血脂异常是动脉粥样硬化乃至心脑血管疾病的危险因素之一,膳食是影响血脂水平的重要因素。海产品含有丰富的蛋白质和人体必须的矿物质等营养成分,经常食用可预防心脑血管疾病[1]。海产品所含的长链不饱和脂肪酸、多糖可以调节血脂水平,改善代谢综合征,但其含有的矿质元素与血脂水平的关系较少被关注。矿质元素(包括钾、钙、钠、镁等常量元素和锰、铁、铜、锌等微量元素)与人体健康密切相关,其缺乏、不足或过量都会引起不同程度的生理异常或疾病[2]。研究报道,钙、镁、锰、铁、铜、锌、钒、铬、硒以及锌/铜比值与高血脂及动脉粥样硬化密切相关[3]。因此本文拟探究有降脂作用的海产品中的矿质元素(钙、镁、锰、铁、铜、锌、钒、铬、硒以及锌/铜比值)与其降血脂功效的相关性。
以8种常食用的有降血脂功效的海产品(紫菜[4]、海带[5]、浒苔[6]、海参[7]、鲍鱼[8]、牡蛎[9]、贻贝[10]、星虫[11])为研究对象,选择与降血脂活性有关的矿质元素(钙、镁、锰、铁、铜、锌、钒、铬、硒)[3],用电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)[12]测定这8种海产品中9种矿质元素含量,并用主成分分析和聚类分析[13]对这些矿质元素与海产品降脂效果的相关性进行讨论,以期为这些海产品的研究与开发应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
7800电感耦合等离子体质谱仪,美国Agilent公司；Multiwave PRO微波消解仪,奥地利Anton-Paar公司；BHW-09A16赶酸仪,上海博通公司；SQP电子天平,德国Sartorius公司；IQ 7000超纯水机,德国Millipore公司；DHG-9143BS-III恒温干燥箱,上海新苗。
多元素标准贮备液(10 μg/mL,内含钙、镁、锰、铁、铜、锌、钒、铬、硒等元素)、调谐液(10 μg/L,内含铈、钴、锂、镁、铊、钇元素)、内标贮备液(10 μg/mL,内含铋、锗、铟、锂、钪、铽、钇元素),美国Agilent公司；HNO3,色谱纯,德国Merck公司；实验用水为电阻率≥18.2 MΩ·cm的超纯水。
8种海产品(紫菜、海带、浒苔、海参、鲍鱼、牡蛎、贻贝、星虫),福建省厦门市海鲜市场;GBW10024扇贝成分分析标准物质,中国计量院国家标准物质研究中心。
1.2 实验方法
1.2.1 样品处理
参考GB 5009.268—2016进行[14]。将8种海产品编号1～8,以去离子水清洗干净后取可食用部分烘干并研成粉末。准确称取0.5 g(精确到0.000 1 g)样品粉末,加6 mL浓硝酸和2 mL体积分数30%H2O2溶液,按微波消解程序(8 min内将功率上升到500 W,500 W持续5 min；再在8 min内将功率上升到1 000 W,1 000 W持续25 min；冷却到70 ℃)进行消解。消解完毕于130 ℃赶酸2 h至1 mL左右,将消解液转移至干净的50 mL离心管中,以少量超纯水洗涤消解罐与盖子,合并洗涤液,定容至50 mL后称量液体为50 g,混匀备用,分析前过滤并稀释到不同浓度。同法处理国家标准物质,同时做空白试验。
1.2.2 标准溶液和内标溶液的配制
标准溶液：取适量多元素标准贮备液(10 μg/mL),用2% HNO3溶液逐级稀释成系列标准工作溶液(镁和钙质量浓度依次为0.01、0.1、0.5、1、2、5、10 μg/mL,其他元素质量浓度为0.1、1、5、10、20、50、100 μg/L),以2%HNO3溶液作为空白对照。
内标溶液：取适量内标贮备液(10 μg/mL),用2% HNO3溶液配制成质量浓度为0.5 μg/mL的内标工作溶液。
1.2.3 操作步骤
用调谐液对仪器质量轴、分辨率、灵敏度、氧化物、双电荷进行优化，优化后的条件：射频功率1 550 W；等离子体流量15 L/min，载气流量1.0 L/min，辅助气流量1.0 L/min，补偿气流量1.0 L/min；采样深度8 mm；雾化室温度2.0 ℃；蠕动泵转速0.1 r/s；采样锥、截取锥均为镍锥。按照仪器标准操作步骤进行分析测试及数据处理,再采用SPSS 26.0软件对各矿质元素的含量进行主成分分析和聚类分析。
2 结果与分析
2.1 方法学考察
2.1.1 线性关系和检出限
在优化实验条件下,采集空白及系列标准溶液,仪器自动绘制标准曲线,给出相关系数R。对试剂空白连续测定11次,以测量值标准偏差的3倍对应的质量浓度作为方法的检出限。结果如表1所示,各元素在各自浓度范围内呈良好的线性关系,相关性良好(R≥0.999 4),检出限0.008～4.798 μg/kg,灵敏度较高。
表1 线性方程、相关系数和检出限
Table 1 The linear equation,correlation coefficient and limits of detection
元素线性范围/ (μg·L-1)线性回归方程相关系数检出限/(μg·kg-1)Mg10～10 000y=0.008 5x+0.019 70.999 90.277Ca10～10 000y=2.455 9×10-4x+0.001 90.999 84.798V0.1～100y=0.080 3x+0.031 70.999 40.062Cr0.1～100y=0.109 0x+0.043 00.999 90.021Mn0.1～100y=0.059 6x+0.027 51.000 00.148Fe0.1～100y=0.100 2x+0.200 70.999 90.996Cu0.1～100y=0.184 2x+0.111 20.999 70.078Zn0.1～100y=0.025 6x+0.021 90.999 90.008Se0.1～100y=3.904 6×10-4x+3.167 8×10-40.999 90.430
2.1.2 精密度和准确度试验
为验证方法的准确性,选择国家标准物质扇贝(GBW10024)按上述方法平行测定6份,结果如表2所示,标准物质中各元素的测定值均在参考值范围内,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<3%,表明该方法准确性和精密度均良好。
表2 国家标准物质扇贝的测定结果(n=6)
Table 2 Analytical results of national standard substance(n=6)
元素标准值/(mg·kg-1)测量值/(mg·kg-1)RSD/%Mg1 740±601 707.9±39.22.29Ca750±90737.5±11.71.58V0.36±0.10.356±0.0082.24Cr0.28±0.070.278±0.0061.87Mn19.2±1.218.7±0.52.38Fe41±540.8±1.22.95Cu1.34±0.181.292±0.0090.65Zn75±375.4±1.92.46Se1.5±0.31.38±0.042.57
2.2 样品测定
所选8种海产品的矿质元素测量结果见表3和图1。不同海产品中各元素含量不同,含量差异反映自身遗传的生物特征。如：浒苔的镁元素含量最高(>1%),海带的硒含量最低(0.10 mg/kg),相差约106倍。镁、钙、钒、铬、锰、铁、铜、锌、硒等9种矿质元素总含量排序为星虫>浒苔>海带>紫菜>贻贝>海参>牡蛎>鲍鱼。将测量结果与已有文献进行对比,紫菜和海带的测量结果与文献[15]一致；浒苔与文献[16]一致；海参与文献[17]一致；鲍鱼与文献[18]一致；牡蛎与文献[19]一致,贻贝与文献[20]一致,星虫与文献[21]略有不同。矿质元素的含量差异可能与海产品的品种、产地、测试的元素不同有关。
表3 海产品矿质元素测定结果(n=6) 单位：mg/kg
Table 3 Analytical results of mineral elements in seafood (n=6)
元素紫菜海带浒苔海参鲍鱼牡蛎贻贝星虫Mg2714.6±93.51134.4±35.611139.8±374.03676.2±34.6530.1±2.92039.1±55.33248.5±46.94212.3±176.5Ca2509.8±21.97560.2±58.33987.8±33.31856.1±82.634.6±0.5605.7±7.62133.2±30.93677.9±94.4V1.22±0.073.56±0.059.80±0.20.35±0.0040.17±0.0041.24±0.010.96±0.0218.7±0.4Cr0.68±0.070.53±0.0078.41±0.090.19±0.020.12±0.0010.16±0.0041.46±0.026.61±0.2Mn45.5±2.115.7±0.625.5±0.73.24±0.060.69±0.0210.2±0.0441.0±0.55586.0±31.0Fe556.5±6.6383.4±2.52479.6±30.742.1±1.251.6±0.5103.5±1.1527.8±3.78236.7±315.6Cu13.0±0.72.15±0.0816.3±0.45.95±0.18.07±0.235.2±0.537.6±1.020.8±0.8Zn42.3±0.720.4±0.947.6±0.740.7±1.210.7±0.4356.4±6.875.5±0.9121.5±3.4Se0.16±0.0010.10±0.0050.22±0.010.12±0.0080.29±0.020.43±0.0035.92±0.15.39±0.1Zn/Cu3.26±0.29.48±0.032.93±0.066.83±0.081.32±0.0310.1±0.12.01±0.045.83±0.4
图1 降脂海产品矿质元素含量
Fig.1 Content of mineral element in hypolipidemic seafood
2.3 主成分分析
对8种降血脂海产品的矿质元素数据进行标准化处理,再进行主成分分析和聚类分析,以对各样品的相似性和差异性进行评价。先计算其相关系数矩阵,发现75%的相关系数>0.3,所有的变量都至少和一个不同变量线性相关,表明这些变量适合主成分分析。再计算相关系数矩阵的特征值和方差贡献率,结果见表4,前4个主成分贡献率分别为41.799%、22.047%、16.322%、12.163%,累积贡献率达92.330%,这4个主成分可以反映原始变量92.330%的信息。此结果与文献[2]相符。
表4 主成分分析特征值和方差贡献率
Table 4 Principal component analysis eigenvalue and variance contribution rate
主成分因子特征值方差贡献率/%累积方差贡献率/%14.18041.79941.79922.20522.04763.84631.63216.32280.16741.21612.16392.33050.6596.58998.91960.0940.94199.86070.0140.140100.000
主成分载荷系数矩阵如表5所示。载荷矩阵反映了各个初始变量与主成分的相关程度,也反映了变量的重要程度及作用。利用SPSS 26.0软件计算8种海产品矿质元素之间的相关关系矩阵、载荷矩阵及各种矿质元素的得分。
表5 主成分载荷系数矩阵
Table 5 Principal component loading coefficient matrix
标准化得分第1主成分第2主成分第3主成分第4主成分Mg0.540-0.314-0.3390.685Ca0.302-0.5670.5350.023V0.972-0.0850.1720.010Cr0.875-0.239-0.1830.369Mn0.8570.1670.226-0.366Fe0.9600.0410.126-0.170Cu0.2090.854-0.2870.212Zn0.0280.8440.3160.405Se0.6140.442-0.252-0.431Zn/Cu-0.1010.2310.9250.231
根据载荷矩阵得出各因子的得分,再根据各因子的得分情况进行排名,找出影响各因子的主要元素,并以各因子的贡献率为权重进行线性加权求和,得出各种海产品的综合得分,从而对其质量优劣进行综合评价。综合得分公式为：F=F1×0.417 99+F2×0.220 47+F3×0.163 22+F4×0.121 63,结果如表6所示。8种海产品降血脂效果排名顺序为星虫、牡蛎、浒苔、贻贝、海带、鲍鱼、紫菜、海参。
表6 主成分得分和排名
Table 6 Principal component score and ranking
样品得分F1排名得分F2排名得分F3排名得分F4排名综合得分F排名紫菜-0.4995-0.3535-0.3235-0.2584-0.3717海带-0.4414-1.05471.6731-0.3335-0.1845浒苔0.8452-1.0648-0.81661.85410.2113鲍鱼-0.6447-0.41460.2064-0.0043-0.3276海参-0.7788-0.2714-0.8657-0.9588-0.6428牡蛎-0.58761.84710.83431.15820.4392贻贝-0.12530.8962-1.2748-0.5536-0.0834星虫2.11710.41430.5662-0.90570.9581
根据主成分载荷矩阵可以得出：第1主成分因子主要与钒、铁、铬和锰密切相关；第2主成分因子主要与铜和锌有较高的相关性,与钙呈负相关；第3主成分主要与锌/铜比值密切相关,还与钙相关；第4主成分与镁和硒相关。主成分分析表明钒、铁、铬和锰是海产品降血脂的特征矿质元素。文献报道,铁具有促进脂肪消化、脂类转运、调节脂质代谢等多种生物学功能；锰是超氧化物歧化酶的主要成分,是葡萄糖和脂肪代谢的诸多酶的激活剂；铬有助于增加胆固醇的分解和排泄、减少血清胆固醇的含量；钒有减少血浆和主动脉胆固醇水平的作用,能抑制胆固醇在肝脏中的合成[3]。主成分分析结果与文献[3]相符。
2.4 聚类分析
将8种降脂海产品的矿质元素原始数据进行标准化处理并采用离差平方和方法进行聚类,得到的聚类谱系图如图2所示。8种降血脂海产品可分为两大类,其中,浒苔和星虫聚为一类,其余海产品聚合为一大类。浒苔和星虫的钒、铁和铬含量高,这是它们相似性高的一面；但是它们的锰和硒含量差异较大,浒苔的镁含量远远高于其他海产品。在另一大类中,牡蛎和贻贝相似度较高,这2种海产品在钙、铁、锌、硒含量和锌铜比值差异明显,但镁、钒、铜含量接近。紫菜和海参相似性较高。尽管这2组海产品在元素含量上有明显差异,但元素之间的比例相似,这也体现了海产品中矿质元素的协同作用。聚类分析结果和主成分分析结果基本一致。可见降脂海产品的元素谱系可为其药理研究提供依据。
图2 降脂海产品聚类谱系图
Fig.2 Clustering genealogy of hypolipidemic seafood
3 结论与讨论
本文利用ICP-MS对常食用的具有降血脂作用的8种海产品进行矿质元素测定,并对测定结果进行主成分分析和聚类分析,结果显示各类海产品之间的矿质元素含量存在差异,虽钙、镁、锰、铁、铜、锌、钒、铬、硒都和血脂存在密切的关系,但其含量和分布与海产品的品种密切相关,单纯地以某一元素的含量来比较海产品的功效相似性不能从整体上体现出中医用药规律。海产品中矿质元素含量和种类受其品种及生长环境等因素影响,运用主成分分析和聚类分析可以从整体信息方面挖掘降血脂矿质元素之间的内在规律并找出其相似性和差异性,这为海产品的食用和药膳组方的研究及开发利用提供了一定科学依据和指导。由于本文采用的品种数量有限,还有待扩大研究范围以进一步挖掘其规律性。
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