鱼类中含有丰富的蛋白质、多不饱和脂肪酸且脂肪含量低，是人类获取营养物质的来源之一，但鱼类容易引起过敏反应[1]。鱼类过敏是人体对鱼肉中抗原物质产生的食物不良反应，是八大类食物过敏原之一，在沿海国家因食用鱼而导致过敏的事件很常见，且该过敏也是一种长期存在的病症，严重威胁人们的健康[2]。过敏的途径主要是通过摄食、呼吸以及皮肤接触，可引发患者在胃肠道、呼吸系统和皮肤等部位产生过敏症状，甚至可引发致命的过敏反应[3]。其中，鱼肉的过敏原主要有小清蛋白(parvalbumin, PV)、胶原蛋白和醛缩酶等[4-6]，PV被认为是鱼类的主要过敏原，最早在鳕鱼中被被鉴定出来[7]，随后，逐渐在大西洋鲑鱼、阿拉斯加鳕鱼等深水鱼类中被鉴定出来[8-10]。
PV是一种水溶性、低分子质量(约为12 kDa)的钙结合蛋白，在肌肉的舒张运动中起着重要作用，在热处理或是暴露于极端pH等条件下，仍可保持其致敏性。近年来，从鱼肉中提取、纯化PV，研究其致敏性成为了研究热点，且发现鱼类一般会存在2～5种PV亚型[3]。目前，通常使用柱层析和盐析法对PV亚型进行分离纯化，如CAI等[11]通过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharoses离子交换柱和Sephacry S-200凝胶过滤对赤魟鱼肌浆进行分离得到了PV亚型。尽管经两步柱层析法能分离纯化PV亚型，但色谱柱的容量会限制样品的进样体积，使其纯化效率降低，同时，不同PV亚型的分子质量差别不大，进而加大了分离纯化的难度，故有必要研究新方法对鱼类中PV亚型进行分离。高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)具有高灵敏度、分析速度快等优势，被广泛应用于食品的检测。尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography, SEC)则是一种基于分子的形状和大小不同的特征进行分离纯化的技术。采用HPLC结合SEC分离纯化鱼类中的PV，相比两步层析法而言，具有更高分离和纯化的效率。迄今为止，国内外对PV亚型提取、纯化、表征及过敏性等方面的研究大多集中在海水鱼类中，而我国是淡水鱼养殖和消费大国，虽然也有关于淡水鱼PV的研究，但相对而言起步较晚，且利用HPLC-SEC技术分离纯化淡水鱼PV亚型的研究鲜有报道。
鲢鱼(Hypophthalmichthy molitrix)是我国重要的淡水经济鱼类，在2019年我国淡水养殖产量中位居第二，约为381.03万t[12]。鲢鱼因具有生长迅速、营养价值高、价格低廉等特点而被人们喜爱和食用[13]。因此，本文以鲢鱼背部白色肌肉为研究对象，采用分级盐析、HPLC-SEC、高分辨质谱法来提取、纯化并鉴定鲢鱼中PV的不同亚型，并从蛋白层面研究PV亚型的氨基酸序列和蛋白修饰，以期为淡水鱼类PV亚型的提纯提供一种新方法，同时鉴定出过敏原，为淡水鱼类过敏原的研究提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鲜活鲢鱼购自江西南昌长胜市场，取背部白色肌肉立即实验或保存于-80 ℃。
色谱纯试剂：乙酸铵，北京索莱宝科技有限公司；碘化乙酰胺(iodoacetamide, IAA)，美国Bio-Rad公司；甲酸(formic acid, FA)、乙腈(acetonitrile, ACN)、三氯乙酸，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；胰蛋白酶，美国Promega公司；赖氨酰肽链内切酶，日本和光纯药工业株式会社；NH4HCO3，美国Sigma公司。
分析纯试剂：二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol, DTT)、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane THAM, Tris)、(NH4)2SO4，北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
FA1104 N电子分析天平，上海丙林电子科技有限公司；HH-6数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；S220SevenCompact台式pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SR-AON-50冷冻干燥机，上海舍岩仪器有限公司；D-2000HSM高效液相色谱、U-2910型紫外可见分光光度计，日本Hitachi公司；TSKgel G3000SWXLSEC柱，日本Tosoh公司；Mini-Protean电泳仪，美国Bio-Rad公司；5430R冷冻离心机，德国艾本德公司；MD34透析袋，北京索莱宝科技有限公司；超滤离心管(3 kDa)，美国Millipore公司；Q-Exactive质谱仪、Acclaim PepMap 100纳流预柱、Acclaim PepMap RSLC纳流分析柱、EASY-nLC 1000高效液相色谱，赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 PV粗提取
参考孙礼瑞等[14]的方法略作修改。取新鲜鲢鱼背部白色肌肉，切成碎块，使用组织捣碎机将其进行捣碎，加入5倍体积溶液(含1 mmol/L DTT、0.5 mmol/L甘氨酸和0.1 mol/L Tris溶液，溶液在4 ℃下预冷)，于搅拌器上搅拌30 min，4 ℃静置过夜。然后在4 ℃，7 500 r/min 离心30 min，取上清液进行保存。
1.3.2 PV的纯化
煮沸：将上清液置于95 ℃水浴锅中加热30 min，冷却后于4 ℃，7 800 r/min离心20 min，取上清液备用。
盐析：往上清液中加入(NH4)2SO4至饱和度为60%，于搅拌器上搅拌30 min后4 ℃环境下沉降12 h，然后于4 ℃，7 500 r/min离心30 min，去掉沉淀，收集上清液，并缓慢加入(NH4)2SO4至饱和度为80%，重复上述实验方法，同样去掉沉淀，保留上清液，往上清液中缓慢加入 (NH4)2SO4使饱和度达100%，重复上述实验方法之后收集沉淀。加入超纯水复容，透析36 h，于4 ℃，7 500 r/min离心30 min，以除去不溶物。
1.3.3 PV亚型的分离纯化
参照LIU等[15]方法利用HPLC-SEC分离鲢鱼肌肉中的PV亚型。用50 mmol/L的乙酸铵溶液(pH 6.8)平衡SEC柱。设置参数：检测波长220 nm，流速0.5 mL/min，时间30 min，将收集的目的蛋白溶液超滤脱盐，冻干保存备用。
1.3.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳分析
参照LIU等[16]方法对目的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析。
1.3.5 鲢鱼PV不同亚型的胶内酶解
将1.3.4小节中染色后的鲢鱼PV电泳胶条整齐地从胶上切下来，参照OFFENGENDEN等[17]报道的方法，对胶粒进行胰蛋白酶酶解，使用脱色液(含50% ACN的50 mmol/L的NH4HCO3溶液)和ACN进行脱色和脱水。干燥后加入200 μL 20 mmol/L DTT溶液，55 ℃反应45 min，反应结束后去除多余的DTT溶液，然后加入200 μL 20 mmol/L IAA溶液，在室温避光环境下反应30 min。去液脱水后加100 μL 50 mmol/L NH4HCO3溶液、2 μg的胰蛋白酶与赖氨酰肽链内切酶，37 ℃恒温培养箱中孵育12～16 h，除盐干燥后再用30 μL体积分数为0.1%的FA水溶液复溶，取1 μL样品进行质谱鉴定。
1.3.6 高效液相色谱结合质谱分析PV氨基酸序列
1.3.6.1 液相色谱条件
通过液相色谱系统，对含脱盐肽的溶液进行在线纳米流动液相色谱分析。采用AcclaimR PepMap100 column预柱(C18, 100 μm×5 μm)，AcclaimR PepMap RSLC column分析柱(C18, 50 μm×2 μm)，进样量：1 μL，流速为220 nL/min。采用逐步梯度洗脱的方法从柱前和分析柱上洗脱肽，流动相A为0.1% FA水溶液，流动相B为0.1% FA-ACN溶液，进样时每个样品进样1次，流动相具体洗脱程序如表1所示：
表1 流动相梯度洗脱程序
Table 1 Mobile phase gradient elution procedure
时间/min流动相A/%流动相B/%09742907307514426519505345258460584
1.3.6.2 质谱条件
质谱(mass spectrometry, MS)检测是由Thermo Q Exactive HF型质谱仪上完成，数据采集通过Xcalibur 2.2 SP1软件操作，一级母离子扫描范围为300～2 000 m/z，分辨率为70 000；选择信号排名前20的多肽进行碎裂，碎裂模式为高能碰撞解离(high energy collision dissociation, HCD)，能量为27%。
1.4 数据分析
母离子图谱用Xcalibur软件分析，对肽段序列分析用PEAKS软件完成。设定一级母离子质量误差容忍度为1.0 Da，二级碎片离子质量误差容忍度为0.6 Da。
2 结果与分析
2.1 SEC分析
SEC是一种基于化合物的分子质量大小进行分离的方法，并按分子质量大小的先后顺序被分离[16]，故借助HPLC-SEC对盐析后的PV进行分离纯化。经查阅文献可知，采用饱和度为60%～100%的硫酸铵溶液对鲢鱼蛋白溶液进行分级盐析并通过SDS-PAGE分析，发现饱和度为100%硫酸铵溶液所析出的蛋白质纯度会比饱和度为60%与80%的硫酸铵盐析出的蛋白质纯度更高[18]，故本实验直接采用HPLC-SEC对饱和度为100%的硫酸铵盐所析出的蛋白质进行分离纯化，经饱和度为100%硫酸铵盐所分离后PV的SEC图如图1所示。由图1可知，盐析后的PV经SEC分离后存在4个特征峰，第I峰可能为PV的多聚体，第II～IV峰为PV的不同亚型，第II、III峰没有完全分离，这可能是由于PV亚型之间的分子质量差别较小，SEC不能准确揭示分子质量的变化，故将这2个峰收集在一起。根据PV在SEC的分布情况，采用SDS-PAGE和高分辨质谱对其进一步确定分子质量及亚型鉴定。
图1 经100%硫酸铵盐析分离后PV的SEC图
Fig.1 SEC diagram of PV after 100% ammonium sulfate salting out separation
2.2 SDS-PAGE分析
经SEC纯化后第I～IV峰的SDS-PAGE图如图2所示。第I峰存在2个条带，其中有1个条带分子质量超过了17 kDa，为PV的二聚体，不符合PV亚型的分子质量范围；第II、III峰由于收集在一起，故也含有2个条带，其分子质量为11 kDa～15 kDa，符合PVI和PVII亚型的分子质量范围。与第I、II、III峰不同的是，第IV峰只有1个条带，其分子质量接近11 kDa，符合所报道的PVIII亚型的分子质量。LIU等[19]从鲢鱼白色肌肉中提取得到3种亚型的分子质量分别为14 kDa、12 kDa、11 kDa，而第I峰另一条带的分子质量虽然在11 kDa左右，但因可能有高分子质量的条带存在，为了避免影响实验结果，尽量减少误差，故本次只对第II～IV峰的PV胶条进行切割、提取，酶解蛋白质后通过高分辨率质谱技术进行测定。
1-marker；2-第I峰条带；3-II、III峰条带；4-IV峰条带
图2 第I～IV峰经SEC纯化后的SDS-PAGE图
Fig.2 SDS-PAGE diagram of the I～IV peak purified by SEC
2.3 分子质量及氨基酸序列分析
不同类型的蛋白酶解产物一般会存在差异，通过生物酶切技术与质谱法多肽识别技术研究特征肽段，可鉴定出蛋白质的种类。目前，主要是从分子方面研究鱼类PV的氨基酸序列，而从蛋白层面分析并鉴定其氨基酸序列的报道较少。本研究运用蛋白质酶切技术与液质联用法对多肽进行识别，并在PV亚型氨基酸序列鉴别方面进行了研究。PV亚型的一级质谱图如图3所示，将所得到的质谱数据与蛋白质数据库(https://www.uniprot.org/proteomes/UP000000437)中的小清蛋白亚型肽序列(Q804W2、Q6IMW7和Q9I8V0)以及文献报道的鲢鱼亚型肽序列[20](gi 209902357和gi 209902355)进行匹配，所得的肽序列数据通过Xcalibur软件分析并采用从头测序法(De novo)进行氨基酸序列鉴定。
a-PVI；b-PVII；c-PVIII
图3 PV亚型的一级质谱图
Fig.3 Ion flow diagram of PV isotypes
HPLC-MS/MS鉴定不同亚型PV的氨基酸序列如表2所示。3种PV亚型均能与蛋白质数据库中鱼类PV不同亚型的氨基酸序列进行匹配，其中PVI氨基酸序列与鱼类PV亚型(Q804W2)序列的匹配度最低，仅为74%的匹配率；PVII与鱼类PV亚型(Q6IMW7)的氨基酸序列匹配度最高，达到了完全重合的程度；PVIII与鱼类PV亚型(Q9I8V0)的氨基酸序列有99%的匹配率，进一步说明所纯化分离的PVI、PVII、PVIII均为PV亚型。同时根据质谱情况可得出该3种亚型的平均分子质量分别为12.029 0 kDa、11.581 0 kDa和11.622 0 kDa。另外，基于链长和序列特征，PV一般分为α型和β型，其中α-PV含有108个氨基酸，具有赖氨酸-丙氨酸(Lys-Ala)特征序列，而β-PV则是含有109个氨基酸，在相应位置为丙氨酸-丙氨酸(Ala-Ala)特征序列[21]。本实验所分离纯化的PVI、PVII、PVIII都拥有109个氨基酸，且氨基酸序列在相应位置为Ala-Ala，即可证明该3种PV亚型均为β型。
表2 PV氨基酸序列HPLC-MS/MS分析
Table 2 HPLC-MS/MS analysis of amino acid sequence of PV
PV亚型亚型编号平均分子质量/kDa氨基酸序列#序列匹配度/%PVIQ804W212.029 01MAMKNLLKDDDIKKALDQFK AADSFDHKKFFDVVGLKALSADNVKLVFKALDVDASGFIEEEELKFVLKG FSADGRDLTDKETKAFLAAADKDGDGKIGIDEFEALVHE10974PVIIQ6IMW711.581 01MAFAGVLNDADISAALEACKAADSFNHKSFFAKVGLASKSADEVKKAFAIIDQDKSGFIEEEELKLFLQNFKADARALTDGETKTFLKAGDSDGDGKIGIDEFAALVKA109100PVIIIQ9I8V011.622 01MAFAGILKDEDVAAALKDCAAADSFNYKNFFAKVGLSAKSPDDIKKAFFVIDQDKSGFIEEDELKLFLQNFSAGARALTDAETKAFLSAGDSDGDGKIGVDEFALLVKA10999
注：#下划线表示匹配肽段；上标数字代表氨基酸序号(下同)
2.4 PVII和PVIII氨基酸序列相似性
由表2可知，在所匹配的PV氨基酸序列中，PVII和PVIII具有高度的同源性，氨基酸序列相似性为77%，其中有2处序列超过10个氨基酸的重合，分别为51～61(IDQDKSGFIEE)和89～99(AGDSDGDGKIG)。在51～61肽链中，与GUO等[22]报道的鲣鱼、沙丁鱼、鲭鱼的PV氨基酸残基相同，而在89～99肽链中的氨基酸残基则与鲤鱼、鳕鱼和鲹鱼PV亚型氨基酸残基相同。另外，MARINA等[23]确定鳕鱼含有3个线性表位，其中一个表位为：AGDSDGDGKI，与PVII和PVIII在89～98肽链中的氨基酸残基相同，故该位置可能为PVII和PVIII的抗原表位。
为了研究自制鲢鱼的PV亚型与已报道鲢鱼PV亚型的氨基酸序列差异，分别用PVII、PVIII所匹配的氨基酸序列与表3中已报道的鲢鱼PV亚型(gi 209902357和gi 209902355)氨基酸序列[20]进行比对分析，发现两者同亚型的氨基酸序列相似性较高，分别为89%和88%。结果说明，不同品种的鲢鱼PV亚型氨基酸序列存在高度同源性。另外，在比对的PV亚型序列中，均含有一个保守的半胱氨酸残基，为Cys-19。这个半胱氨酸的巯基有利于产生链间二硫键，形成二聚体，有利于提高PV亚型的稳定性[19]。
表3 PVII与PVIII氨基酸序列比较
Table 3 Comparison of amino acid sequences of PVII and PVIII
PV亚型亚型编号氨基酸序列相似性/%PVIIgi 2099023571MAFAGILNDA DIAAALEACK AADSFNHKAF FAKVGLSAKS GDDVKKAFAI IDQDKSGFIE EDELKLFLQN FKAGARALTD AETKIFLKAG DSDGDGKIGV DEFAALVKA10989PVIIIgi 2099023551MAFAGILNEA DVTAALQACQ AADSFKYKDF FAKVGLSAKS PDDIKKAFAV IDQDKSGFIE EDELKLFLQD FSAGARALTD AETKAFLKAG DSDGDGKIGV DEFAVLVKA10988
2.5 PV亚型的特征肽段
蛋白质具有特定的氨基酸序列，当其被酶水解后，产生的多肽氨基酸序列各不相同，因此由氨基酸残基构成的多肽具有一定特征性，可用于鉴定蛋白质。基于每种蛋白质具有其特定氨基酸序列的原理，利用质谱获得特征性多肽的序列信息可有效达到蛋白质鉴定目的。鲢鱼3种亚型特征肽段的二级质谱图如图4所示。由图4-a可知，质荷比m/z为426.882 23+，该多肽所对应的质量为1 277.625 1 Da，HCD模式产生的一系列b离子和y离子证明了多肽序列的正确性，通过De novo鉴定出PVI的最独特的肽段结构为 85AFLAAADKDGDGK97；由图4-b可知，m/z为960.486 52+对应的多肽质量为1 918.945 8 Da，所鉴定的特征肽段为2AFAGVLNDADI-SAALEACK20，HCD断裂多肽片段所产生的系列y离子(y1，y4～y5，y7，y10，y12～y14，y16)和b离子(b2～b5)证明了多肽序列的准确性；类似地，由图4-c可知，m/z为616.350 52+的多肽质量为1 202.691 0 Da，特征性多肽的质量与理论值匹配良好，误差为-2.6，同时也鉴定出了自制鲢鱼PVIII的特征肽段为98IGVDEFALLVK108。
2.6 PV亚型的修饰比较
肽段修饰一般有甲基化、酰基化、磷酸化、泛素化等类型[24-26]，且HPLC-MS/MS可以准确地鉴定修饰位点的数量和位置。为了研究3种PV亚型的序列差异，对3种PV亚型肽段修饰情况进行鉴定，并分析其氨基酸序列的修饰情况,结果如表4所示。在PVI修饰肽段中，发现其只发生了酰基化，修饰位点为Ala-90、Asp-91；在PVII修饰肽段中，共有27个氨基酸被修饰，其中酰基化修饰最多，共有17个氨基酸，为Lys-28、33、39、97，Ala-47、89，Gln-53、69，Asp-54，Arg-77，Ser-56，Leu-66、87，Phe-67、71，Ile-98和Glu-102，而泛素化和磷酸化都只有2个氨基酸发生了修饰，泛素化修饰为Lys-55、72，而磷酸化则是Ser-13、38；类似地，在PVIII肽段中，与PVII修饰情况相同，有23个氨基酸发生了磷酸化、酰基化、甲基化和泛素化修饰，而修饰氨基酸数量却低于PVII氨基酸修饰数量。另外，通过2.4小节可知，89AGDSDGDGKI98可能为PVII和PVIII的抗原表位。PVII和PVIII在该表位区域都发生了酰基化修饰，同样地，PVII修饰氨基酸数量高于PVIII氨基酸修饰数量。结果表明，在自制的鲢鱼3种PV亚型中，除了PVI只存在酰基化修饰外，其余2个亚型都存在磷酸化、酰基化、甲基化和泛素化修饰，修饰位点的数量和位置对于PV亚型的免疫活性是否存在影响还有待深入研究。
a-PVI；b-PVII；c-PVIII
图4 PV亚型最独特的肽段鉴定
Fig.4 Identification of the most unique peptide of PV isotypes
表4 PV 3种亚型肽段修饰情况对比
Table 4 Comparison of modifications of PV isobtypes of peptides
亚型氨基酸序列修饰情况甲基化酰基化磷酸化泛素化PVI1MAMKNLLKDDDIKKALDQFKAADSFDHKKFFDVVGLKALSADNVKLVFKALDVDASGFIEEEELKFVLKGFSADGRDLTDKETKAFLAA∗A∗DKDGDGKIGI DEFEALVHE109--A90、D91----PVII1MAFAGVLNDADI∗SAALEACKAADSFNH∗KSFFA∗KVGLA∗S∗KSADEV∗K∗K∗AFAⅡ∗D∗Q∗D∗K∗SGFIEEEELK∗L∗FL∗QN∗F∗KADA∗RALTDGET∗KTF∗LK∗AGDSDGDG∗K∗IGI∗D∗EFAALV∗KA109K45～46、D52、K84、D101、K108K28、K33、K39、A47、Q53、D54、S56、L66、F67、Q69、F71、R77、L87、A89、K97、I98、E102S13、S38K55、K72PVIII1MAFAGILKDEDVAAALKDCAAADSFNYK∗NFFA∗K∗VGLSA∗K∗SPDDI∗KKAFFVIDQD∗K∗S∗G∗FIEEDEL∗K∗LFLQN∗FSA∗GAR∗ALTDA∗E∗T∗K∗AFL∗SAGDSDGDG∗K∗IGV DEFALLV∗KA109N29、K33、K55、E82、K84V34、K45、G57、F58、L66、F71、G74,A77、T83、A85、K97、I98、K108S56S40、K39、K65、S88
注：*表示该氨基酸发生修饰；数字代表修饰位点；--表示无修饰
3 结论
本研究采用DTT、Tris和甘氨酸混合溶液提取鲢鱼肌肉中PV，经硫酸铵分级盐析、HPLC-SEC分离纯化，得到了鲢鱼PV的4个特征峰，并对其进行SDS-PAGE测定，同时采用电泳胶条酶解和高分辨质谱鉴定，得到3种PV亚型PVI、PVII、PVIII，其平均分子质量分别为12.029 0 kDa、11.581 0 kDa和11.622 0 kDa，氨基酸序列分别与PV亚型Q804W2，Q6IMW7和Q9I8V0的氨基酸序列匹配率为74%、100%和99%；PVII和PVIII氨基酸序列分别与已报道鲢鱼PV亚型gi 209902357和gi 209902355的氨基酸序列相似性为89%和88%。结果说明，不同品种的鲢鱼之间的PV亚型氨基酸序列存在高度同源性。此外，鉴定出PVI、PVII、PVIII的特征肽段分别为 85AFLAAADKDGDGK97、2AFAGVLNDADISAALEACK20、98IGVDEFALLVK108；PVII、PVIII主要存在磷酸化、酰基化、甲基化和泛素化修饰，且PVII修饰程度高于PVIII和PVI，修饰类型、数量和位置对于PV亚型的免疫活性可能存在影响。这些结果表明，本实验采用的方法可以快速分离纯化PV，同时鉴定出其亚型、氨基酸序列、蛋白修饰位点和数量，可为鱼类过敏原的研究提供数据参考。
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