淡水鱼资源在我国尤为丰富,其中鲢鱼、鳙鱼、草鱼、鲤鱼是典型代表(约占88.5%)。绝大多数淡水鱼糜的内源性蛋白酶含量远高于海水鱼,其肌肉蛋白不仅抗冻能力较差,易发生冷冻变性,加工过程中还存在凝胶劣化、弹性不足等缺点,因此需要加入合适的外源物质对其品质进行改良,降低加工成本的同时提高淡水鱼糜的凝胶特性,如酶类蛋白质、非酶类蛋白质、淀粉类、非淀粉多糖类及其他天然产物等[1]。我国研究淡水鱼居多,国外研究则超过90%以海水鱼为主;但目前国内淡水鱼糜制品生产规模还不大、品种也较为单一,对其深加工的发展前景是大势所趋,如何更好地改善淡水鱼糜凝胶形成能力仍是目前开发高品质淡水鱼糜制品、提高淡水鱼加工深度和广度所需解决的首要问题,这将会推动我国淡水渔业繁荣兴盛,使其资源得以物尽所值,对合理利用大宗淡水鱼资源意义深远[2]。因此本文主要综述了淡水鱼糜凝胶形成及劣化的机理,通过添加蛋白类、淀粉类、非淀粉多糖类及其他天然产物等外源物质改善淡水鱼糜及其制品凝胶性能的研究进展,旨在为开拓各式各样的凝胶增强剂,并对其后续复合互作提高淡水鱼糜凝胶特性提供更多参考。
鱼糜制品是水产品加工程度较高的产品之一,2010年以来我国水产加工品总量增长32.95%,而鱼糜制品生产量则增加44.91%。当今,国内消费者对鱼糜及鱼糜制品的主要消费方式是作为火锅料,食用方式较为单一,中低端产品销量较大、高端产品销量低。随着鱼糜制品需求逐年增长,冷冻鱼糜的需求量不断增加,但作为冷冻鱼糜生产原料的海水鱼产量不足,因此淡水鱼已成为我国鱼糜制品生产的重要原料。
通常将新鲜淡水鱼经清洗(洗鱼、除磷)、采肉、漂洗(2~3次)、脱水(水分控制在78%~82%)、精滤(去除细筋、刺)等一系列操作加工后得到肌肉蛋白浓缩物,并加入适量抗冻剂,能在-18 ℃低温下较长时间贮藏的产品为冷冻淡水鱼糜;冷冻鱼糜解冻后,先空斩,再加入食盐及其他添加剂进行盐斩和调味斩,形成鱼溶胶后并对其进行热诱导,冷却后形成富有弹性且具有独特风味的胶状食品为鱼糜制品[3],其中典型传统代表有鱼糕、鱼肠和鱼板等[4]。冷冻鱼糜制品不仅含有丰富的蛋白质、各种矿物质及微量元素如钙、磷、铁等,而且易消化吸收,具有较高的市场占有率。通常评定淡水鱼糜品质的指标有凝胶强度、全质构分析(texture profile analysis,TPA)、持水性、白度、流变学特性、热变性等,其中TPA、凝胶强度及持水性常作为鱼糜凝胶特性的首要衡量指标[5]。淡水鱼糜在凝胶形成过程中,内源性蛋白酶会随着温度升高而增强代谢,导致蛋白质发生降解,不足以形成良好的凝胶网状结构,出现结构松散,持水能力弱,凝胶强度低等问题,故淡水鱼鱼糜凝胶特性不如盐溶性蛋白含量高的海水鱼鱼糜[6]。重组鱼糜制品是当下水产品加工领域研究的重点及热点,尤其是通过添加外源物质来增强淡水鱼糜制品的机械性质和功能性质而获得新的产品类型,具有很高的研究潜力[7]。
淡水鱼糜体内含有的内源性谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TGase)和组织蛋白酶分别通过肌球蛋白的共价交联反应、蛋白质肽链的水解作用来影响其凝胶的形成。传统淡水鱼糜制品的生产一般采用热诱导鱼糜形成凝胶,通过控温提高产品品质;在这过程中,鱼糜蛋白形成凝胶的过程主要有3个阶段,分别是凝胶化、凝胶劣化和鱼糕化[8]。
(1)凝胶化:淡水鱼肉需经过清水和低浓度盐水漂洗,溶出阻碍凝胶形成的水溶性肌浆蛋白;在斩拌过程中,通过加入食盐充分溶出属于盐溶性蛋白的肌原纤维蛋白,原因在于鱼肉蛋白的主要组成成分为肌原纤维蛋白、肌浆蛋白、基质蛋白[9],其中肌原纤维蛋白是形成鱼糜凝胶的关键蛋白,其主要由肌球蛋白和肌动蛋白构成,在此过程中二者由于盐溶作用而溶解,发生水化作用并聚合成肌动球蛋白——溶胶体(可塑性及黏性强)。将斩拌好的鱼糜置于≤40 ℃下热处理一定时长,其蛋白构象将会发生松散,分子间作用力也随之产生架桥形成立体网状结构,自由水被封锁在网眼中不能流动,从而形成了失去可塑性和黏性,但具有弹性的凝胶状物——凝胶体。其主要依靠疏水相互作用和二硫键,逐渐形成疏松的凝胶网络结构,淡水鱼糜蛋白从溶胶状态转变为产生弹性的凝胶状态[10]。
(2)凝胶劣化:鱼糜凝胶劣化现象普遍存在于淡水鱼糜的加工过程中,它会影响制品的凝胶特性,降低其品质。当淡水鱼糜处于50~80 ℃时,其内源性蛋白酶活性会被激活,从而水解肌球蛋白,致使凝胶网络结构发生断裂现象[11]。
(3)鱼糕化:当淡水鱼糜避开凝胶劣化温度带加热时,会逐渐抑制鱼肉中的内源性组织蛋白酶活性,鱼糜凝胶网络结构会随之变得稳定、非透明且紧密有序,是不可逆的三维网状结构,鱼糜的凝胶强度也显著增加,逐渐形成具有弹性的鱼糜产品[12]。因此传统淡水鱼糜制品的生产一般采用二段式加热(通常为 40 ℃ 加热 1 h,90 ℃ 加热 30 min)诱导鱼糜形成凝胶,通过控制温度提高产品的品质,这样制备出的鱼糜制品的品质显然高于一段加热制备的产品[13]。
综上所述,要想得到弹性好的淡水鱼糜热诱导凝胶,就需要保证其充分凝胶化且快速通过凝胶劣化温度带[14]。
淡水鱼肉中的盐溶性肌原纤维蛋白约占总蛋白含量的60%,由“Y”型结构的肌球蛋白、原肌球蛋白、肌动蛋白、肌动球蛋白等多种成分构成。鱼糜凝胶的形成过程与肌原纤维蛋白紧密相关,其中与肌球蛋白(约占肌原纤维蛋白的 55%~60%)的关系最为密切[15]。
由于淡水鱼种不同,其肌球蛋白的含量和肌原纤维蛋白的热稳定性也会截然不同,因此鱼糜的品质也会受其影响而出现一定的差距。当肌动蛋白与肌球蛋白在解离时,会诱导肌球蛋白重链发生聚合和降解,蛋白空间构象随之发生变化。其中肌球蛋白的 α-螺旋结构在凝胶化阶段中逐渐解开,肌原纤维蛋白中疏水作用力和二硫键的变化是最主要的因素,在凝胶形成过程中二者含量增加均有利于形成致密的网状结构,能够获得凝胶特性更为优质的淡水鱼糜制品,从而更好地满足消费者需求[16]。
外源添加物对淡水鱼糜及其制品的生产来说是至关重要的,无论从质地、口感、营养等方面来说都是不可或缺的,主要有TGase、动植物蛋白、淀粉、亲水胶体及其他天然产物。
用于改善淡水鱼糜凝胶的外源蛋白类物质主要分为2种:一种是酶类蛋白,最常用的是TGase,这是一种可以催化转酰基反应的转移酶,其可促使蛋白分子之间或蛋白分子内形成ε-(γ-谷胺酰基)-赖氨酸非二硫共价键,从而提高其凝胶特性[17];另一种是非酶类蛋白,又可分为植物蛋白和动物蛋白两大类,其促进淡水鱼糜凝胶特性主要有两方面的原因:一是其可通过自身的凝胶作用来增强鱼糜的凝胶特性[18],如大豆分离蛋白、大米蛋白、面筋蛋白等;二是其含有抑制内源蛋白酶活性的成分,降低对蛋白的降解作用,从而提高其凝胶性能[19],如动物血浆蛋白、卵清蛋白等。
3.1.1 酶类蛋白
由于鱼肉蛋白在低温下的凝胶作用与内源TGase的机能有关,多项研究也已证实其对淡水鱼糜凝胶特性产生一定的正面影响。鲢鱼中的内源性TGase的比活力为126.7 U/mg[20],而鳙鱼中的内源性TGase的比活力为5.59 U/mg[21],说明不同淡水鱼种的内源性TGase 活性是不一样的。虽然淡水鱼肉自身含有TGase,但鱼类内源性的TGase含量微乎其微,因此可通过添加外源TGase和微生物来源的 TGase(microbial TGase,MTGase)来提高淡水鱼糜制品的品质[22],具体相关指标参考值可见表1。严菁[23]通过优化MTGase的作用温度、作用时间、添加量和pH值条件后,并将其分别加入至鲢鱼、鳙鱼、草鱼和鲫鱼中,发现鱼糜的凝胶强度均显著增强。另有贾雅[24]通过研究TGase的反应温度(10 ℃)和添加量(0.5%)对新鲜或冷冻脆性白鲢鱼糜制品的TPA、凝胶强度等指标均有显著影响,组织结构较为致密,蛋白溶解度最小,失水率差异不大。综上,TGase可增强淡水鱼糜的保水性,充分形成ε-(γ-Gln)-Lys共价键是鱼糜制品口感变得脆爽的根本原因。
表1 热诱导淡水鱼糜在添加酶类蛋白过程中凝胶特性的变化
Table 1 Changes in gel properties of thermal-induced fresh water fish surimi during the addition of enzymatic proteins
鱼种添加的酶类蛋白作用条件相关指标参考值硬度/g弹性/mm凝聚性/(N·mm)咀嚼性/mJ回复性/N凝胶强度持水性/%参考文献鲢鱼MTGase用量:8 U/g反应温度:42 ℃反应时间:2.0 h-----8 704.2g·mm-[23]鳙鱼MTGase用量:8 U/g反应温度:42 ℃反应时间:1.5 h-----8 960.0g·mm-[23]草鱼MTGase用量:8 U/g反应温度:42 ℃反应时间:2.0 h-----18 225.2g·mm-[23]鲫鱼MTGase用量:8 U/g反应温度:42 ℃反应时间:2.0 h-----9 649.6g·mm-[23]生鲜白鲢鱼TGase用量:0.4%反应温度:10 ℃反应时间:25 h1 107.570.960.88933.450.586 084.87g·mm86.51[24]冷冻白鲢鱼TGase用量:0.5%反应温度:10 ℃反应时间:20 h1 077.470.950.87890.080.567 891.90g·mm91.97[24]革胡子鲶鱼脂肪酶用量:0.3%处理时间:15 min鱼水比:1∶5-----110g·cm70.00[27]
注:“-” 代表没有检测或文献没表明(下同)
脂肪酶(三酰基甘油酰基水解酶)作为一种生物催化剂, 天然作用底物为三酰基甘油酯, 水解后释放出甘油、甘油单酯或二酯以及游离脂肪酸,在参与反应的同时不会对其他成分造成不利影响, 因此脂肪酶适用于富含脂肪的淡水鱼糜加工中, 以提高其凝胶性能[25]。比如淡水鱼种的革胡子鲶鱼中含有大量的脂肪会干预凝胶的形成, 破坏蛋白凝胶网络结构, 降低产品品质,由它制备得到的鱼糜制品品质一般比不上一些淡水低脂鱼类[26]。苏瑞华[27]对高脂鱼种的鲶鱼(脂肪含量>5%)添加脂肪酶后发现,鱼糜凝胶蛋白在其作用下充分展开,经氧化作用进一步交联聚集,形成更多的二硫键得以稳定蛋白凝胶结构。另外,研究还从十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中分析出肌球蛋白重链条带变浅,可能是由于肌原纤维蛋白经历初期的充分展开后又在加热和脂肪氧化的影响下发生氧化,再进一步交联、聚集;同时观察到经脂肪酶处理的样品结构相对更致密有序。
3.1.2 非酶类蛋白
目前有大豆分离蛋白(soy protein ioslate,SPI)、活性谷蛋白、小麦蛋白、卵清蛋白、谷朊粉、菜籽蛋白和一些动物血浆蛋白(如羊血浆蛋白、猪血浆蛋白)等对淡水鱼糜凝胶特性进行相关研究,具体相关指标参考值可见表2。
表2 热诱导淡水鱼糜在添加非酶类蛋白过程中凝胶特性的变化
Table 2 Changes in gel properties of thermal-induced fresh water fish surimi during the addition of non-enzymatic proteins
鱼种添加的非酶类蛋白添加量/%相关指标参考值硬度黏度/mJ咀嚼性弹性/mm胶着性凝胶强度/(g·mm)持水性/%参考文献泥鳅鱼天然SPI3.0210--0.86--90.09[28]脱脂大豆蛋白粉10.07.8513.407.65--1 02097.75[29]生鲜白鲢鱼活性谷蛋白14.05.7012.507.45--1 00097.55[29]卵清蛋白干粉8.07.3514.507.95--1 12097.70[29]脱脂大豆蛋白粉8.07.4013.107.40--93095.20[29]冷冻白鲢鱼活性谷蛋白16.05.9012.306.60--88595.30[29]卵清蛋白干粉6.05.7013.207.25--98095.36[29]冷冻白鲢鱼菜籽蛋白1.51 700-1 2500.9-5 00081.00[30]鳙鱼鸡蛋清蛋白3.0-----620.695.50[31]谷朊粉15.0-----1 244.497.50[31]冷冻白鲢鱼羊血浆蛋白2.019.18-75.027.2610.33-96.50[32]生鲜白鲢鱼猪血浆蛋白1.52 166-17460.961 7158 620-[33]生鲜白鲢鱼卵清蛋白4.0819.30-650.14-663.06266.3780.00[34]卵清蛋白6.0879.59-689.41-694.4924085.00[34]冷冻白鲢鱼天然SPI2.03 600--0.93-60078.00[35]
其中SPI是一种优质的植物蛋白,其不仅营养价值高,而且含有人类所需的必须氨基酸,在有效降低饱和脂肪酸和胆固醇的同时,还能改善淡水鱼糜凝胶品质,对淡水鱼糜的水分含量有一定的保护作用。徐毅[28]发现添加3%的SPI可显著提升泥鳅鱼糜凝胶的弹性和硬度,并且此时的保水性达到最佳值,控制蒸煮损失的效果比较好,白度值也最大。早有研究发现,菜籽蛋白自身的吸水性质能够截留住鱼糜凝胶网络中更多的水分,彭晶[30]从菜籽粕中提取菜籽蛋白,并按1.5%添加至白鲢鱼糜凝胶中,发现样品的凝胶强度、硬度、内聚性、咀嚼性与持水度最佳,此时鱼糜凝胶网络结构也是变得致密且均匀,但过多会稀释肌球蛋白重链的浓度,还会阻碍肌原纤维蛋白之间的交联。
此外,还有研究学者通过分析鱼糜凝胶溶解率后证明动物血浆蛋白是通过形成非二硫共价键来促使淡水鱼糜形成更可靠的3D网状空间结构。如李景敏等[32]和雷雨[33]分别研究羊血浆蛋白和猪血浆蛋白对鲢鱼鱼糜品质的影响,发现二者均有助于提高 ε-(γ-Glu)-Lys含量及凝胶化程度,有效提升硬度、咀嚼性、凝胶强度及持水性等方面指标。
淀粉是一种至关重要的辅料,在淡水鱼糜制品中添加淀粉不但能降低生产成本,还能显著改善其凝胶特性,但不同种类的淀粉对淡水鱼糜的作用效果也各异,具体相关指标参考值见表3。
表3 热诱导淡水鱼糜在添加淀粉过程中凝胶特性的变化
Table 3 Changes in gel properties of thermal-induced fresh water fish surimi during the addition of starch
鱼种添加的淀粉种类添加量/%相关指标参考值硬度胶着性/g黏度/mJ咀嚼性弹性/mm凝胶强度持水性/%参考文献生鲜白鲢鱼马铃薯淀粉6.0923.52 g801.77-721.17 g-282 g·mm92.50[34]玉米淀粉6.0890.51 g771.93-704.52 g-271 g·mm92.00[34]小麦淀粉4.05.325 N-11.806.50 mJ-770 g·mm97.00[29]羟丙基化小麦淀粉8.06.750 N-12.807.50 mJ-890 g·mm97.50[29]交联酯化小麦淀粉6.05.960 N-12.507.30 mJ-830 g·mm97.30[29]醋酸酯化小麦淀粉6.05.510 N-12.007.00 mJ-820 g·mm97.20[29]玉米淀粉4.05.300 N-11.906.60 mJ-780 g·mm97.00[29]生鲜白鲢鱼羟丙基化玉米淀粉8.016.800 N-12.607.45 mJ-890 g·mm97.60[29]交联酯化玉米淀粉8.06.200 N-12.457.40 mJ-845 g·mm97.40[29]醋酸酯化玉米淀粉6.05.640 N-12.106.80 mJ-820 g·mm97.30[29]马铃薯淀粉6.05.560 N-11.806.70 mJ-835 g·mm97.30[29]羟丙基化马铃薯淀粉10.07.250 N-13.307.80 mJ-960 g·mm97.80[29]交联酯化马铃薯淀粉8.06.360 N-12.507.40 mJ-860 g·mm97.50[29]醋酸酯化马铃薯淀粉6.05.900 N-12.257.00 mJ-820 g·mm97.25[29]小麦淀粉6.05.350 N-11.655.85 mJ-740 g·mm93.75[29]羟丙基化小麦淀粉12.06.650 N-12.657.10 mJ-845 g·mm95.20[29]交联酯化小麦淀粉10.06.150 N-12.256.75 mJ-810 g·mm94.60[29]醋酸酯化小麦淀粉6.05.520 N-11.806.20 mJ-770 g·mm94.40[29]冷冻白鲢鱼玉米淀粉6.05.400 N-11.756.00 mJ-748 g·mm93.85[29]羟丙基化玉米淀粉14.06.800 N-12.757.20 mJ-860 g·mm94.90[29]交联酯化玉米淀粉10.06.200 N-12.356.90 mJ-810 g·mm94.70[29]醋酸酯化玉米淀粉8.05.630 N-11.956.30 mJ-785 g·mm94.40[29]马铃薯淀粉6.05.400 N-11.906.03 mJ-765 g·mm94.20[29]羟丙基化马铃薯淀粉10.07.200 N-13.107.40 mJ-1 040 g·mm95.20[29]交联酯化马铃薯淀粉12.06.300 N-12.406.95 mJ-847.5 g·mm95.00[29]醋酸酯化马铃薯淀粉10.05.800 N-12.906.15 mJ-792.5 g·mm94.45[29]冷冻白鲢鱼马铃薯羟丙基二淀粉磷酸酯2.04 000 g---0.93 650 g·cm89.00[35]木薯淀粉1.02 360.104 g1 909.614-1 803.494 g0.9443 400 g·mm71.50[39]冷冻白鲢鱼羟丙基淀粉1.02 520.261 g2 023.658-1 883.116 g0.9313 900 g·mm75.80[39]乙酰化二淀粉磷酸酯1.02 349.242 g1 897.671-1 786.921 g0.9423 150 g·mm71.20[39]醋酸酯淀粉1.02 235.652 g1 864.423-1 761.885 g0.9453 100 g·mm71.60[39]
3.2.1 天然淀粉类
天然淀粉是淡水鱼糜制品生产中最常添加的填充剂,如:马铃薯淀粉、玉米淀粉、红薯淀粉、木薯淀粉等。由于淀粉在淡水鱼糜加热过程中遇热会吸水膨胀进而发生糊化作用,糊化后的淀粉颗粒可以填充在鱼糜凝胶网格结构中,膨胀的淀粉颗粒会增加彼此间的作用力,从而能充分改善制品的凝胶特性,使其组织结构更加紧密[36]。
有研究表明,马铃薯淀粉中含有内源性蛋白抑制剂,可以与鱼肉蛋白酶争夺活性位点,使蛋白酶失去活性,从而减少鱼肉蛋白发生自溶现象,提高淡水鱼糜制品的弹性[37];施珍珍等[34]发现马铃薯淀粉和玉米淀粉都能明显提高白鲢鱼糜的硬度、胶着性和咀嚼性3种质构性能,相比于玉米淀粉,6%的马铃薯淀粉对改善样品的TPA最佳,有效促进白鲢鱼糜凝胶的形成能力;马铃薯淀粉比玉米淀粉对白鲢鱼糜的保水性更好,原因可能是马铃薯淀粉中支链淀粉含量(17%)及颗粒度(约40 μm)均高于玉米淀粉中的支链淀粉含量(11%)及颗粒度(约15 μm)。
3.2.2 改性淀粉类
考虑到原淀粉容易发生老化回生,可通过物理、化学或酶法处理来改变淀粉天然特性,使其拥有较好的持水、凝胶形成及膨胀能力,溶解率较小的变性淀粉可能更有利于促进淡水鱼糜凝胶的形成[38]。常用于淡水鱼糜的变性淀粉有羟丙基淀粉、交联淀粉、醋酸酯淀粉等。
王玉凤[29]发现羟丙基化淀粉对白鲢鱼糜的效果最好,其次是交联酯化淀粉,醋酸酯化淀粉,最后是普通淀粉;主要是由于各类改性淀粉中支链淀粉相对含量的增加程度不一,而支链淀粉对淀粉颗粒的膨胀起到促进效果。吴雪微[35]发现随着马铃薯羟丙基二淀粉磷酸酯浓度的增加,白鲢鱼糜的凝胶强度、硬度和弹性均呈现上升趋势,当浓度为2%时各方面指标的改善效果较好。米红波等[39]发现添加2%木薯羟丙基淀粉对白鲢鱼糜凝胶持水性的增强效果最好,这可能是由以下原因造成:(1)羟丙基可破坏分子内和分子间氢键,使原淀粉与水的结合能力增强;(2)羟丙基基团有助于产生分子间和分子内的排斥作用,提高淀粉的伸展性,使淀粉颗粒能维持更多水分。
亲水胶体是一类由多糖或蛋白质组成的大分子物质,绝大多数能与鱼类肌肉蛋白相兼容,主要关乎淡水鱼糜的持水力,通常不会显著影响其色泽;其次是它们具有膳食纤维,贴切当今消费者们追求的健康饮食理念,是改善淡水鱼糜凝胶物性的良好选择[40]。由于胶体来源不同,所拥有的活性基团和胶体结构大不相同,具体凝胶效果因其种类而异。常用于淡水鱼糜制品中的亲水胶体有卡拉胶、明胶、魔芋胶、黄原胶、可得然胶等,具体相关指标参考值见表4。
表4 热诱导淡水鱼糜在添加亲水胶体过程中凝胶特性的变化
Table 4 Changes in gel properties of thermal-induced fresh water fish surimi during the addition of hydrocolloid
鱼种添加的亲水胶体种类添加量/%相关指标参考值硬度黏度咀嚼性弹性胶着性凝胶强度持水性/%参考文献瓜尔胶0.56.20 N12.38 mJ6.95 mJ--880 g·mm91.0[29]生鲜白鲢鱼阿拉伯胶0.14.53 N11.70 mJ6.10 mJ--710 g·mm65.0[29]卡拉胶0.26.85 N12.72 mJ7.90 mJ--970 g·mm90.0[29]魔芋胶0.14.50 N11.50 mJ5.95 mJ--700 g·mm63.0[29]瓜尔胶0.56.30 N12.03 mJ6.63 mJ--825 g·mm91.0[29]冷冻白鲢鱼阿拉伯胶0.14.90 N11.17 mJ5.48 mJ--690 g·mm92.0[29]卡拉胶0.26.57 N12.90 mJ6.82 mJ--840 g·mm93.5[29]魔芋胶0.14.80 N11.10 mJ5.40 mJ--685 g·mm90.0[29]褐藻胶0.61.00 N-3.50 mJ5.50 mm0.50 N19.50 N·mm-[41]罗非鱼黄原胶0.21.50 N-6.50 mJ8.50 mm0.75 N28.57 N·mm-[41]卡拉胶0.84.25 N-32.00 mJ19.80 mm1.60 N87.25 N·mm-[41]罗非鱼鱼皮明胶10.0349.67 g-8.50 mJ2.79 mm307.00 g964.78 g·mm77.5[42]可得然胶0.43 834.425 g0.868 N3 128.978 g0.942 mm3 325.010 g4 327.12 g·mm75.4[43]冷冻白鲢鱼明胶0.12 470.937 g0.810 N1 736.198 g0.867 mm2 001.974 g3 131.23 g·mm73.2[43]卡拉胶0.22 676.265 g0.811 N2 040.828 g0.941 mm2 168.823 g4 071.24 g·mm73.9[43]黄原胶0.51 713.150 g0.719 N1 215.904 g0.751 mm1 401.985 g1 552.79 g·mm63.0[43]DK0号魔芋胶5.05.60 N0.61 mJ18.38 mJ5.73 mm3.20 N59.22 mJ-[44]生鲜白鲢鱼DK2号魔芋胶5.06.53 N0.60 mJ20.98 mJ7.70 mm2.93 N50.31 mJ-[44]DK4号魔芋胶5.09.97 N0.45 mJ30.92 mJ6.66 mm4.65 N66.35 mJ-[44]冷冻白鲢鱼刺槐豆胶1.04 300 g--0.94 mm-700 g·cm95.5[35]冷冻白鲢鱼KGM0.51.91 kg1.48 kg1.34 kg90.13%-690 g·cm87.5[45]DKGM11.03.42 kg2.65 kg2.44 kg89.82%-1 000 g·cm86.5[45]DKGM21.02.69 kg2.10 kg2.54 kg120.62%-1 190 g·cm83.0[45]生鲜白鲢鱼64%低脱乙酰度壳聚糖0.61 682 g0.79 mJ1 199 g0.90 mm1 325 g2 500 g·mm86.0[46]72%中脱乙酰度壳聚糖0.61 571 g0.78 mJ1 127 g0.91 mm1 234 g2 250 g·mm83.5[46]83%高脱乙酰度壳聚糖0.61 501 g0.78 mJ1 178 g0.91 mm1 172 g2 100 g·mm83.0[46]生鲜白鲢鱼海藻酸钠0.37.50 N0.53 mJ19.70 mJ5.24 mm3.68 N39.30 mJ92.8[44]冷冻白鲢鱼85 μm IDF2.03 000 g-0.82 kg0.92 mm0.84 N6 375 g·mm69.5[47]
卡拉胶分子含有较多的强阴离子性硫酸酯基团,通过氢键将凝胶体系内部和外部的游离水结合,并将其转化为不易流动水滞留在凝胶网络结构中。王玉凤[29]阐述了鲢鱼鱼肉蛋白中含有能够催化卡拉胶发生脱乙酰基反应的活性基团,因此0.2%的卡拉胶对提高生鲜和冷冻鲢鱼糜的凝胶强度很有效果,而且TPA指标也较好;瓜尔胶则次之。兰冬梅[41也同样发现0.6%和0.8%的卡拉胶对罗非鱼鱼糜凝胶的整体增强效果极为显著,其次是黄原胶和褐藻胶;此外,黄原胶表现为对样品的白度明显增大。但王聪[43]却发现添加黄原胶会对白鲢鱼糜制品凝胶强度产生较强的负面影响,而0.4%的可得然胶对其凝胶强度和持水性的增强效果最好,具有较好的保水性,能够束缚存在鱼糜蛋白凝胶中的部分游离水;其次是0.2%的卡拉胶和0.1%的明胶。除此之外,刺槐豆胶也可与水分子之间形成氢键,从而结合大量水,在一定程度上有效改善样品的持水性,吴雪微[35]发现白鲢鱼糜的凝胶强度和弹性会随刺槐豆胶浓度的增加而呈先上升后下降趋势,硬度呈上升趋势,在0.5%时保水效果较为明显,对白度影响不大,结合感官评价后,研究认为选取1.0%浓度最合适。
由于魔芋胶自身能形成结实的网络结构,同时又与鱼糜蛋白的网络结构交织,可束缚更多的水分。魏小红[44]曾制备6种不同脱乙酰度的魔芋胶(deacetyation of koniac-gum,DK),DK4号(45.36%)的白鲢鱼鱼糜凝胶的硬度和咀嚼性均达到最大值;DK2号(26.30%)时样品的弹性最好,蒸煮损失率最低,鱼糜凝胶强度可达81.65 mJ,与空白组的32.07 mJ相比得到了显著提高;白度值总体变化较小。同时,发现不同添加量(0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)的海藻酸钠可以提高白鲢鱼鱼糜凝胶的黏附性和内聚性,适量的海藻酸钠(0.3%)可以有效降低白鲢鱼鱼糜的蒸煮损失率;由此说明,海藻酸钠能促进肌动蛋白与肌球蛋白交联形成三维网络结构,截留水分,从而提高鱼糜凝胶的持水性能。还有研究表明,魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan,KGM)脱去乙酰基后,分子缠绕力度加强,凝胶结构变得更加稳固,影响蛋白变性汇集形成凝胶网络的过程,从而导致鱼糜蛋白凝胶速率的变化,于加美[45]通过制备2种不同脱乙酰度魔芋葡甘聚糖(63.29%的DKGM1、94.50%的DKGM2)改善鲢鱼糜的凝胶特性,发现DKGM比KGM更能提高鲢鱼糜蛋白凝胶速率,其中DKGM1最有利于鱼糜凝胶网络结构的形成。近几年也不乏将壳聚糖加入淡水鱼糜以提高其凝胶强度的报道,主要由D-氨基葡萄糖组成的阳离子碱性多糖聚合物——壳聚糖与水分子作用后具有黏度,可提高鱼糜凝胶强度,张茜[46]分析不同DD、分子质量和添加量的壳聚糖对白鲢鱼糜质构的影响;结果表明当添加粘均分子质量(64%)的壳聚糖时,其凝胶强度、硬度值最高,持水性也得到明显改善,对样品的白度无明显变化。
此外,还有研究发现不溶性膳食纤维(insoluble dietary fiber,IDF)对凝胶网络的作用方式可能有两类:(1)IDF自身的吸水溶胀性可形成蜂窝结构,能起到支撑蛋白凝胶网络结构的作用;(2)通过夺取蛋白质的水分,间接增加蛋白浓度,可有效聚集鱼糜肌原纤维蛋白。孟爽爽[47]提取麸皮中的膳食纤维后将不同粒度的IDF和不同溶解度的膳食纤维分别添加入冷冻白鲢鱼糜凝胶中,结果表明85 μm的IDF(≤2%)会使周围蛋白质浓度及内源性TG酶的含量增加,从而增加了体系中非二硫共价键的含量,但≥3%浓度时,蛋白会被稀释,阻碍了非二硫共价键的形成。
当前,利用低饱和脂肪酸和低胆固醇的植物油取代猪油来强化淡水鱼糜制品的营养价值、质地、口感、色泽等将越来越受到消费者的青睐。米红波等[48]发现3%大豆油、3%亚麻籽油和3%紫苏籽油对草鱼鱼糜凝胶的品质具有显著性影响,从表5可看出紫苏籽油的添加效果最佳。
表5 热诱导淡水鱼糜在添加其他物质过程中凝胶特性的变化
Table 5 Changes in gel properties of thermal-induced fresh water fish surimi during the addition of other substances
鱼种添加的其他物质添加量/%相关指标参考值硬度/N弹性/mm黏着性/(N·mm)凝聚性/N咀嚼性/mJ凝胶强度/(g·mm)持水性/%参考文献大豆油3.020.840.930.8417.4416.28920.1588.27[48]生鲜草鱼亚麻籽油3.018.610.900.8014.7813.49936.7989.35[48]紫苏籽油3.023.650.920.8219.3717.951 170.2790.71[48]生鲜白鲢鱼儿茶素0.056.630.435.763.2018.42--[44]
儿茶素是鲜茶叶中多酚类物质的重要组分(约占80%),魏小红[44]发现添加较低浓度(0.05%)的儿茶素有利于生鲜白鲢鱼的黏弹性;由于其结构中含有较多的羟基和羰基,可以与蛋白质交联形成稳定的网络结构,因此有部分研究将其用作凝胶增强剂来改善鱼糜的凝胶特性。
在淡水鱼糜制品加工中,单纯添加大量淀粉难免增加产品的粉质口感,而单纯添加大量亲水胶体也可能会使产品凝胶过强易脆、弹性差,不利于产品的生产。因此将淀粉与亲水胶体按一定比例复配可以充分发挥淀粉和胶的协同增效作用,从而扩大其使用范围和成效。目前有王聪[43]通过利用响应面软件对羟丙基淀粉、可得然胶和卡拉胶三者之间的交互作用进行优化,得出三者的最佳添加量分别为1.36%、0.44%和0.22%;经验证,白鲢鱼糜凝胶强度值为3 659.96 g·mm与理论值3 631.26 g·mm无显著性差异;并且在所有处理组中,复配物对鱼糜凝胶持水性(76.83%)和白度(78.26)的改善效果最好,说明三者之间存在一定的协同增效作用。
淡水鱼在一定程度上能够缓解海水鱼产量缩减的趋势,并拓宽鱼糜制品市场,因此改善淡水鱼糜品质是一大研究热点,目前已有较多通过添加各种外源物质来改善淡水鱼糜及其制品品质、降低成本的研究和应用。尽管如此,由于淡水鱼类存在多样性,当前各种机理可能仅适宜于某种或某类鱼,各作用机制都有待进一步摸索和完善,还有很多外源添加物互作对淡水鱼糜蛋白作用机理及其风味的的机制研究仍不够深入系统。
在未来的研究中:(1)不应仅局限于单纯添加天然淀粉、亲水胶体、非鱼肉蛋白质等几类物质,还可对其进行适当的改性利用;(2)筛选出效果较优的同类物质或不同类物质进行复配互作,弥补单一添加的劣势,实现效益最大化;(3)寻找合适比例的高值海水鱼肉与低值淡水鱼肉进行混合,不同来源的鱼糜蛋白能够起到更佳的协同增效作用;(4)开发其他更多新型的鱼糜凝胶增强剂,如动物骨粉及其胶原水解物(不仅具有增强凝胶和保水的作用,还能起到抗氧化活性功效)和多样化的天然多糖微凝胶(具有安全无毒、易降解及生物兼容性较好等优良性能);(5)可积极借鉴其他用于增强禽畜肉肉糜凝胶品质的添加物等。
此外,还可采用新能源技术替代传统的水浴锅二段式热处理,更能展开淡水鱼糜的肌原纤维蛋白分子,促使疏水基团充分暴露,蛋白分子颗粒的分布更均匀,显著加强淡水鱼糜的凝胶特性;因此将外源物质结合单一物理场或复合物理场技术如超高压、超声波、微波加热、电子束辐照、高密度CO2及微波-超声联用等,将会优化出更多高质量的低盐复合淡水鱼糜制品。
[1] 谭力,周春霞,洪鹏志.淡水鱼鱼糜制品加工特性及品质影响因素[J].食品与机械, 2018, 34(8):165-168.
TAN L, ZHOU C X,HONG P Z.Research progresses on processing and utilization of freshwater fish surimi and surimi products[J].Food and Machinery, 2018, 34(8):165-168.
[2] 董琳,李莎莎.淡水鱼资源的保护与渔业经济的可持续发展探究[J].南方农业, 2018, 12(32):74-75.
DONG L, LI S S.Protection of freshwater fish resources and sustainable development of fishery economy[J].South China Agriculture, 2018, 12(32):74-75.
[3] 张婷, 李茜雅, 唐欢, 等.鱼糜及鱼糜制品加工工艺研究进展[J].中国调味品, 2018, 43(3):185-191.
ZHANG T, LI X Y, TANG H, et al.Recent investigations on processing of surimi and surimi products[J].China Condiment, 2018, 43(3):185-191.
[4] PARK J W.Surimi and Surimi Seafood[M].New York:CRC Press, 2013.
[5] 王燕.低值淡水鱼鱼糜及制品品质的改良和质地评价研究[D].武汉:武汉轻工大学,2013.
WANG Y.Research on the improvement of the quality and evaluation of texture of low-value freshwater fish surimi[D].Wuhan:Wuhan University of Light Industry,2013.
[6] 张屹环, 夏文水.大宗淡水鱼糜凝胶性质比较研究[J].食品与生物技术学报, 2012, 31(6):654-660.
ZHANG Y H, XIA W S.Studies on comparison of gel properties of conventional freshwater fish surimi gel[J].Journal of Food Science and Biotechnology, 2012, 31(6):654-660.
[7] 薛茜, 王芳, 张龙涛.水产制品凝胶的研究进展[J].食品工业, 2020, 41(2):253-257.
XUE X, WANG F, ZHANG L.Review on gel in aquatic product[J].The Food Industry, 2020, 41(2):253-257.
[8] 李艳青, 孔保华, 夏秀芳.鱼糜凝胶形成机理及提高鱼糜凝胶特性的添加物研究新进展[J].食品科技, 2012, 37(7):140-144.
LI Y Q, KONG B H, XIA X F.Gel formation mechanism of surimi and research progress on new additives of enhancing gel properties of surimi[J].Food Science and Technology, 2012, 37(7):140-144.
[9] 秦影, 欧昌荣, 汤海青, 等.鱼糜制品凝胶特性研究进展[J].核农学报, 2015, 29(9):1 766-1 773.
QIN Y, OU C R, TANG M Q, et al.Research progress on gel properties of surimi products[J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2015,29(9):1 766-1 773.
[10] 刘芳芳, 林婉玲, 李来好, 等.鱼糜凝胶形成方法及其凝胶特性影响因素的研究进展[J].食品工业科技, 2019, 40(8):292-296;303.
LIU F F, LIN W L, LI L H, et al.Research progress on the formation method of surimi gel and the affecting factors of gel properties[J].Science and Technology of Food Industry, 2019, 40(8):292-296;303.
[11] SAMEJIMA K, ISHIOROSHI M, YASUI T.Relative roles of the head and tail portions of the molecule in heat-induced gelation of myosin[J].Journal of Food Science, 1981, 46(5):1 412-1 418.
[12] NUNEEZ-FLORES R, CANDO D, BORDERIAS A J, et al.Importance of salt and temperature in myosin polymerization during surimi gelation[J].Food Chemistry, 2018, 239:1 226-1 234.
[13] 张梦玲, 樊瑶, 张晋, 等.鲢鱼糜凝胶力学性能对热处理方式的响应性研究[J].现代食品科技, 2017, 33(2):129-135.
ZHANG M L, FAN Y, ZHANG J, et al.Effects of heating modes on the mechanical properties of surimi gels from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix)[J].Modern Food Science and Technology, 2017, 33(2):129-135.
[14] 张怡, 陈秉彦, 曾红亮, 等.肌原纤维蛋白与鱼糜凝胶特性相关性概述[J].亚热带农业研究, 2016, 12(1):13-24.
ZHANG Y, CHEN B Y, ZENG H L, et al.Research progress on the correlation between myofibrillar protein and gel properties in surimi[J].Subtropical Agriculture Research, 2016, 12(1):13-24.
[15] 杨明. 马铃薯淀粉及转谷氨酰胺酶对鲤鱼肌原纤维蛋白功能特性的研究[D].哈尔滨:东北农业大学, 2014.
YANG M.Effects of potato starches and transglutaminase on the functional properties of common carp myofibrillar protein[D].Harbin:Northeast Agricultural University, 2014.
[16] YU N N, XU Y S, JIANG Q X, et al.Molecular forces involved in heat-induced freshwater surimi gel:Effects of various bond disrupting agents on the gel properties and protein conformation changes[J].Food Hydrocolloids, 2017, 69 (8):193-201.
[17] MOTOKI M, KUMAZAWA Y.Recent research trends in transglutaminase technology for food processing[J].Food Science and Technology Research, 2000, 6(3):151-160.
[18] LUO K, SHEN H X, PAN D D, et al.Gel properties of surimi from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) as affected by heat treatment and soy protein isolate[J].Food Hydrocolloids, 2008, 22 (8):1 513-1 519.
[19] 王丽丽, 杨文鸽, 徐大伦, 等.外源添加物对鱼糜及其制品凝胶性能影响的研究[J].核农学报, 2015, 29(10):1 985-1 990.
WANG L L, YANG W G, XU D L, et al.Effects of exogenous additives on gel properties of surimi and its products[J].Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2015, 29(10):1 985-1 990.
[20] 李金玲, 叶蕾蕾, 尤娟, 等.鲢内源性转谷氨酰胺酶的纯化及其性质[J].华中农业大学学报, 2018, 37(6):105-112.
LI J L, YE L L, YOU J, et al.Purification and some enzymatic properties of transglutaminase from silver carp[J].Journal of Huazhong Agricultural University, 2018, 37(6):105-112.
[21] 娄忠纬, 徐坤华, 王潇, 等.鳙内源性转谷氨酰胺酶特性的研究[J].南方水产科学, 2014, 10(6):72-77.
LOU Z W, XU K H, WANG X, et al.Characteristics of transglutaminase from bighead carp[J].South China Fisheries Science, 2014, 10(6):72-77.
[22] MOTOKI M, SEGURO K.Transglutaminase and its use for food processing[J].Trends in Food Science & Technology, 1998, 9(5):204-210.
[23] 严菁. 转谷氨酰胺酶对淡水鱼糜凝胶特性的影响[D].武汉:华中农业大学, 2003.
YAN J.Effect of transglutaminase on gel properties of freshwater fishes[D].Wuhan:Huazhong Agricultural University, 2003.
[24] 贾雅. 转谷氨酰胺酶对脆性鱼糜制品品质的影响[D].武汉:华中农业大学, 2011.
JIA Y.Effects on qualities of crispness surimi-based product by transglutaminase[D].Wuhan:Huazhong Agricultural University, 2011.
[25] 刘海洲, 吴小飞, 牛佰慧, 等.脂肪酶在食品工业中的应用与研究进展[J].粮食加工, 2008, 33(5):55-57.
LIU H Z, WU X F, NIU B H, et al.The application and recent research progress of lipase in food industry[J].Grain Processing, 2008, 33(5):55-57.
[26] 杨华, 张晓伟, 刘慧, 等.鲶鱼鱼糜凝胶质构特性的研究[J].食品研究与开发, 2011, 32(6):52-57.
YANG H, ZHANG X W, LIU H, et al.The character study of catfish gel structure[J].Food Research and Development,2011, 32(6):52-57.
[27] 苏瑞华. 脂肪酶对鲶鱼鱼糜凝胶特性的影响及机制[D].无锡:江南大学, 2019.
SU R H.Effects and mechanism of lipase on gel properties of surimi gels from catfish[D].Wuxi:Jiangnan University, 2019.
[28] 徐毅. 泥鳅肌原纤维蛋白功能性质及鱼糜凝胶特性的研究[D].重庆:西南大学, 2016.
XU Y.Study on Loach myofibrillar protein functional properties and surimi gel properties[D].Chongqing:Southwest University, 2016.
[29] 王玉凤. 鲢鱼鱼糜加工关键工艺的研究[D].青岛:中国海洋大学, 2014.
WANG Y F.The study of the key technologies of silver carp surimi[D].Qingdao:Ocean University of China, 2014.
[30] 彭晶. 菜籽蛋白的制备及其对白鲢鱼糜凝胶特性的影响[D].武汉:华中农业大学, 2017.
PENG J.Study on the preparation of rapeseed protein and its effect on the gelation of silver carp surimi[D].Wuhan:Huazhong Agricultural University, 2017.
[31] 周爱梅, 曾庆孝, 刘欣, 等.两种蛋白类添加剂对鳙鱼鱼糜凝胶特性的改良[J].华南理工大学学报(自然科学版), 2005(4):87-91.
ZHOU A M, ZENG Q X, LIU X, et al.Improvement of gel properties of bighead (Aristichthy nobilis) surimi by two protein additives[J].Journal of South China University of Technology(Natural Science Edition), 2005(4):87-91.
[32] 李景敏, 于楠楠, 李芮洋, 等.羊血浆蛋白对鲢鱼鱼糜凝胶特性的影响[J].食品与发酵工业, 2019, 45(19):84-89.
LI J M, YU N N, LI R Y, et al.Effect of sheep plasma protein on the gel characteristics of silver carp surimi[J].Food and Fermentation Industries, 2019, 45(19):84-89.
[33] 雷雨. 猪血浆蛋白改善鲢鱼鱼糜品质及机理的研究[D].无锡:江南大学, 2014.
LEI Y.The quality and mechanism of silver carp surimi improved by porcine plasma protein[D].Wuxi:Jiangnan University, 2014.
[34] 施珍珍, 陈舜胜, 王慧.卵清蛋白对白鲢鱼糜凝胶性能的影响[J].食品与发酵工业, 2015, 41(12):70-74.
SHI Z Z, CHEN S S, WANG H.Effect of egg white on gel properties of silver carp surimi[J].Food and Fermentation Industries, 2015, 41(12):70-74.
[35] 吴雪微. 常温即食鲢鱼糜制品的加工技术研究[D].无锡:江南大学, 2017.
WU X W.Study on processing technology of ready-to-eat silver carp surimi product stored at ambient temperature[D].Wuxi:Jiangnan University, 2017.
[36] MILES M J, MORRIS V J, ORFORD P D, et al.The roles of amylose and amylopectin in the gelation and retrogradation of starch[J].Carbohydrate Research, 2014, 135(2):271-281.
[37] 张本山, 刘培玲.几种淀粉颗粒的结构与形貌特征[J].华南理工大学学报(自然科学版), 2005(6):68-73.
ZHANG B S, LIU P L.Structures and appearances of several different starch granules[J].Journal of South China University of Technology(Natural Science Edition), 2005(6):68-73.
[38] SAMEH A K, KAMAL A, SOBIA N, et al.Chemically modified starch and utilization in food stuffs[J].International Journal of Nutrition and Food Sciences, 2016, 5(4):264-272.
[39] 米红波, 王聪, 苏情, 等.变性淀粉对白鲢鱼鱼糜凝胶特性和蛋白构象的影响[J].中国食品学报,2021,21(1):72-80.
MI H B, WANG C, SU Q, et al.Effect of modified starch on gel properties and protein conformation of surimi from silver carp[J].Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology,2021,21(1):72-80.
[40] RAMIREZ J A, URESTI R M, VELAZQUEZ G, et al.Food hydrocolloids as additives to improve the mechanical and functional properties of fish products:A review[J].Food Hydrocolloids, 2011, 25(8):1 842-1 852.
[41] 兰冬梅. 食品胶—鱼肉蛋白复合热凝胶体系的形成及机理研究[D].湛江:广东海洋大学, 2016.
LAN D M.Study on formation and mechanism of heat-induced gel from food hydrocolloids-fish protein mixture[D].Zhanjiang:Guangdong Ocean University, 2016.
[42] 郭培. 罗非鱼鱼皮明胶在鱼糜制品中的应用研究[D].海口:海南大学, 2016.
GUO P.Study on the application of tilapia fish skin gelatin in surimi products[D].Haikou:Hainan University, 2016.
[43] 王聪. 淀粉和亲水胶体对白鲢鱼鱼糜凝胶特性的增效作用研究[D].锦州:渤海大学, 2019.
WANG C.Synergistic effect of starch and hydrocolloid on gel properties of silver carp surimi[D].Jinzhou:Bohai University, 2019.
[44] 魏小红. 三种植物提取物对鱼糜凝胶特性的影响[D].荆州:长江大学, 2016.
WEI X H.Effect of three plant extractive on surimi gelatin characters[D].Jingzhou:Yangtze University, 2016.
[45] 于加美. 不同脱乙酰度魔芋葡甘聚糖对鲢鱼糜凝胶特性的影响研究[D].镇江:江苏大学, 2019.
YU J M.Effect of konjac glucomannan with different degrees of deacetylation on gel properties of silver carp surimi[D].Zhenjiang:Jiangsu University, 2019.
[46] 张茜. 壳聚糖对淡水鱼糜凝胶特性的影响[D].无锡:江南大学, 2009.
ZHANG Q.Effects of chitosan on the gelling properties of fresh water fish surimi[D].Wuxi:Jiangnan University, 2009.
[47] 孟爽爽. 麸皮膳食纤维的提取及其对鱼糜凝胶特性影响的研究[D].武汉:华中农业大学, 2016.
MENG S S.Study on the extraction of dietary fiber from wheat bran and its effect on the gel properties of surimi[D].Wuhan:Huazhong Agricultural University, 2016.
[48] 米红波, 王聪, 赵博, 等.大豆油、亚麻籽油和紫苏籽油对草鱼鱼糜品质的影响[J].食品工业科技, 2017, 38(18):60-64;73.
MI H B, WANG C, ZHAO B, et al.Effects of soybean, flaxseed and perilla seed oils on the quality of grass carp (Ctenopharyngodon idellus) surimi gels[J].Science and Technology of Food Industry, 2017, 38(18):60-64;73.