荧光探针可针对特定的目标物质产生荧光信号,并达到分析检测的目的。作为一种重要检测手段,荧光探针的应用范围已扩展至化学、环境以及生命科学等,并随着学科间的交叉不断拓宽其应用领域。本文主要针对荧光探针在高通量筛选技术上的应用进展进行系统的综述,分析了这一技术的特点以及存在的问题,为这类快速且高效的筛选技术的进一步应用提供参考依据,对高通量筛选技术的发展具有重要的指导意义。
1 荧光探针简介
18世纪中期,STOKES首次提出“荧光”的概念,对第一个定义明确的小分子荧光团奎宁的发光过程进行了解释。1856年,PERKIN成功合成了荧光染料类化合物苯胺紫,拉开了人工合成荧光染料的序幕[1]。1962年,SHIMOMURE等[2]从多管水母属中分离得到了绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),GFP作为最早被开发的一类荧光探针在生物医学领域被广泛应用[2]。在随后的发展过程中,荧光探针从GFP向有机小分子荧光探针扩展,第1个有机小分子荧光探针可追溯至20世纪80年代,学者们对荧光探针给出的准确的定义为：荧光探针是一种分子器件,能够选择性的与客体分子通过化学或者物理之间的相互作用,产生荧光信号,进而实现定量与定性检测客体分子的目的。随着荧光探针检测技术的不断发展,针对不同种物质具有功能特异性的荧光探针不断涌现,在近50年的发展过程中,荧光探针已被应用于生物细胞成像、环境分析、食品科学和医学等领域。近年来各类新型荧光探针的出现不断拓宽这一技术的适用范围,可检测的物质越来越广泛,如金属离子[3]、CO[4-6]、H2S[7]和甲醛[8]等。然而,各领域始终存在对可利用的新型荧光探针的需求,因此,设计并合成新型高效的荧光探针势在必行。
1.1 荧光探针的组成
荧光探针一般由3个部分构成：荧光基团、识别基团和连接基团,也有一些非典型结构的荧光探针无连接基团部分。
荧光基团可以释放出荧光信号,实现对目标物质的检测。荧光基团的性质决定了探针的灵敏度与准确性,常用的荧光基团包括：香豆素类、奈酰亚胺类、罗丹明类、荧光素类、苯并双噻二唑类和氟硼二吡咯类等[9](图1)。
图1 常见荧光团结构
Fig.1 The structure of common fluorophores
识别基团对待测物质具有特异性识别功能,识别效果决定了探针的选择性和特异性。一般情况下,识别基团与待测物可通过弱作用力或化学反应进行结合,作用力包括范德华力、氢键、亲疏水作用等,化学反应可以是加成反应、氧化还原反应、环化反应等[5]。
荧光探针与目标物相结合后将识别信息经连接基团传递给荧光基团,不同种荧光探针连接基团形式多样,最常见方式是利用共价键的形式将荧光基团与识别基团连接起来。
1.2 荧光探针的作用机理
荧光探针的作用机理如图2所示。随着研究的不断深入,有关荧光探针作用机理的研究已经有了很大进展,主要包括以下几种：
图2 荧光探针机理示意图
Fig.2 Schematic diagram of fluorescent probe mechanism
(1)分子内电荷转移(intramolecular charge transfer,ICT)[10]。ICT通过改变电子吸收能力、电子给体或是Π-共轭程度来与目标物相互作用,导致吸收光谱变化,实现发射峰红移或是蓝移,这是目前荧光探针最常依据的原理。依据ICT设计的荧光探针也适用于黏度大的检测环境。
(2)光诱导电子转移(photoinduced electron transfer,PET)[11]。电子给体与受体之间通过桥梁连接,探针受光激发后,激发态的电子给体与电子受体之间发生电子转移,导致荧光猝灭发生；当识别基团与待测物结合后,会减弱识别位点供电子能力,阻断PET效应,使荧光信号得以恢复。这一机理用于设计开关型荧光探针。
(3)荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)[12]。FRET包括一对荧光团之间的能量转移,分别为能量供体和受体,当能量的吸收与发射有一部分重叠且距离≤10 nm时,就会发生荧光共振能量转移。FRET常用于设计比率型荧光探针。
(4)聚集诱导发光(aggregation-induced emission,AIE)[13]。传统的荧光染料在高浓度时会导致发光猝灭,而AIE分子在聚集状态时,由于分子的空间位阻作用,非辐射跃迁被阻断,进而引发聚集诱导发光。依据AIE设计的荧光探针可以解决荧光团浓度过高而导致聚集猝灭的情况。
(5)激发态分子内质子转移(excited-state intramolecular proton transfer,EIPT)[14]。依据这一机理的荧光探针受到光、热或电激发后,分子内质子受体和给体间发生质子的转移。这一类型的荧光探针由于斯托克斯位移较大,可避免在激发过程产生自重吸收和内部过滤,但对环境十分敏感,需要提供疏水的胶束环境,如大量的有机溶剂。
1.3 荧光探针的分类
目前没有统一的方法将荧光探针进行分类,荧光探针的分类有多种形式,如按照材料、发射峰特性、发射波长以及反应类型等进行分类。虽然目前分类较多,但这些分类方法相互交叉,对荧光探针的设计与制备有一定指导意义。
根据材料的不同可以分为：绿色荧光蛋白、纳米材料以及有机小分子荧光探针。有机小分子荧光探针是近年来应用最为广泛的荧光探针,因其原理清晰、制备较易且成像效果好等优点备受青睐。
另一种常见的分类方式是将荧光探针分为比率型和强度型。强度型荧光探针在检测过程中有单个发射峰且有猝灭型和增强型2种类型[9]。比率型荧光探针利用2个发射峰的比值变化定量检测目标物,由于具有自校特点常应用于扰动较大的环境。
其他分类方式：根据发射波长的不同分为可见光荧光探针和近红外(near infrared,NIR)荧光探针；根据和目标物反应类型的不同分为反应型和配位型；根据荧光探针吸收光子数目不同分为单光子荧光探针、双光子荧光探针和多光子荧光探针；根据用途的不同分为pH荧光探针、金属离子荧光探针和核酸荧光探针等；根据检测样品种类不同分为生物类和非生物类荧光探针。
2 荧光探针在高通量筛选技术上的应用
高通量筛选技术(high-throughput screening,HTS)自20世纪90年代初次问世以来得到迅猛发展。针对大量待测物的检测和筛选,更高的筛选通量、更高的筛选效率以及小型化的检测方法节约了许多时间和成本,极大地提高了科研效率。荧光探针以能够与靶向目标物结合并发生荧光性质的改变为核心,在高通量筛选技术上的应用越发诱人,并随着荧光探针技术的发展在各领域有着一定的应用潜力。
2.1 高通量筛选目的菌株
快速高效的高通量筛选系统可以一次性获得大量信息,菌株的选育离不开高通量筛选技术。例如,荧光探针在高通量筛选含脂质酵母方面应用比较广泛。SITEPU等[15]为筛选含脂质的酵母样品,对已有的尼罗红荧光探针检测方法进行了改进,改进重点围绕提高细胞膜通透性等方面,实验结果表明尼罗红检测胞内脂质的效率得到了提升,适当降低尼罗红的浓度也不会影响检测结果,整套高通量筛选方法具有高效且低成本的特点。ROSTRON等[16]也将尼罗红荧光分析法应用于生物技术工业中快速筛选转基因菌株,在研究中验证了其在低脂非油脂裂殖酵母野生型和缺失型菌株中脂质含量检测方面的应用效果。近期也有研究将改进的高通量尼罗红荧光测定法用于快速筛选含脂质酵母,将固体培养和荧光检测相结合,使得整个筛选过程更简便、更高效[17]。除使用尼罗红作为荧光探针外,CHOI等[18]开发了亲脂性荧光染料,用于对细胞内的聚3-羟基丁酸酯进行定量分析,可以染色活菌落,从而可以有效选择聚3-羟基丁酸酯阳性细胞,且荧光强度保持时间比尼罗红更长,间接提高了检测结果的准确性。
尼罗红荧光探针是典型的亲脂性荧光探针,在胞内脂质检测及含脂质酵母筛选的过程中经历了荧光分析方法的优化、溶剂的选择、细胞预处理方式以及探针引入方式的探究等诸多阶段。这也为其他荧光探针在高通量筛选方案优化方面提供了一定的参考,如当研究对象为胞内物质时,可能遇到诸如探针的特异性、其他物质的干扰以及荧光强度较弱等问题,此时可参照上述研究中的策略进行方法的调整和优化。值得注意的是,选择尼罗红这一经典荧光团设计脂质荧光探针,具有优良性能的荧光团若加以适当的衍生化处理,可以提高与目标物质的特异性结合效率并展示出良好的荧光效果,将为荧光探针的选择提供一条便捷的路径。
除了对产脂质酵母进行筛选的应用外,也有研究对高产聚苹果酸酵母进行高通量筛选,合成了以罗丹明为荧光团的荧光探针,该荧光探针的荧光信号与聚苹果酸含量之间具有良好的定量关系,可用于评价发酵液中聚苹果酸的含量[19]。
荧光探针以其较高的灵敏度、反应迅速以及便捷的操作在高通量筛选目的菌株上扮演重要角色,但国内外的研究多集中在产脂质酵母的筛选,不仅很少涉及其他性状的酵母,而且也没有其他微生物的应用实例。据荧光探针设计方面的报道来看,各种类型的荧光探针,尤其是针对某种化合物的小分子荧光探针已经有了比较成熟的制备理论和有效性验证,如硫醇、H2S、CO以及甲醛等[4-5,7,20]。因此可适当拓展高通量筛选目的菌株的实际应用范围。
2.2 高通量筛选抗生素
pH荧光探针是荧光探针技术的重要应用之一,利用pH荧光探针可以对抗生素药物进行高通量筛选。基于pH荧光探针筛选抗生素的研究思路为：细菌的生长会使菌液酸化,pH荧光探针的荧光信号会随着菌液的酸化而减弱,抗生素的加入则会使荧光信号减弱的程度降低。有学者依据该实验思路成功地制备了pH荧光探针,并在高通量筛选抗生素上进行了应用,PAN等[21]的研究主要集中在探针的水溶性上，SI等[22]开发的荧光探针具有价格低廉、易于合成、高稳定性、无毒且易于与基质相结合的特点，设计的荧光探针适用于实时监测细胞酸化以及抗生素高通量筛选。
以上两者的研究更注重探针的实际应用,也有研究注重于探针设计,并展示出探针在高通量筛选抗生素上的应用潜力。叶文等[23]制备了可以实时监测pH的聚合物pH荧光探针并组合在微型反应器上,在高通量筛选抗生素方面具有应用价值。OTA等[24]开发了一种基于FRET的核酸探针,该探针被源自液滴中细菌的核糖核酸酶裂解,导致荧光强度增加,实验结果表明该检测方法具有高通量筛选抗生素的潜力[24]。
细菌菌液浓度通常用OD值表示,而荧光探针技术则具有较高的灵敏度,可在细菌生长至平衡期时更好地体现细胞代谢的变化,荧光探针展示出其在高通量筛选过程中的“高质量”。荧光探针在高通量筛选抗生素应用的同时揭示了通过pH变化来筛选目标物的巨大潜力,例如将细菌的新陈代谢活动作为它们对抗菌药物敏感性的指标,可筛选新的生长抑制剂。
2.3 高通量筛选酶抑制剂
荧光探针在高通量筛选酶抑制剂方面有着广泛的应用。其原理与筛选抗生素类似,都是通过监测外源物质的引入对荧光信号的影响来实现筛选的目的。首先设计并制备一种与目标酶进行特异性结合的荧光探针,筛选过程中对荧光有抑制或增强作用的化合物则为酶抑制剂,也可以使用适当的函数对抑制率进行表达。
LI等[25]开发了一种荧光探针来检测内源性细菌青霉素G酰基转移酶(penicillin G acylases,PGA),使用基于新型荧光探针的高通量筛选技术,发现齐墩果酸是潜在的PGA天然抑制剂,精确测定各种细菌的内源PGA活性也为高通量筛选产PGA菌株提供依据。XU等[26]合成了2种谷氨酰胺酶(glutaminase,GLS)荧光探针,对构建的含有三唑基的化合物文库进行交叉筛选,结果表明引入三唑基团可以抑制GLS活性。此外,也有研究报道了利用荧光探针高通量筛选15-脂氧合酶、单酰基甘油脂肪酶、N-乙酰基转移酶2以及胱硫醚β-合酶抑制剂的应用[27-29]。总之,抑制剂和荧光探针之间竞争酶的作用位点,将荧光信号的变化作为筛选的依据,与通过测定酶活力来筛选抑制剂相比优势明显。值得注意的是,制备的荧光探针可以针对特定的一种酶或多种酶,其他类型的荧光探针也是如此,设计出针对某一种特定物质的荧光探针实际上是有难度的,需要考虑荧光基团与待测物的专一性,根据研究目的也可以设计某一类带有相同的基团的荧光探针。
有部分研究侧重目标酶荧光探针的设计,涉及的酶包括金属蛋白酶-整联蛋白15、囊泡单胺转运体2以及膜蛋白,研究重点阐述了荧光探针的合成原理、合成路线以及功能表征,展示出在高通量筛选酶抑制剂上的应用前景[30-32]。制备理论的形成是突破性的一步,但还需要实际应用来考察技术的实用性。
2.4 其他高通量筛选技术上的应用
除高通量筛选目的菌株、酶抑制剂和抗生素外,荧光探针技术在其他高通量筛选技术方面也有一定应用。ZHANG等[33]报道了一种新的胆固醇荧光探针,当以高通量形式使用荧光探针时,可在短时间内检测对胆固醇有影响的化学物质,这种胆固醇荧光探针提供了一种安全、灵敏且可重现的策略。ZHENG等[34]开发了荧光高通量筛选方法测定脂肪酶的酯交换活性,用酶标仪在96孔微孔板中可检测荧光物质浓度,日筛选样品量可达9 200个。两者的研究都是在已具备一定高通量筛选技术的基础上进行的方法优化,荧光探针则为优化方案中的关键。在验证过程中发现,荧光探针筛选方法不仅与传统筛选方法结果趋于一致,更重要的是检测过程简单、灵敏度高、试剂廉价且对仪器要求低。
此外,高通量自动流动方法测定透析浓缩液中的痕量铝、高通量筛选环境样品中的甲状腺激素破坏性化合物以及高通量筛选动物毒液等,都展示出荧光探针在高通量筛选技术上良好的应用效果[35-37]。国内的研究则主要集中在医药方面的应用。兰小红等[38]使用3种荧光探针建立了肾保护活性物质的筛选方法,运用高通量方法先对化学组分进行筛选,再结合液相色谱质谱联用得到具体的目标物质,所建立的方法稳定且可靠。吴雪莉等[39]对中成药消渴安中二肽基肽酶-4抑制剂进行筛选,发现丹酚酸C等对二肽基肽酶-4具有抑制作用,为了得到具体的物质,同样需要结合液相色谱质谱联用的方式,为筛选药物中药效物质提供了实例,同时也是荧光探针在高通量筛选酶抑制剂方面的应用。
3 结论与展望
荧光检测技术是高通量筛选重要的方法之一,发展高通量筛选技术符合现代对科研效率的要求,荧光探针依靠与目标物特异性结合实现荧光信号的转变,极大地提高了筛选效率。目前已有多种荧光探针的设计方案被报道,尤其是有机小分子荧光探针具有广阔的应用前景。通过对近年来将荧光探针技术应用于高通量筛选的研究进行整理,可以投入实际应用的荧光探针主要包括以下特点：(1)无需繁琐的合成路线,有机小分子荧光探针在这一点上有一定优势；(2)荧光探针作用于目标物时具备良好的相容性,荧光信号作为筛选依据灵敏度高且有效；(3)特异性强,尤其对于检测环境复杂或是体系中存在与目标物官能团相同的物质,低选择性会使高通量筛选效率降低。
随着荧光探针技术的不断发展,学者们将荧光探针技术投入到高通量筛选的实际应用上来,但在应用过程中还存在一定的问题：(1)其他物质会对反应型荧光探针的作用效果造成干扰,提高选择性,实现荧光探针与目标物的特异性结合仍是亟待解决的问题；(2)荧光探针的设计与制备需要进行大量的理论研究和验证实验,且常涉及到学科交叉,为了获得合适的荧光探针一般需要对多种荧光探针进行试验,方法应用高效但前期准备工作量大；(3)除具备实验条件可自行制备荧光探针的研究外,目前一些将荧光探针应用至高通量筛选技术上的研究需要从已成功制备的荧光探针中进行筛选,识别基团作为主要的选择依据常会伴随着特异性、灵敏度以及可视化等问题,一定程度上制约了技术的应用进程。
在食品发酵领域,利用荧光探针可对微生物发酵过程中产生的风味物质等进行检测,判断荧光信号的强弱可实现对目的菌株的高通量筛选,在筛选优良菌株方面具有应用潜力。在食品检测分析领域,荧光探针可作为一种环境友好型检测方法,避免使用大量的有机溶剂,减少对人体和环境的潜在不利影响,绿色检测方法的应用可在真正意义上做到从源头杜绝食品污染。荧光探针检测方法步骤简便且检测效率高,具有快速性、准确性及科学性等突出特点,满足当下食品安全检测需求,为食品中有毒有害物质的检测提供了有效方法。此外,荧光探针是一种功能性较强的检测分析工具,快速检测试剂盒的研发则可以提高实际应用的效率,实现在食品加工、保藏、贮运以及市场监控等方面的高效快速检测。本文为荧光探针应用至高通量筛选领域提供了一定线索,特别是对探针选择以及筛选思路的构建进行了分析和阐述。
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