草苁蓉属于寄生植物，寄生于桦本科上，生长条件极为苛刻，喜欢在阴湿的环境生长，在我国大兴安岭以及长白山等地区分布较多[1]。草苁蓉全草可入药，因其有抗衰老作用又称“不老草”，近些年来，越来越多的国内外学者开始重视草苁蓉有效成分及其药理作用研究[2]。其中草苁蓉多糖(Boschnikia rossica polysaccharides，BRPS)是草苁蓉至关重要的活性成分[3]，具有保护肝脏、抗氧化应激以及抗炎等作用[4-7]。
炎症是人体的正常免疫反应，属于正常防御反应之一，在通常情况下是对机体有益的；炎症又是疾病进展的重要因素之一，如不加以阻止就会引起自身免疫性疾病、癌症、心血管疾病及糖尿病等多种疾病，将严重威胁人类生命健康及安全[8-9]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，目前是诱导机体产生炎症最常见的、危害最为严重的致炎因子[8-9]。因此，在本研究中利用LPS刺激小鼠J774A.1细胞建立巨噬细胞炎症模型，探讨草苁蓉多糖对巨噬细胞炎症反应的抑制作用及其机制，皆为在其抗炎方面的应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 细胞株与材料
草苁蓉，中国长白山，常规方法提取含量为86.5% 的草苁蓉多糖[3, 10]；小鼠J774A.1巨噬细胞，美国ATCC公司。
1.2 主要试剂
LPS，美国Sigma公司；环氧合酶-2(COX-2)抗体、Toll样受体4(TLR4)抗体、白介素-1受体相关激酶4(IRAK4)抗体、髓样分化因子88(MyD88)抗体、核转录因子-κB(NF-κB)抗体以及Lamin B1抗体，美国CST公司；β-action抗体，ABclonal公司；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗，中国纳川生物有限公司；IL-6、IL-1β、TNF-α酶联免疫吸附分析试剂盒，中国上海研瑾有限责任公司；核蛋白提取试剂盒，索莱宝有限公司；细胞增殖毒性试剂盒，中国北京庄盟科技公司。
1.3 主要仪器
RT-2100型酶标仪，美国Bio-Tek公司；UVP全自动凝胶成像仪，美国UVP公司；DYCZ-24DN电泳仪，北京市六一生物科技有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养
将小鼠J774A.1巨噬细胞放置于含有10%(体积分数)胎牛血清的高糖DMEM培养液中，37 ℃、5% CO2条件下培养。
1.4.2 LPS诱导J774A.1巨噬细胞建立炎症模型
取对数生长期J774A.1细胞，以密度为5×104个/mL接种于96孔板中，待细胞贴壁后，换成含有0、100、200、500、1 000、2 000 μg/L LPS的培养液。每组设6个复孔。LPS作用24 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，置于培养箱中作用2 h，用酶标仪测定492 nm处的吸光度值，计算细胞存活率，如公式(1)所示。收集细胞培养液，参照ELISA试剂盒说明书步骤，检测培养液中TNF-α、IL-6含量。
细胞存活率
(1)
1.4.3 BRPS对J774A.1细胞的毒性作用
取对数生长期J774A.1细胞，以密度为5×104个/mL接种于96孔板中，待细胞贴壁后，换成含有0、12.5、25、50、100、200 mg/L BRPS的培养液。每组设6个复孔。BRPS作用24 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，置于培养箱中作用2 h，测定492 nm处的吸光度值，并计算细胞存活率。
1.4.4 细胞分组及处理
J774A.1细胞随机分为正常组、模型组、BRPS低、中、高剂量组(又称BRPS25组、BRPS50组和BRPS100组，BRPS质量浓度分别为25、50和100 mg/L)[11]。正常组与模型组加入无血清DMEM培养液，培养24 h；BRPS组加入相应浓度BRPS的DMEM培养液，作用24 h。随后，除正常组换新的无血清培养液作用1 h 外，模型组与BRPS组均加入100 μg/L LPS，作用1 h。
1.4.5 BRPS对LPS诱导J774A.1细胞IL-6、TNF-α和IL-1β分泌的影响
收集各组细胞培养液上清，按照ELISA试剂盒说明书步骤，检测小鼠J774A.1细胞IL-6、TNF-α和IL-1β等炎症因子的分泌情况。
1.4.6 BRPS对LPS诱导J774A.1细胞炎症相关蛋白表达的影响
细胞分组以及处理同方法1.4.4，收集各组细胞，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，小心吸取上清液收集细胞全蛋白。利用核蛋白提取试剂盒提取细胞核蛋白。进行SDS-PAGE电泳，随后转膜到PVDF膜上，5%(体积分数)的脱脂牛奶封闭1 h后，一抗4 ℃过夜，相应二抗25 ℃孵育2 h，ECL显色，并用UVP全自动化学成像仪分析相对灰度比值。
1.5 统计学分析处理
实验数据以
表示，应用SPSS 20.0和Prism软件进行t检验以及方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 LPS诱导J774A.1巨噬细胞的炎症模型
如图1所示，不同浓度的LPS刺激对J774A.1细胞存活率无显著影响(P>0.05)，但可显著提高J774A.1细胞培养液中IL-6和TNF-α的含量(P<0.05)，提示巨噬细胞炎症模型成功。因此，本实验中J774A.1细胞炎症模型的构建均采用浓度为100 μg/L 的LPS处理J774A.1细胞1 h。
a-细胞存活率；b-IL-6；c-TNF-α
图1 LPS诱导的J774A.1巨噬细胞炎症模型的构建
Fig.1 Construction of LPS-induced J774A.1 macrophage inflammation model 注：与正常组比较，*P<0.05
2.2 BRPS对J774A.1细胞的毒性作用
如图2所示，BRPS浓度为0～100 mg/L时，J774A.1细胞存活率均在90%以上。因此，BRPS浓度小于100 mg/L时对J774A.1细胞没有毒性作用。在后续实验中，将25、50和100 mg/L分别选定为BRPS低、中、高剂量组的药物处理浓度。
图2 BRPS对J774A.1细胞的毒性作用
Fig.2 Effect of BRPS on the viability of J774A.1 cells
2.3 BRPS对LPS诱导J774A.1细胞TNF-α、IL-6、IL-1β分泌的影响
如表1所示，与正常组比较，模型组细胞培养液中的TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著增高(P<0.05)；与模型组比较，BRPS组TNF-α、IL-6和IL-1β含量显著降低(P<0.05)，说明BRPS对巨噬细胞炎症反应具有抑制作用。
表1 BRPS对LPS诱导J774A.1细胞炎症因子分泌的影响
Table 1 Effects of BRPS on LPS-induced secretion of inflammatory factors in J774A.1 cells
组别剂量/(mg·L-1)TNF-α/(ng·L-1)IL-6/(ng·L-1)IL-1β/(ng·L-1)正常0389.0±1.4575.96±2.2679.79±1.05模型0621.7±3.49∗147.50±2.81∗426.40±5.18∗BRPS组25598.1±2.14#134.50±4.9369.60±3.58#50527.4±8.77#122.10±3.05#256.10±3.62#100457.6±3.13#103.10±2.86#130.10±2.20#
注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05
2.4 BRPS对LPS诱导的J774A.1细胞COX-2蛋白表达水平的影响
如图3所示，与正常组比较，模型组COX-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，与模型组比较，BRPS中、高剂量组COX-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。
图3 BRPS对J774A.1细胞COX-2蛋白表达的影响
Fig.3 Effect of BRPS on protein expression of COX-2 in J774A.1 cells 注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05(下同)
2.5 BRPS对LPS诱导的J774A.1细胞TLR4蛋白表达水平的影响
如图4所示，与正常组比较，模型组TLR4蛋白表达水平显著增高(P<0.05)。与模型组比较，BRPS中、高剂量组的TLR4蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。
图4 BRPS对J774A.1细胞TLR4蛋白表达的影响
Fig.4 Effect of BRPS on expression of TLR4 protein in J774A.1 cells
2.6 BRPS对LPS诱导的J774A.1细胞MyD88蛋白表达水平的影响
如图5所示，与正常组比较，模型组MyD88蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，与模型组比较，BRPS组MyD88蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。
图5 BRPS对LPS诱导的J774A.1细胞MyD88蛋白 表达的影响
Fig.5 Effect of BRPS on protein expression of MyD88 in LPS-stimulated J774A.1 cells
2.7 BRPS对LPS诱导的J774A.1细胞IRAK4蛋白表达水平的影响
如图6所示，与正常组比较，模型组IRAK4蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，与模型组比较，BRPS组IRAK4蛋白水平降低(P<0.05)。
图6 BRPS对LPS诱导的J774A.1细胞IRAK4 蛋白表达的影响
Fig.6 Effect of BRPS on protein expression of IRAK4 in LPS-stimulated J774A.1 cells
2.8 BRPS对LPS诱导的J774A.1细胞核的NF-κB蛋白表达水平的影响
如图7所示，与正常比较，模型组细胞核中的NF-κB蛋白表达水平显著升高(P<0.05),与模型组比较，BRPS中、高剂量组的细胞核NF-κB蛋白水平明显降低(P<0.05)。
图7 BRPS对LPS诱导的J774A.1细胞核NF-κB 蛋白表达的影响
Fig.7 Effect of BRPS on protein expression of nuclear NF-κB in LPS-stimulated J774A.1 cells
3 讨论
炎症反应属于人体正常防御反应，在机体受到损伤时起到保护性作用，巨噬细胞恢复正常表型通常是成功解决或修复组织损伤的表现之一[12-13]。LPS是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，可作为毒性因子起作用，因此常被用于炎症模型的研究[14-17]。巨噬细胞作为促炎因子的主要来源，在炎症疾病中起着至关重要的作用。本实验以LPS为诱导剂，小鼠J774A.1巨噬细胞作为研究对象，建立J774A.1巨噬细胞炎症模型，研究BRPS对小鼠J774A.1细胞炎症反应的抑制作用及其机制。
LPS刺激巨噬细胞后产生和分泌大量炎症因子，其中IL-1、TNF-α和IL-6在炎症反应中发挥着重要作用。IL-1是对各种炎症和感染性刺激反应所产生的炎症因子，可分为IL-1α和IL-1β 2种，其中IL-1β是启动和维持局部及全身炎症反应的一种重要炎症因子，主要通过IL-6和C反应蛋白发挥作用[18-19]。当炎症发生时，IL-6迅速被刺激和表达，这有助于防御机体感染；而C反应蛋白作为炎症生物标志物，其合成主要受IL-6控制[20]。TNF-α是机体内主要的炎症细胞因子之一，被认为是炎症反应的关键参与者[21]。本实验中，用100 μg/L LPS处理J774A.1细胞1 h，可显著增高细胞培养液中TNF-α、IL-6水平，提示J774A.1细胞炎症模型已成功构建；而BRPS组IL-1β、IL-6和TNF-α水平较模型组显著降低，表明BRPS对巨噬细胞炎症反应具有抑制作用。
TLR4蛋白位于细胞膜上，主要表达在免疫细胞，如巨噬细胞、单核细胞等，当LPS与TLR4结合后，通过MyD88募集IRAK1/4，随后触发信号传导级联反应，导致NF-κB发生活化，调控其他炎症因子如IL-6和TNF-α的合成，诱导COX-2蛋白；而COX-2是前列腺素生物合成的关键酶，可通过多种促炎因子被诱导[15, 22-26]。课题组前期研究显示，小鼠炎性肝损伤模型中BRPS可通过TLR4/NF-κB信号通路对肝细胞炎症反应起到抑制作用，从而起到肝保护作用[27]。本实验结果显示，与正常组比较，模型组小鼠J774A.1细胞COX-2、TLR4、IRAK4、MyD88及细胞核NF-κB蛋白表达水平升高；与模型组比较，BRPS组COX-2、TLR4、IRAK4、MyD88以及细胞核NF-κB蛋白水平显著降低,提示BRPS的抗炎作用可能与其抑制TLR4/NF-κB信号通路有关,这与前人的实验结果相一致[27]。TLR4信号通路还可通过TAK1蛋白，激活与炎症反应相关的MAPK通路，其中JNK和p38通路与炎症关系最为密切[28-29]。因此，研究BRPS如何通过MAPK通路调节小鼠J774A.1细胞炎症反应将是本课题组下一步的研究方向之一。
综上所述，BRPS能够有效抑制LPS诱导的J774A.1细胞炎症反应，其抗炎作用可能与其抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。BRPS具有较强的抗炎作用，且水溶性好、无毒副作用，这些优点有利于对草苁蓉多糖的开发和利用。
[1] 陈庆红, 张睿, 冯秀春, 等.长白山区草苁蓉研究现状与濒危机理[J].现代农业科技, 2015(14):80-81.
CHEN Q H, ZHANG R, FENG X C, et al.Research status and endangered mechanism of Orobanche coerulescens in Changbai Mountain district[J].Modern Agricultural Science and Technology, 2015(14):80-81.
[2] 张航, 王辉, 杨树东.草苁蓉的本草考证及药理研究[J].长春中医药大学学报, 2016, 32(1):40-42.
ZHANG H, WANG H, YANG S D.Herbalogical study and pharmacological effect of Boschniakia rossica[J].Journal of Changchun University of Chinese Medicine, 2016, 32(1):40-42.
[3] 宋全胜. 草苁蓉根茎粗多糖的分离纯化及其部分性质的研究[D].延吉:延边大学, 2005.
SONG Q S.Purification and character of the crude polysaccharide from the root and stem of the Boschnikia rossica Fedtsch.et Flerov[D].Yanji:Yanbian University, 2005.
[4] 王玉娇. 草苁蓉多糖对肝细胞氧化损伤的保护作用[D].延吉:延边大学, 2014.
WANG Y J.Protective effects of polysaccharides from Boschniakia rossica on oxidative damage of lfiver cells[D].Yanji:Yanbian University, 2014.
[5] 尹学哲, 王玉娇, 尹基峰, 等.草苁蓉多糖对过氧化氢损伤HepG2细胞NF- κB表达的影响[J].中国老年学杂志, 2016, 36(13):3 108-3 110.
YIN X Z, WANG Y J, YIN J F, et al.Effect of Boschniakia rossica polysaccharides on expression of NF-κB in H2O2-damaged HepG2 cells[J].Chinese Journal of Gerontology, 2016, 36(13):3 108-3 110.
[6] 全吉淑, 王玉娇, 尹基峰, 等.草苁蓉多糖对HepG2细胞氧化应激的抑制作用[J].食品研究与开发, 2016, 37(11):6-9.
QUAN J S, WANG Y J, YIN J F, et al.Inhibitory effect of polysaccharides from Boschniakia rossica on oxidative stress in HepG2 cells[J].Food Research and Development, 2016, 31(17):6-9.
[7] 崔香丹, 何鑫, 朱洁波, 等.草苁蓉多糖对氧化应激所致血管内皮细胞凋亡的抑制作用[J].食品科学, 2018, 39(9):127-133.
CUI X D, HE X, ZHU J B, et al.Inhibition of Boschniakia rossica polysaccharides on oxidative stress-induced apoptosis in vascular endothelial cells[J].Food Science, 2018, 39(9):127-133.
[8] PALANISAMY A, TANGESTANI F M, SEAN T W, et al.Role of antioxidants and natural products in inflammation[J].Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2016, 2016:5 276 130.
[9] 王凤侠, 崔莹, 姚峻.益母草碱对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞炎症反应的调控作用[J].免疫学杂志, 2020, 36(11):970-975.
WANG F X, CUI Y, YAO J.The regulatory mechanism of leonurine on LPS-induced inflammatory responses of mouse peritoneal macrophages[J].Immunological Journal, 2020, 36(11):970-975.
[10] 何鑫. 草苁蓉多糖对叔丁基过氧化氢引起血管内皮细胞凋亡的保护作用[D].延吉:延边大学, 2017.
HE X.Protective effect of polysaccharides from Boschniakia rossica on TBHP induced apoptosis of vascular endothelial cells[D].Yanji:Yanbian University, 2017.
[11] 刘莉园.草苁蓉多糖对脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应的影响及其机制[D].延吉:延边大学, 2019.
LIU L Y.Effect of polysaccharides from Boschniakia rossica on LPS inducded inflammation of RAW.264.7 macrophages[D].Yanji:Yanbian University, 2019.
[12] JONATHAN C.The immunopathogenesis of sepsis[J].Nature, 2002, 420(6 917):885-891.
[13] SERHAN C N, SAVILL J.Resolution of inflammation:The beginning programs the end[J]. Nature Immunology, 2005, 6(12):1 191-1 197.
[14] CASTRO C D, HOLST O, LANZETTA R, et al.Bacterial lipopolysaccharides in plant and mammalian innate immunity[J].Protein & Peptide Letters, 2012, 19(10):1 040-1 044.
[15] SHI H T, DONG L, JIANG J, et al.Chlorogenic acid reduces liver inflammation and fibrosis through inhibition of toll-like receptor 4 signaling pathway[J].Toxicology, 2013, 303(1):107-114.
[16] WANG X Y, QUINN P J.Lipopolysaccharide:Biosynthetic pathway and structure modification[J].Progress in Lipid Research, 2010, 49(2):97-107.
[17] STEINER A A, CHAKRAVARTY S, RUDAYA A Y, et al.Bacterial lipopolysaccharide fever is initiated via toll-like receptor 4 on hematopoietic cells[J].Blood, 2006, 107(10):4 000-4 002.
[18] MCCARTY S, FRISHMAN W.Interleukin 1β:A proinflammatory target for preventing atherosclerotic heart disease[J].Cardiology in Review, 2014, 22(4):176-181.
[19] FANTUZZI G, DINARELLO C A.The inflammatory response in interleukin-1 beta-deficient mice:Comparison with other cytokine-related knock-out mice[J].Journal of Leukocyte Biology, 1996, 59(4):489-493.
[20] TANAKA T, KISHIMOTO T.The biology and medical implications of interleukin-6[J].Cancer Immunology Research, 2014, 2(4):288-294.
[21] BALKWILL F.Tumour necrosis factor and cancer[J].Nature Reviews Cancer, 2009, 9(5):361-371.
[22] P
O′CIENNIKOWSKA A, HROMADA-JUDYCKA A, BORZECKA K, et al.Co-operation of TLR4 and raft proteins in LPS-induced pro-inflammatory signaling[J].Cellular and Molecular Life Sciences, 2015, 72(3):557-581.
[23] WA C J Y, CHING T J C, WAN L P T, et al.Regulation of TLR4 in silica-induced inflammation:An underlying mechanism of silicosis[J].International Journal of Medical Sciences, 2018, 15(10):986-991.
[24] ZUNIGA M C, RAGHURAMAN G, HITCHNER E, et al.PKC-epsilon and TLR4 synergistically regulate resistin-mediated inflammation in human macrophages[J].Atherosclerosis, 2017, 259:51-59.
[25] LANCASTER G I, LANGLEY K G, BERGLUND N A, et al.Evidence that TLR4 is not a receptor for saturated fatty acids but mediates lipid-induced inflammation by reprogramming macrophage metabolism[J].Cell Metabolism, 2018, 27 (5):1 096-1 115.
[26] ROY A, SRIVASTAVA M, SAQIB U, et al.Potential therapeutic targets for inflammation in toll-like receptor 4 (TLR4)-mediated signaling pathways[J].International Immunopharmacology, 2016, 40:79-89.
[27] QUAN J, JIN M, XU H, et al.BRP, a polysaccharide fraction isolated from Boschniakia rossica, protects against galactosamine and lipopolysaccharide induced hepatic failure in mice[J].Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition, 2014, 54(3):181-189.
[28] LAI J L, LIU Y H, LIU C, et al.Indirubin inhibits LPS-induced inflammation via TLR4 abrogation mediated by the NF-κB and MAPK signaling pathways[J].Inflammation, 2017, 40(1):1-12.
[29] TAN S, ZHAO J, SUN Z, et al.Hepatocyte-specific TAK1 deficiency drives RIPK1 kinase-dependent inflammation to promote liver fibrosis and hepatocellular carcinoma[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2020, 117(25):1-12.