大量研究表明，能够作为人类胃肠道中益生菌的乳酸杆菌具有抗氧化、降低胆固醇、增强免疫力、抗肿瘤等重要生物学功能，其广泛应用于食品、农业和医药等行业[1-3]。但是在工业应用中，乳酸杆菌会面临多种物理或化学胁迫作用，如胆盐胁迫、酸胁迫、氧胁迫、冷冻胁迫等，进而影响细胞的许多重要生理功能，降低细胞的活力，制约着相关产品的开发[4-5]。在环境胁迫中，乳酸杆菌的细胞活力受到损伤，受损伤程度与其自身抗性大小密切相关，抗性越强的细胞越能耐受工业生产过程，维持细胞活力，从而在最终产品中表现出其相应的作用。因而，改善乳酸杆菌的环境胁迫抗性具有很高的实际应用价值，近年来选育具有多种胁迫抗性乳酸杆菌菌株的研究受到广泛关注[6-8]。胁迫抗性一般是基于对细胞生死状态的鉴别来进行表征的。目前，国内外主要采用稀释平板菌落计数法测定活菌数量(CFU)从而计算胁迫抗性[9]，该法主要是通过梯度稀释使菌悬液中的细胞充分分散后，接种平板培养，形成肉眼可见的菌落，假定每个菌落是1个活细胞形成的，计算得到活菌数量。此方法操作要求较高，如在稀释时需要充分混匀菌液，否则人为造成的误差较大[10]。近年报道的流式细胞计数可区分未受损、受损和受胁迫细胞[11]，但是对受损和受胁迫细胞数量的测定并不能完全表征出细胞经胁迫后繁殖力损伤的多少，而经胁迫后细胞具有多少残存繁殖力对于工业应用是非常必要的，如经胃酸胁迫后细胞如能快速恢复繁殖力，则有助于其在体内定殖，因而需要对有生长能力的乳酸杆菌细胞进行计数。比浊法通过培养液的吸光度(浊度)来间接表示细胞生长情况，是国内外通用的方法。本研究拟采用比浊法测定2种供试的乳酸杆菌菌株(发酵乳杆菌415和植物乳杆菌LGD)经胁迫后再培养的生长特性，并研究该法与稀释平板菌落计数法测定结果的相关性，来探究用比浊法测定乳酸杆菌胁迫存活率的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验菌株及培养基
发酵乳杆菌415和植物乳杆菌LGD由安徽农业大学茶与食品科技学院食品微生物实验室保藏。所用培养基为MRS培养基。
1.1.2 仪器与设备
SW-CJ-2FD超净工作台，苏州净化设备有限公司；DK-8D数显恒温水浴锅，江苏金怡仪器科技有限公司；PHS-3C pH计，上海雷磁；752紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；SPX-150B-Z生化培养箱，上海博迅实业有限公司；HYQ—3110漩涡混合器，上海珂淮仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 发酵乳杆菌415酸胁迫生物量比曲线的测定
将活化后的对数期发酵乳杆菌415用生理盐水将浊度(OD600)调整至4.0，以5%的接种量转接至MRS培养基中，37 ℃下静置培养至稳定期，取5 mL发酵液离心(8 944×g, 5 min)去上清液，将细胞沉淀重悬于pH 2.3的盐酸溶液中，37 ℃下水浴30 min后，离心(8 944×g, 5 min)去上清液，用生理盐水洗涤菌体1次，重悬于等量的生理盐水中，以5%的接种量接种至20 mL MRS培养基中，37 ℃下静置培养，每隔1 h取样测定生物量(OD600)，得到OD胁，对照组用生理盐水代替盐酸溶液，其余处理与实验组一致，得到OD对。每组设3个平行样。生物量比=OD胁/OD对。
1.2.2 不同酸胁迫时间下比浊法测定生物量比曲线和稀释平板计数法测定存活率
用1.2.1同样的方法将发酵乳杆菌415在pH 2.3的盐酸溶液中、37 ℃下分别水浴15、50、100、150、180 min 后，取5 mL发酵液离心(8 944×g, 5 min)去上清液，生理盐水洗涤后重悬于等量的生理盐水中，用稀释平板计数法测定菌悬液存活率，并以5%的接种量将菌悬液接种至20 mL MRS培养基中，37 ℃下静置培养，根据胁迫程度在合适的时间取样测定生物量(OD600)，对照组用生理盐水代替盐酸溶液，其余处理与1.2.1的一致，得到不同酸胁迫条件下生物量比曲线。
酸胁迫存活率的测定：取经酸胁迫且重悬于生理盐水的菌悬液，用混匀器充分混匀，进行梯度稀释，吸取10 μL 稀释菌液在MRS固体培养基上点样，每个稀释度点5个平行，待表层菌液被吸收后，放入37 ℃培养箱，倒置培养至菌落长出，对每个稀释度平板进行菌落计数，同时以重悬于生理盐水条件下的菌悬液作为对照，计算存活率。存活率=胁迫后的菌落数/对照菌落数。计算存活率时，考虑了误差的传递。误差传递公式为：
(1)
式中：A，胁迫后的菌落数；ΔA，胁迫后的误差；B，对照的菌落数；ΔB，对照的误差；C，存活率；ΔC，存活率误差。
1.2.3 酸胁迫标准方程对于发酵乳杆菌415其他类型胁迫存活率测定的适用性
胆盐胁迫：将经生理盐水洗涤的发酵乳杆菌415重悬于0.001%(质量分数)胆盐溶液中37 ℃下水浴45、90 min，其他操作方法与酸胁迫一致。
H2O2和NaCl胁迫：分别将经生理盐水洗涤的发酵乳杆菌415在室温下重悬于500 mmol/L H2O2溶液中45、60、90 min以及400 mmol/L NaCl溶液中60、80 min，其他操作方法与酸胁迫一致。
冷冻胁迫：将经生理盐水洗涤的发酵乳杆菌415重悬于等量灭菌生理盐水中，分装于无菌离心管中，取出适量菌悬液作为对照组，其余的置于-20 ℃下，分别于第0.5、2天取出在室温解冻作为胁迫组，其他操作方法与酸胁迫一致。
以上胁迫实验均用稀释平板菌落计数法测定存活率，计为存活率真值，用分光光度计比浊法测定生物量比，获得存活率拟合值。
1.2.4 比浊法测定植物乳杆菌LGD胁迫存活率
将活化后的对数期植物乳杆菌LGD用生理盐水将浊度(OD600)调整至4.5，在pH 2.5盐酸溶液中分别胁迫0.5、1、2.5、3、4 h后，用1.2.2中的方法测定取样时间点的生物量比和存活率之间的线性相关，获得酸胁迫标准曲线，用酸胁迫、H2O2胁迫和胆盐胁迫实验来验证这个酸胁迫标准方程的适用性，酸胁迫条件是37 ℃，pH 2.5的盐酸溶液中水浴3.5 h以及pH 2.7的盐酸溶液中水浴1 h；胆盐胁迫的条件是37 ℃下0.001%胆盐溶液中水浴40、100 min；H2O2胁迫条件是室温下在200 mmol/L H2O2溶液中水浴30、90 min。以上胁迫实验均用稀释平板菌落计数法测定存活率，计为存活率真值，用分光光度计比浊法测定生物量比，获得存活率拟合值。
2 结果与分析
2.1 经酸胁迫的发酵乳杆菌415的生长性能
在各种环境胁迫中，乳酸杆菌经常面临的胁迫是酸胁迫，其在发酵生产以及在人体胃液中都会遭遇酸胁迫的影响。乳酸杆菌属于嗜中性微生物，当处于较低pH值的环境条件下时，高浓度的H+会损伤细胞膜上的蛋白，从而影响营养物质的跨膜转运；环境pH过低也会使细胞内pH值随之降低，影响细胞中多种对酸敏感的酶活性，细胞糖降解速率降低，影响细胞能量的产生，从而限制菌体本身的生长和代谢。如图1所示，当发酵乳杆菌415在pH 2.3条件下胁迫30 min后重新接种新鲜MRS培养基，与对照组(未胁迫)相比，其生长曲线延滞期明显延长。微生物延滞期的长短与许多因素有关，在菌种、培养基和培养条件相同条件下，延滞期的长短主要与接种量密切相关。因此，经过酸胁迫后，部分发酵乳杆菌415细胞活性受到严重损伤，失去繁殖的能力，活细胞数减少，将胁迫后的菌液接种新鲜培养基后，其生长曲线会有相应的响应。由胁迫组和对照组的生物量比值绘制得到的生物量比曲线呈现出先下降后上升的特点，在4 h时生物量比最低，可能的原因是对照组在4 h 时已进入对数期，而胁迫组在4 h时还处于延滞后期，导致此时胁迫组与对照组生物量比值最低，随着培养时间的延长，胁迫组开始快速生长，导致胁迫组与对照组生物量的比值开始增加。
图1 发酵乳杆菌415经pH 2.3盐酸溶液胁迫30 min的 生物量曲线和生物量比曲线
Fig.1 Biomass curve and biomass ratio curve of Lactobacillus fermentum 415 under 30 min acidic stress in pH 2.3 HCl solution
从图1可以看出，生物量比曲线谷底后1 h(即第5 h)的生物量比值与培养物中活细胞数量可能成正相关，即此时培养体系中活细胞数越多，在5 h时胁迫组的生物量越高，那么生物量比值就会越高，该点定为取样时间点。为验证这一推测，分别测定了发酵乳杆菌415经pH 2.3盐酸溶液胁迫15、50、100、150、180 min的生物量比曲线和细胞存活率。实验发现(图2)，当胁迫程度较高时(即酸胁迫时间较长)，生物量比曲线上谷底出现的时间会比胁迫程度较低的延迟，谷底也没有那么明显，即出现1个低谷期而不是1个低谷值。结合生物量曲线，表明胁迫时间越长，菌悬液中活细胞数越少，因而在再培养过程中延滞期延长，取样时间点因此往后延迟，胁迫组的生长速率因此减慢，在取样时间点后的生物量比值增幅也因此减小，从而形成低谷期。
a-胁迫15 min;b-胁迫50 min;c-胁迫100 min;d-胁迫150 min;e-胁迫180 min
图2 发酵乳杆菌415经pH 2.3盐酸溶液胁迫不同时间的生物量曲线和生物量比曲线
Fig.2 Biomass curves and biomass ratio curves of L.fermentum 415 under different duration of acidic stress in pH 2.3 HCl solution
以存活率为横坐标，不同胁迫条件下生物量比曲线谷底后1 h(取样时间点)的生物量比值作为纵坐标，即经pH 2.3盐酸溶液胁迫15、50、100、150、180 min再接种培养的第4、6、6、6、8 h的生物量比值，绘制存活率与生物量比之间的关系曲线，对其进行回归分析(图3)，结果显示，在存活率为0.06～0.85时，两者的相关系数达到0.997 1，而其他时刻生物量比与存活率之间线性相关不显著(数据未显示)。因而此方程可作为标准方程，即发酵乳杆菌415经酸胁迫后用比浊法得到的生物量比代入此方程，即可得到存活率值。验证实验显示，在两次酸胁迫实验中，酸胁迫后存活率分别为0.156±0.054和0.347±0.067的菌悬液取样时间点的生物量比值分别为0.199±0.006和0.363±0.011，代入此方程后，计算所得的拟合存活率分别为0.161和0.322，存活率真值与拟合值之间的误差率为-3.54%和7.09%，均小于10%，表明比浊法测定酸胁迫存活率具有良好的可靠性。
图3 发酵乳杆菌415取样时间点的生物量比 和存活率之间的线性关系
Fig.3 Linear relationship between biomass ratio and viability of L.fermentum 415 under acidic stress at sampling point
2.2 比浊法酸胁迫标准方程测定不同胁迫类型存活率的适用性
乳酸杆菌会面临各种不同类型的胁迫[12-13]，并且胁迫损伤机理差异较大，例如胆盐会破坏细胞膜的完整性，降低胞内pH[14]；冷冻胁迫会使某些蛋白质折叠速率减缓或低效，降低细胞膜流动性等，从而剧烈干扰细胞的正常代谢[15]。为评价前述得到的比浊法酸胁迫标准方程是否可以用于测定其他类型胁迫存活率，将发酵乳杆菌415分别经H2O2胁迫、胆盐胁迫、冷冻胁迫和NaCl胁迫，测定生物量比和存活率，将取样时间点的生物量比值代入酸胁迫标准方程求得拟合存活率，将拟合存活率与真值结果进行比较，结果如表1所示，两者之间的误差率均小于10%，表明比浊法测定不同胁迫类型存活率具有良好的可靠性。可见，该标准方程不是只能用于酸胁迫，而是基于待测菌液中存活的细胞数，不论这些残存的活细胞是经过怎样的胁迫(物理的或化学的)，只要是存活的，可能就适用这个标准方程。
表1 分光光度计比浊法酸胁迫标准方程测定发酵乳杆菌 415不同类型胁迫下存活率的验证性实验
Table 1 Validation experiments of the standard equation for acidic stress by the turbidimetric assay using spectrophotometer to determine the viability of L.fermentum 415 under different type of stress
胁迫条件存活率真值分光光度计比浊法生物量比存活率拟合值误差率a/%500 mmol/L H2O2胁迫 室温45 min0.807±0.0930.889±0.0370.839-3.98460 min0.266±0.0500.302±0.0070.2631.13990 min0.210±0.0340.252±0.0030.213-1.5050.001%胆盐胁迫 37 ℃45 min0.742±0.0950.814±0.0630.766-3.22290 min0.592±0.0500.628±0.0450.5831.682400 mmol/L NaCl胁迫 室温60 min0.583±0.0370.655±0.0080.610-4.53780 min0.222±0.0340.281±0.0030.241-8.582-20 ℃冷冻胁迫0.5 d0.392±0.0440.436±0.0110.394-0.5482 d0.120±0.0170.168±0.0050.131-9.221
注：a误差率=(存活率真值-存活率拟合值)/存活率真值×100(下同)
2.3 比浊法测定植物乳杆菌LGD胁迫存活率
为验证比浊法是否可以应用于测定其他乳酸杆菌胁迫存活率，下面以植物乳杆菌LGD为研究对象，建立其酸胁迫标准方程，结果如图4所示，将植物乳杆菌LGD经pH 2.5胁迫不同时间，存活率为0.098～0.803，比浊法测定结果与稀释平板法之间线性关系良好，R2=0.998 7。相比发酵乳杆菌415，其存活率线性范围较窄，可能是因为植物乳杆菌的对数期(7 h)比发酵乳杆菌(9 h)的短，因而当胁迫程度较大时，胁迫组延滞期刚结束，对照组已进入稳定期，这样对照组生物量会包含部分死细胞，就会偏离生物量比与存活率之间的线性相关。用酸胁迫、H2O2胁迫和胆盐胁迫实验来验证这个酸胁迫标准方程，结果如表2所示，存活率真值与拟合值之间的误差率均小于10%，表明比浊法可以用来准确测定植物乳杆菌LGD酸胁迫、H2O2胁迫和胆盐胁迫存活率。
图4 经酸胁迫的植物乳杆菌LGD取样时间点的 生物量比和存活率之间的线性关系
Fig.4 Linear relationship between biomass ratio and viability of L.plantarum LGD under acidic stress at sampling point
表2 分光光度计比浊法酸胁迫标准方程测定植物 乳杆菌LGD不同类型胁迫下存活率的验证性实验
Table 2 Validation experiments of the standard equation for acidic stress by the turbidimetric assay using spectrophotometer to determine the viability of L.plantarum LGD under different type of stress
胁迫条件存活率真值分光光度计比浊法生物量比存活率拟合值误差率a/%酸胁迫 37 ℃pH 2.5、3.5 h0.126±0.0250.255±0.0090.1167.899pH 2.7、1 h0.683±0.0990.685±0.0040.6770.902200 mmol/L H2O2胁迫 室温30 min0.733±0.0990.685±0.0040.6777.65290 min0.352±0.0660.433±0.0100.3481.2450.001%胆盐胁迫 37 ℃40 min0.558±0.0700.620±0.0110.593-6.191 100 min0.319±0.0460.408±0.0120.3151.185
3 讨论与结论
比浊法常用于抗生素的抑菌性能研究，但报道大多以优化指示菌初始浓度、培养时间等因素，使抗菌物质浓度的对数与浊度在一定范围内线性关系良好，从而确定比浊法测定抑菌活性的方法[16]。而本课题组前期已建立的分光光度计比浊法测定细菌素乳酸链球菌素、类细菌素NFL和抗生素硫酸庆大霉素这3种抗菌物质效价[17]，是找到了抗菌剂效价线性定量测定的关键因子，即取样时间点，从而使抑菌率与抗菌物质浓度之间直接建立线性关系。与本文所报道的方法不同，其取样时间点是以抑菌率最高时对应的培养时间为取样时间点。
FERRANDO等[5]研究了NaCl浓度对于植物乳杆菌生长性能的影响，在20 h的培养期内每隔30 min 取样1次，测定浊度OD570，计算出最大比生长速率(μmax)，从而可以得到各个实验组之间在存活率上的差异。该法需要多次取样，工作量较大，并且实验结果无法与稀释平板菌落计数法之间相关联，因而无法与他人的研究结果相比较。对于需要测定一个乳酸杆菌菌株多种胁迫抗性的研究而言，本文所建立的分光光度计比浊法测定胁迫存活率是一个有效的方法，只需测定该菌株一种胁迫的比浊法标准曲线回归方程并验证其他类型胁迫的适用性后，就可以通过测定生长曲线来获得标准曲线存活率范围内不同胁迫程度下的存活率值。这不仅可以减少由于稀释操作不可避免带来的较大误差，还可以减少检测时间。以植物乳杆菌LGD为例，比浊法测定样品存活率所需时间最多为7 h，与稀释平板菌落计数法需要48 h相比，检测所用时间明显缩短，具有一定的优势，从而有利于实现乳酸杆菌胁迫抗性的快速准确检测。
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