌可在发酵果酒中代谢柠檬酸等非糖物质,能显著改善口感[11,13]。本研究以梁平柚次果为原料,研究植物乳杆菌不同接种量对梁平柚果酒理化指标、风味和口感的影响,最终选出合适的接种量,以期酿造出低酸高品质的柚子果酒。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柚子(梁平柚),西南大学柑桔研究所资源圃；白砂糖,市售；果酒酵母SY,安琪酵母公司；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum CICC 20265),中国工业微生物菌种保藏管理中心；酵母浸粉、蛋白胨、纳他霉素,上海麦克林生化科技有限公司；MRS培养基,大连美仑生物技术有限公司；L-苹果酸、柠檬酸、L-酒石酸、L-乳酸、琥珀酸、草酸标准品,北京索莱宝科技有限公司；乙酸标准品,德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1F洁净工作台,苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；HZQ-F160全温振荡培养箱,苏州市培英实验设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌器,上海博迅实业有限公司医疗设备厂；Ultimate3000高效液相色谱仪,美国戴安公司；气相色谱-质谱联用仪(Agilent 7890 GC-5977 MSD),美国Agilent公司；固相微萃取装置(85 μm,CAR/PDMS),美国Supelco公司；阿贝折光仪,上海精密科学仪器有限公司。

1.3 试验设计

1.3.1 菌种活化

称取50 mg果酒干酵母SY于250 mL三角瓶中,加入100 mL质量分数2%灭菌葡萄糖水,于35 ℃恒温培养箱中预热20 min,再置于30 ℃恒温振荡摇床于200 r/min下培养2 h,即得种子液。取植物乳杆菌单菌落接种到液体MRS培养基,置于37 ℃恒温培养箱活化3代后,培养至对数中后期备用,约6 lgCFU/mL。

1.3.2 柚子果酒生产工艺流程

发酵在250 mL摇瓶中密封进行,每瓶装有200 mL 经巴氏灭菌并过滤的柚子汁(糖度调至21°Brix),接种2%(体积分数)的果酒酵母SY,再分别接种0%、1%、2%、4%、6%、8%(体积分数,下同)的植物乳杆菌,28 ℃静置发酵15 d,每组处理重复3次。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 柚子果酒基本理化指标测定

酒精度采用酒精计法,可滴定酸(以柠檬酸计)采用直接滴定法。以上检测方法均参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法进行。

1.4.2 柚子果酒发酵主要产物测定

1.4.2.1 柚子果酒有机酸测定

有机酸含量测定参考李曦等[14]的方法稍作修改,发酵液8 000 r/min离心10 min,取1 mL上清液加入超纯水稀释5倍,再用0.45 μm水相滤膜过滤样品进行HPLC分析。

测定条件：色谱柱为Venusil MP C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱温30 ℃,进样量20 μL,流速1 mL/min,波长220 nm,流动相为1 g/L磷酸。各有机酸标品回归方程和相关系数见表1。

1.4.2.2 柚子果酒挥发性物质检测

取5 mL待测柚子果酒于18 mL顶空瓶中,加入1.5 g NaCl,10 μL 81.9 mg/L的2-辛醇(内标物),充分振荡溶解。40 ℃平衡20 min后插入SPME萃取头萃取30 min,样品在平衡和萃取过程中用磁力搅拌器以240 r/min轻轻涡旋,于250 ℃上机解析5 min,进行GC-MS分析。

气相色谱条件：所用分析柱为TG-WAXMS(30 m×0.25 μm,0.25 mm),起始温度40 ℃,保持3 min；再以6 ℃/min升至100 ℃；接着以10 ℃/min升至210 ℃,保持7 min；进样口温度250 ℃,不分流进样；载气He流速1.0 mL/min。质谱条件：EI离子源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；质量扫描范围m/z 40～400。

1.4.3 感官评价

由8名课题组训练有素的小组成员(4名男性和4名女性)使用描述性分析来描述植物乳杆菌不同接种量发酵柚子果酒的感觉特征。参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》及YU等[12]的方法,将20 mL 20 ℃的梁平柚果酒试样倒入感官杯中,用3个随机数编码,并以随机顺序呈现。小组成员将感官属性定义为颜色、澄清度、梁平柚柚香、白兰地酒香、酸度、甜味、涩味、苦味。梁平柚果酒用10分法非结构化标度进行分析,其中0分表示“不可感知”,10分表示“强烈可感知”,结果用平均值表示。

1.5 数据处理

所有试验平行3次,试验数据以平均值±标准差表示,用 Origin 2017 软件进行作图,通过SPSS 22.0统计软件进行数据统计分析。

2 结果与讨论

2.1 植物乳杆菌接种量对果酒理化指标的影响

2.1.1 植物乳杆菌接种量对柚子果酒酒精度的影响

植物乳杆菌接种量对酒精度的影响如图1所示。随着植物乳杆菌接种量的增加,柚子果酒酒精度先增加后降低,当接种量达到2%时柚子果酒酒精度达到最大,为12.4%vol。同时,观察得到酵母菌数量与酒精度呈现正相关,当接种量为2%时,酵母菌菌落数最大为8.49 lg CFU/mL。植物乳杆菌数量则先增加后降低再升高,研究结果与CHEN等[15]的一致,酵母和乳杆菌间存在一个共生体系,酵母菌为乳杆菌的生长提供了许多营养因子,如氨基酸、维生素和丙酮酸盐等,乳杆菌的代谢产物则为酵母菌提供能量。但若乳杆菌数量过多,其菌体繁殖迅速、代谢过于旺盛,则将抑制酵母菌的正常生长和代谢,进而影响酒精度[15]。

相反,若乳杆菌数量较少或是不足,大量酵母菌将会影响乳酸菌的正常生长和代谢,乳杆菌生长缓慢,导致整体菌体活力降低,对于乳酸的形成不利[18]。植物乳杆菌接种量为2%时,酵母菌和植物乳杆菌处于协同状态,且酒精度最高(图1)。

2.1.2 植物乳杆菌接种量对柚子果酒还原糖的影响

如图2所示,随植物乳杆菌接种量的增加,还原糖含量先降低后增加,含量在5.62～8.34 g/L。主要是因为随植物乳杆菌接种量的增加,其先和酵母菌呈现协同作用,后因植物乳杆菌代谢过于旺盛,抑制了酵母生长,从而使还原糖消耗减少[15]。因此在植物乳杆菌接种量为2%时,柚子果酒还原糖含量最低,糖分利用完全,酒精转化能力好。

2.1.3 植物乳杆菌接种量对柚子果酒总酸的影响

果酒中的总可滴定酸和有机酸是导致果酒酸味的主要原因。因此,发酵过程应确保总酸及各有机酸适当,使果酒酸度适中、口感柔和[17]。植物乳杆菌不同接种量对柚子果酒总酸的影响如图3所示,随植物乳杆菌接种量的增加,柚子果酒总酸先降低后增加。研究表明果酒酸度较低时,酒体柔和、圆润；较高时,酒体粗糙、涩口[18]。当植物乳杆菌接种量为2%时,柚子果酒总酸含量为2.34 g/L,显著低于其他接种量酸度(P<0.05),能有效增加酒的爽口性与协调性。

2.2 植物乳杆菌接种量对柚子果酒发酵主产物的影响

2.2.1 植物乳杆菌接种量对柚子果酒有机酸的影响

在果酒中,其基本品质,如感官、抗氧化能力、抗菌活性、pH值和色泽,都取决于有机酸的数量和类型[17]。研究表明,酒石酸具有类似于柑橘的味道,苹果酸有金属和青苹果的味道,乳酸具有酸辣味,柠檬酸为清新宜人的柑橘味,琥珀酸具有酸、咸、苦的味道,各有机酸赋予果酒不同的感官特性[19]。植物乳杆菌不同接种量对柚子果酒有机酸含量影响如表2所示,7种有机酸中,苹果酸、乳酸、柠檬酸和琥珀酸含量变化较为明显。随着植物乳杆菌接种量的增加苹果酸含量从0.93 g/L降低到0.542 g/L；乳酸含量从0.213 g/L增至6.187 g/L；柠檬酸含量由4.562 g/L下降至0.713 g/L；琥珀酸含量从1.053 g/L增加至1.762 g/L。可推测虽然柚子果酒中苹果酸含量较少,但植物乳杆菌仍然进行了苹果酸-乳酸发酵,将苹果酸转化为乳酸和二氧化碳[20]。而柚子果酒中有机酸主要以柠檬酸为主,植物乳杆菌主要进行了柠檬酸代谢,通过2-羟基羧酸盐转运蛋白运输柠檬酸盐,柠檬酸盐在柠檬酸裂解酶复合物催化下转化为草酰乙酸盐,再经草酰乙酸脱羧酶脱羧产生丙酮酸,最后生成乳酸及芳香化合物[11,21-22]。琥珀酸含量的增加则被认为是乳酸菌通过其他代谢途径从乳酸或柠檬酸代谢生成的[23]。

其他有机酸随接种量的增加变化并不明显,总有机酸量随接种量增加呈现下降后增加趋势。当植物乳杆菌接种量为1%时有机酸总含量最低，有为6.341 g/L,接种量为2%时次之，为6.775 g/L,但两者无显著性差异。同时研究表明适当的有机酸可平衡酒中的苦涩味,其含量过高则会导致果酒口感酸涩[2]。因此在植物乳杆菌接种量为1%和2%时,整体酸度较低,理论口感较好。

2.2.2 植物乳杆菌接种量对柚子果酒风味影响

经GC-MS分析后,植物乳杆菌接种量对梁平柚果酒风味影响如表3所示。不同接种量发酵果酒所含挥发性物质大致相同,共检测出34种香气物质,醇类10种、酯类13种、酸类3种、萜烯类5种、醛酮类2种以及其他物质1种。其中醇类种类占总挥发性物质的29.4%,酯类占总挥发性物质的38.2%,对酒体风味起到主要影响作用。

2.2.2.1 醇类物质分析比较

醇类主要是发酵过程中酵母等微生物作用于果胶质和氨基酸等转化产生[24]。6种酒样中共有的醇类为异丁醇、异戊醇、己醇、叶醇、芳樟醇、香芹醇和苯乙醇。异戊醇赋予酒样果香和花香[18],其含量在酒样中最高且差异较大,随植物乳杆菌接种量增加呈现先增加后降低的趋势,当接种量为2%时,其含量最大为787.13 μg/L。苯乙醇具有独特的玫瑰香和月季花香,且具有一定杀菌能力[25],单一酵母发酵时其含量最大为208.42 μg/L,植物乳杆菌接种量为2%时次之,为191.62 μg/L,接种量为8%时,含量最低为145.29 μg/L。己醇给酒样提供了青香和果香味[25],随接种量的增加己醇含量先增加后降低,当接种量为2%时,其含量最大为146.69 μg/L。

当植物乳杆菌接种量为2%和4%时检测出醇类物质最多,为10种。相较于单一酿酒酵母发酵多出了2-壬醇和2,3-丁二醇,2-壬醇具有青香味使得果酒风味更为丰富[26],2,3-丁二醇主要由于植物乳杆菌发酵积累[6]。从总醇含量上来看,接种量为2%时总醇含量最大,达到1 599.73 μg/L,显著高于其他5种接种量(P<0.05),醇类风味更加浓郁,使酒体更加醇厚。

2.2.2.2 酯类物质分析比较

酯类化合物是构成果酒香气的重要物质,酯类具有花、果香,对酒的主体香型及风格具有重要的影响[27]。柚子果酒中均检测出辛酸乙酯,且含量最高。辛酸乙酯具有白兰地酒香味,主要应用于调味品、香料制作等[28]。随植物乳杆菌接种量的增加,辛酸乙酯含量先增加后降低,在接种量为2%时,辛酸乙酯含量最高为2 539.83 μg/L。接种量为1%时次之,为2 319.24 μg/L。主要的酯类化合物还有乙酸乙酯(水果味)、乙酸异戊酯(果香、香蕉香)、己酸乙酯(香蕉、青苹果味)、乙酸己酯(苹果、梨等水果味)、葵酸乙酯(水果、脂肪味)[28-29]。

6种柚子果酒中,总酯含量随接种量的增加先增加后降低,当接种量为2%时,酯类种类最多,为12种,且总酯含量显著高于其他组,为4 921.38 μg/L(P<0.05),酒体整体风味浓香,大大提高和丰富了梁平柚果酒的风味。

2.2.2.3 酸类物质分析比较

酸类物质在酵母发酵过程中形成,由醛基支链氧化形成酸[6]。酸类物质影响着果酒的口感和色泽,当酸类物质含量低于阈值时,对酒的感官有积极贡献,可为果酒带来新鲜感和平衡果香。高于阈值时,则会给香气带来负面影响[30]。在6种柚子果酒中,检测出酸类物质有乙酸、己酸和辛酸。乙酸含量随接种量的增加,先增加后降低,接种量为1%时,含量最高为98.55 μg/L。己酸有腐烂银杏肉质外种皮难闻的气味,对柚子酒样风味有不良影响。但在梁平柚果酒中,其含量低于阈值。辛酸在低浓度时散发出类似奶酪和奶油的风味,在高浓度时具有腐败味和刺激味[26]。其随接种量的增加逐渐降低,单一酵母发酵含量较高,达183.94 μg/L。总酸含量也随接种量的增加随之降低,可推测植物乳杆菌在酒样中分泌脂肪酶,进而改变柚子果酒中脂肪酸的含量[6]。综上,添加植物乳杆菌相对于纯发酵能有效降低梁平柚果酒中挥发性酸含量。

2.2.2.4 风味物质分析比较结果

从物质种类来看,当植物乳杆菌接种量为2%时,其风味物质最多,达到31种。且总醇和总酯含量最高,香型丰富。异戊醇(果香)、辛酸乙酯(白兰地酒香)、葵酸乙酯(葡萄的水果香气)、乙酸异戊酯(香蕉、青苹果味)构成梁平柚果酒主要香味,辅以己醇(青香)、苯乙醇(玫瑰香)、己酸乙酯(菠萝香)构成梁平柚果酒的特有香味。同时测定不同接种量果酒中的OAV，34种风味物质中，OAV>1的有8种，如表4所示。当添加2%的植物乳杆菌时，OAV均高于其他接种量。因此，当植物乳杆菌接种量为 2%时， 梁平柚果酒香气成分复杂，赋予了梁平柚果酒优雅和谐的香味。

2.3 植物乳杆菌接种量对柚子果酒感官品质的影响

针对视觉、嗅觉、味觉方面的刺激对植物乳杆菌混菌发酵梁平柚果酒进行感官评价,如图4所示。从外观分析,酒样颜色及透明度随植物乳杆菌接种量的增加评分逐渐降低,这可能与植物乳杆菌在酒样中细胞裂解有关,但各酒样间差异不显著。从香气角度分析,随接种量的增加,柚香和白兰地酒香评分先增加后降低,接种量为2%时评分最高,这与辛酸乙酯和异戊醇浓度有关。从味觉分析,酸度和甜度评分均随接种量的增加先降低后增加,这与理化指标测得有机酸和还原糖结果有关,当接种量为2%时,酸度和甜度评分均最低,口感最优。苦味评分则随接种量的增加逐渐降低。总体而言,感官评价结果与梁平柚果酒理化指标及挥发性化合物含量结果基本一致。当接种量为2%时各指标评分最优,同时相较于单一酵母发酵显著提升了果酒的柚香和白兰地酒香,降低了酸度、甜度和苦味。

3 结论

本试验通过研究植物乳杆菌接种量对梁平柚果酒酒精度、还原糖、总酸、有机酸以及风味的影响,辅以感官评价,全方面研究及评价了不同接种量对梁平柚果酒的影响,最终确定植物乳杆菌接种量为2%时,酿造的柚子果酒最优。相较于单一酿酒酵母发酵,添加2%的植物乳杆菌将果酒酒精度从11.26%vol升高至12.4%vol,还原糖从6.63 g/L降低至5.62 g/L,发酵更加充分。总酸从2.93 g/L降低至2.34 g/L,酸度显著降低。进一步分析有机酸含量,苹果酸从0.93 g/L降低至0.669 g/L,柠檬酸从4.562 g/L降低至1.696 g/L,乳酸从0.213 g/L升高至2.666 g/L,琥珀酸从1.053 g/L增长至1.337 g/L。有机酸总含量低于单一酿酒酵母发酵,平衡了有机酸含量并提高了口感。经GC-MS分析,检测出挥发性物质34种,比单一发酵多7种,且醇类、酯类主体香气含量均显著高于单一发酵。梁平柚果酒主要香气成分为辛酸乙酯、己酸异戊酯、异戊醇、己醇等,各香气成分间相互协调,赋予了果酒独特风味。接种量为2%时,梁平柚果酒酒体浅黄有光泽,酒体丰满醇厚,酸度适中,具有独特的梁平柚柚香和白兰地酒香。综上分析,2%的植物乳杆菌混菌发酵柚子果酒能显著降低果酒酸度,并能有效提升果酒风味。

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Effects of Lactobacillus plantarum mixed fermentation on the physicochemical properties and flavor of Liangping pomelo wine

YI Xin1,TAN Anqun1,OUYANG Zhu1,WANG Jinfan2,ZHOU Qi1,HUANG Linhua1,WANG Hua1*

1(Citrus Research Institute,Southwest University;Citrus Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Chongqing 400712,China) 2(Chengdu Dujiangyan ChunSheng Traditional Chinese Medicine Beverage Co.Ltd,Dujiangyan 611830,China)

ABSTRACT Lactobacillus plantarum and Saccharomyces cerevisiae were used to ferment wine using low-grade Liangping pomelo as raw material. The effect of different inoculation amounts of L. plantarum on the quality of Liangping pomelo wine was ananlyzed by determining alcohol content, reducing sugar, total acid and organic acid. Headspace solid-phase microextraction combined with gas-phase-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS) was used to determine the volatile aroma of wine. Based on the above indicators and sensory evaluation, the most suitable amount of L. plantarum was selected. Compared with the single fermentation of S. cerevisiae, the addition of 2% L. plantarum and S. cerevisiae significantly increased alcohol content, reduced reducing sugars and total acid content, balanced organic acid content, and made the taste better; 31 volatile substances were detected by GC-MS in wine with 2% L. plantarum and S. cerevisiae, which was seven more than that in the single fermentation. The content of aroma compounds such as higher alcohols and esters increased. The odor activity value of isobutanol, isoamyl alcohol, linalool, isoamyl acetate and ethyl caprylate were larger than 1, which were higher than single S. cerevisiae fermentation; sensory evaluation showed that adding 2% L. plantarum enhanced the fruity aroma and brandy aroma of wine, reduced sourness, sweetness and bitterness, and improved complexity and layering of wine aroma. Comprehensive analysis showed that the addition of 2% L. plantarum significantly improved the taste and aroma quality of Liangping pomelo wine.

Key words Liangping pomelo; Lactobacillus plantarum; mixed fermentation; pomelo wine; quality analysis

第一作者：易鑫硕士研究生和谈安群农艺师为共同第一作者(王华研究员为通讯作者，E-mail：wanghua@cric.cn)

基金项目：国家重点研发计划项目(2017YFD0400701-3)

收稿日期：2020-10-19,改回日期：2020-12-10

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.025927

引用格式:易鑫,谈安群,欧阳祝,等.植物乳杆菌混菌发酵对梁平柚果酒理化性质及风味影响[J].食品与发酵工业,2021,47(11):180-187.YI Xin,TAN Anqun,OUYANG Zhu,et al.Effects of Lactobacillus plantarum mixed fermentation on the physicochemical properties and flavor of Liangping pomelo wine[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(11):180-187.