纳豆激酶(nattokianse，NK)是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilis natto)产生的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶[1]，因可用于治疗血栓、高血压、阿尔茨海默氏病和玻璃体视网膜等领域而被广泛关注[2-9]。

食物中主要含有4种嘌呤，分别为腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤，而人体痛风是由于长期嘌呤代谢障碍、血尿酸升高引起组织损伤的一类疾病[10]。然而，多种NK冻干粉产品中均具有较高含量的嘌呤类物质，不利于痛风患者的食用。目前，对NK研究主要集中在具有高酶活性微生物的筛选[11]、新型酶的纯化以及特性研究[12-13]。因此，筛选出一种具有高NK酶活性、低嘌呤含量的发酵菌株，并在此基础上对其液体发酵条件进行优化，可为进一步开发高NK酶活性、低嘌呤产量的枯草芽孢杆菌发酵产品奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大酱,四川大凉山农户。

1.2 培养基

酪蛋白平板培养基(g/L)：酪蛋白胨20,葡萄糖5,K2HPO4·3H2O 1,KH2PO4 0.5,MgSO4·7H2O 0.1,琼脂15,pH 7.0,121 ℃灭菌15 min。

种子培养基、LB 培养基(g/L)：蛋白胨10,酵母浸粉5,NaCl 10(固体培养基加15 g/L 琼脂),121 ℃灭菌15 min。

初始液体发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨20,乳糖20,Na2HPO4·12H2O 5,NaH2PO4·2H2O 1,CaCl2 0.2,MgSO4·7H2O 0.5,pH 7.0,121 ℃灭菌15 min。

1.3 实验方法

1.3.1 枯草芽孢杆菌的筛选

产NK菌株筛选：取1 g大酱,放入装有9 mL 无菌生理盐水的试管中振荡5 min,沸水浴加热10 min,10 000 r/min离心5 min,取上清液进行梯度稀释,以划线分离法将上清液涂布于酪蛋白平板上,放入恒温培养箱中,37 ℃培养24 h观察平板透明圈直径大小并进行测量,选取透明圈直径大者转接LB斜面培养。

摇瓶筛选：取初筛所得菌株接种于LB 培养基中,37 ℃,180 r/min 恒温培养12 h,接入液体种子培养基,37 ℃,180 r/min 恒温培养12 h。按2%(体积分数)的接种量将种子液接种至液体发酵培养基中,37 ℃,180 r/min 恒温培养24 h,测定发酵液NK酶活力及嘌呤含量。

1.3.2 NK酶活力及嘌呤含量测定方法

1.3.2.1 NK酶活力测定

采用酪蛋白消化法[14]测定发酵液中NK酶活力。

粗酶液制备：将发酵获得的菌液于4 ℃、10 000 r/min离心10 min,取上清液经过0.22 μm膜过滤即为粗酶液。

酶反应：取1 mL粗酶液,加入2 mL 0.5%酪蛋白,混合均匀,40 ℃ 孵育10 min；加入3 mL 10% 三氯乙酸终止反应,8 000 r/min离心5 min。设立对照组,对照组为加入酶液前加入3 mL 三氯乙酸。

显色反应：取1 mL酶反应液,加入5 mL 0.55 mol/L NaCO3溶液和1 mL福林酚溶液,迅速混匀,40 ℃ 恒温水浴中显色20 min,测定吸光度(A680)。

酶活力定义：1 min内形成1 μg酪氨酸所需的NK剂量。

1.3.2.2 嘌呤含量测定

采用高效液相色谱法[15]对发酵液中的嘌呤含量进行检测。

前处理：取2 mL发酵上清液于25 mL具塞管中,加入2 mL 3 mol/L硫酸溶液,加塞后立即置于沸水浴水解10 min,冰浴冷却,调pH至2.0～8.0,定容至10 mL。再以0.22 μm针式过滤头过滤,即得待测样品,备用。

色谱条件：色谱柱：ZORBAX NH2(4.6 mm×250 mm,5.0 μm)；流动相：A相,10 mmol/L乙酸铵,B相,乙腈；流速：0.8 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL；紫外检测波长：254 nm。

1.3.3 菌种鉴定

通过16S rRNA序列对菌株进行鉴定。采用TIANamp细菌DNA试剂盒提取总DNA。使用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增。扩增程序如下：95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,退火温度55 ℃,复性30 s,72 ℃延伸5 min,进行34个循环。PCR产物经生工生物工程(上海)股份有限公司测序,测序结果经BLAST(NCBI)比对分析。

1.3.4 单因素试验

(1)培养基碳源优化：以初始培养基为基础,分别使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉和甘油为碳源,测定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(2)培养基氮源优化：在现有优化基础上,分别使用胰蛋白胨、酪蛋白胨、大豆蛋白胨和蛋白胨,测定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(3)培养基接种量优化：以初始培养基为基础,将种子液以不同接种量(体积分数1%、2%、3%、4%、5%)接入发酵培养基中,测定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(4)培养基初始pH优化：在现有优化基础上,改变发酵培养基的初始pH(5、6、7、8、9),测定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(5)培养温度优化：在现有优化基础上,调整发酵温度(31、33、35、37、39 ℃),测定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

(6)培养时间优化：在现有优化基础上,调整发酵时间(24、36、48、60、72 h),测定粗酶液中NK酶活力和嘌呤含量。

1.3.5 Plackett-Burman试验设计

在单因素试验的基础上,利用Design-expert软件进行n=12的 Plackett-Burman试验设计,其各因素与水平如表1所示。

1.3.6 最陡爬坡试验

爬坡试验依据 Plackett-Burman 试验结果确定各显著影响因素及正负效应,设定步长及变化方向,以快速逼近最佳区域。

1.3.7 Box-Behnken中心组合试验

利用最陡爬坡试验得出中心点,设计3因素3水平优化试验,采用Box-Behnken中心组合试验进行实验条件优化。试验设计的各因素与水平如表2所示。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选及鉴定

酪蛋白平板筛选得到3株产透明圈菌株,摇瓶发酵分别测定其NK酶活力和嘌呤含量,SH21酶活力最高,嘌呤含量最低(表3)。

对SH21进行PCR扩增,产生了一段1 378 bp的DNA片段。经BLAST比对,发现与枯草芽孢杆菌(Genbank：MK860024)和枯草芽孢杆菌(Genbank：KP717559)的16S rDNA基因序列具有100%的同源性,结合其形态和生理特性,SH21被鉴定为枯草芽孢杆菌(Genbank：MN756647)。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 最佳碳源的确定

不同碳源对NK酶活力及嘌呤含量的影响如图1-a所示。当碳源为葡萄糖时酶活力最高,为165.77 U/mL,嘌呤含量为91.54 mg/L；而碳源为蔗糖时嘌呤含量仅为43.01 mg/L,酶活力为134.04 U/mL,综合考虑选择蔗糖作为发酵培养基的碳源。

2.2.2 最佳氮源的确定

对于氮源而言(图1-b),酶活力最高为酪蛋白胨，其值达到160.07 U/mL。其主要原因在于前期筛菌时采用的氮源为酪蛋白胨,因此对菌株具有一定的驯化作用[16],故以酪蛋白胨为氮源时酶活力较为显著。而嘌呤含量虽以胰蛋白胨为氮源时嘌呤含量最低,但其相差不是很大,在21.78～39.33 mg/L之间,综合比较选取酪蛋白胨作为最佳氮源。

2.2.3 最佳pH的确定

pH对酶活力和嘌呤影响如图1-c所示。随着pH的升高,酶活力先上升后下降,而嘌呤先下降然后上升后下降。当pH为7时,酶活力最高,为119.19 U/mL,而嘌呤含量虽然以pH为9时其嘌呤含量最低,但其差异不显著,同时考虑到NK在中性条件下酶活力较为稳定[17],且该 pH 条件下适宜枯草芽孢杆菌的生长,故pH取7。

2.2.4 最佳接种量的确定

接种量在1%～3% 时,酶活力逐渐增加,嘌呤含量下降。当接种量大于3%,酶活性降低,嘌呤含量增加(图1-d)。接种量在1%～3% 时,随着接种量的增加,菌体繁殖速度加快,酶活也相应增加,当接种量大于3% 后,由于营养物质匮乏导致其生命活力逐渐降低,酶活力也相应降低[16]。故接种量设为3%。

2.2.5 最佳发酵温度的确定

温度对酶活力和嘌呤影响如图1-e所示。随着温度的提高,酶活力逐渐增加,在37 ℃时酶活力达到最大值(128.96 U/mL),此时嘌呤含量为45.77 mg/L,随后酶活力开始下降,嘌呤含量开始增加。故发酵温度设为37 ℃。

2.2.6 最佳发酵时间的确定

不同发酵时间对NK酶活力及嘌呤含量的影响如图1-f所示。在24～48 h时,酶活力逐渐增加,嘌呤含量逐渐下降。之后,随着时间增加,酶活力降低,嘌呤含量增加,推测发酵时间过长,菌体生长进入衰亡期,甚至产生自溶,使得大量DNA释放,导致酶活力下降,进而产生更多的嘌呤类物质[18]。因此最佳发酵时间为48 h。

2.3 Plackett-Burman试验结果与分析

试验结果见表4。由表5方差分析结果可知,酶活力模型的P值 0.001<0.05,模型选择正确。接种量、pH、发酵温度的P值均小于0.05,对NK酶活力影响显著,发酵时间对酶活力影响不显著；嘌呤模型的P值为0.010 6<0.05,模型选择正确,各变量 P 值均小于0.05,对嘌呤影响均显著。综合考虑选择接种量、pH和发酵温度进行下一步的优化。

2.4 最陡爬坡试验

以接种量、pH和发酵温度为自变量,各因素试验设计如表6所示。接种量2.5%,pH 6.5,发酵温度38 ℃时,酶活力最高,嘌呤含量最低。因此,以第4组试验水平作为 Box-Behnken中心点,进行优化试验。

2.5 响应面试验

2.5.1 试验设计及结果分析

以接种量、pH、发酵温度为自变量,测定NK酶活力和嘌呤。试验结果如表7所示。利用 Design-expert对试验结果进行分析,得到2个回归方程：

方差分析结果如表8和表9所示。所选模型P值均小于0.01,差异极显著,说明回归方程模型具有高度显著性；失拟项 P 值均大于0.05,差异不显著,说明模型对试验拟合程度良好；相关系数R2均在0.9以上,可以预测实验结果。

2.5.2 模型预测与验证实验

利用Design-expert软件,分析3种显著因素(接种量、pH、温度)的响应面和等高线。预测得到发酵培养基最佳参数为接种量3%,pH 6.0,温度37.93 ℃,理论最高酶活力可达到202.53 U/mL,嘌呤含量最低为50.068 mg/L。考虑实际限制,将发酵温度调整为38 ℃。为了验证响应面分析的可靠性,利用上述最佳参数进行3次平行验证,实际测定酶活力为204.52 U/mL,嘌呤含量为51.27 mg/L,接近模型预测。

3 结论

通过两步法从大酱中筛选得到1株低嘌呤、高酶活力的枯草芽孢杆菌SH21,在单因素试验的基础上,利用 Plackett-Burman设计筛选得到pH、接种量和发酵温度这3个显著因素,利用 Box-Behnken 中心组合设计确定最优发酵条件,确定了优化后的发酵培养基为20 g/L蔗糖、20 g/L酪蛋白胨、5 g/L Na2HPO4·12H2O、1 g/L NaH2PO4·2H2O、0.2 g/L CaCl2、0.5 g/L MgSO4·7H2O；优化后的发酵条件为pH 6.0,接种量3%,发酵温度38 ℃,发酵时间 48 h,在此条件下,NK酶活力提高了1.22倍,嘌呤含量降低了32%,本研究提高了产酶水平并降低了生产成本,为开发高NK酶活性、低嘌呤产量的枯草芽孢杆菌发酵产品奠定研究基础。

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Isolation and optimization of Bacillus subtilis SH21 for low purine and high nattokinase activity

PANG Yuanxiang,XIE Yuanhong,JIN Junhua,LIU Hui,ZHANG Hongxing*

(Food Science and Engineering College,Beijing University of Agriculture,Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,Beijing Key Laboratory of Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide Residues in Agricultural Products,Beijing 102206,China)

ABSTRACT A strain with high nattokinase activity was screened from naturally fermented pastes with casein plate selecting and shaking culturing, the strain SH21 was identified as Bacillus subtilis by 16S rRNA gene sequencing. Using nattokinase activity (NK) and purine as indicators, the liquid fermentation conditions of Bacillus subtilis SH21 were optimized by single factor experiments and response surface methodology. The single factor tests were designed to investigate the influence of carbon sources, nitrogen sources, pH, inoculation, fermentation temperature and fermentation time on nattokinase activity and purine content. Then the Plackett-Burman test was designed, and three significant factors, pH, inoculation and fermentation temperature were obtained. Finally, the Box-Behnken design was used and the response surface analysis was performed. The optimized fermentation condition was pH 6.0, with the inoculation amount 3%, and fermentation temperature 38℃. The enzyme activity increased from 166.99 U/mL to 204.52 U/mL, which was improved by 1.22 folds. While the purine content decreased from 75.4 mg/L to 51.27 mg/L, reduced by 32% under the optimized condition. This study lays the foundation for the further development of B. subtilis fermentation products with high nattokinase activity and low purine production.

Key words Bacillus subtilis; nattokinase; purine; fermentation optimization; response surface methodology

第一作者：硕士研究生(张红星教授为通讯作者，E-mail：hxzhang511@163.com)

收稿日期：2020-10-29,改回日期：2020-11-17

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.026039

引用格式:庞远祥,谢远红,金君华,等.低嘌呤、高纳豆激酶活性枯草芽孢杆菌SH21筛选及发酵条件优化[J].食品与发酵工业,2021,47(11):194-199.PANG Yuanxiang,XIE Yuanhong,JIN Junhua,et al.Isolation and optimization of Bacillus subtilis SH21 for low purine and high nattokinase activity[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(11):194-199.