冷冻面团技术是20世纪50年代发展起来的面点新工艺，是运用冷冻原理与技术对面胚半成品进行冷冻处理并冷冻保藏一段时间，待用时解冻，再衔接后续加工流程生产出成品[1]；相对传统的面点加工和销售方式，冷冻面团相关产品具有安全、方便、利于标准化、适合连锁生产等特点，在中央厨房模式和连锁经营概念日益普及的背景下，是我国传统发酵面制品工业化的必然趋势。然而，由于在整形、醒发、烘烤(蒸制)流程的某个环节加入了冷冻贮藏工序，冷冻环节不可避免地会影响面团品质[2-3]。关于冷冻损害面团品质的机理，目前普遍认为是冰晶形成导致面团中酵母菌死亡、面筋网络结构破坏、水分状态改变等[4-6]。目前，添加合适的抗冻保护剂仍是改善面团冷冻损害的最有效途径，因此，研究和开发高效抗冻剂具有重要的现实意义。
抗冻蛋白(肽)具有热滞活性、修饰冰晶、抑制冰晶重结晶、保护细胞膜等特性[7-8]，近年来在提高酵母耐冻性能和改善冷冻面团品质方面的研究受到了广泛关注[9]。如JIA等[10]从女贞叶中分离到一种热稳定性冰结构蛋白，能降低酵母菌冷冻过程中的胞内冰晶形成和还原性物质释放，从而提高酵母菌冷冻存活率；DING等[11]报道了大麦抗冻蛋白能改善面团的热性能，限制水分的迁移，对冷冻面团具有很好的保护效果；GONG等[12]最近从丝胶蛋白水解物中筛选到一种丝胶肽，能显著降低冷冻面团的游离水含量、提高酵母的存活率。然而，目前很多天然的抗冻蛋白(肽)或处在实验室研究阶段，或存在产量低、价格昂贵、热稳定性差等问题，仍需要解决其面临的产业化问题。本研究以商品化的鱼鳞胶原肽为对象，研究其对冷冻面团酵母存活率和冷冻面团的品质指标的影响，为鱼胶原肽在冷冻面团中的应用奠定基础，也为冷冻面团工业生产化中抗冻剂的筛选提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鱼胶原肽(来自鱼鳞，分子质量500～3 000 Da)，海南华研胶原科技有限公司；高筋小麦粉(蛋白质11.1 g/100g，脂肪1.5 g/100g，碳水化合物75.3 g/100g)，克明面业股份有限公司；高活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司；海藻糖(≥98%)，上海笛柏化学品技术有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar, PDA)培养基，广东环凯微生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
PE9600 WT面包机，柏翠电器有限公司；UKOEO-F150醒发箱，珠海家宝德科技有限公司；YXD-Z204电热烤箱，广州三鼎金属制品有限公司；UV 102PC紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 酵母菌悬液的制备
称取干酵母1.0 g，分散于100 mL无菌水中，置于恒温摇床28 ℃、120 r/min活化30 min；量取9.0 mL，加入1.0 mL不同质量浓度(0、20、40、60、80 g/L)的鱼胶原肽溶液和40 g/L海藻糖溶液(阳性对照)作为抗冻剂，混合均匀即为酵母菌悬液。
1.3.2 酵母菌存活率的测定
将上述酵母菌悬液进行0～6次冻融循环处理(-18 ℃冷冻18 h，4 ℃解冻6 h为1次冻融循环)，参考熊思佳等[13]的方法，分别测定悬液经0、2、4、6次冻融循环后的酵母菌存活率，根据存活率大小分析鱼胶原肽对酵母菌的抗冻保护效果及其适合添加质量浓度。
1.3.3 冷冻面团的制备
空白组面团配方：面粉200 g、去离子水100 g、白砂糖10 g、食盐2 g、干酵母0.8 g；阳性对照组和实验组面团分别以同样质量的海藻糖溶液(40 g/L)和胶原肽溶液(60 g/L)替代去离子水。
按配方称取面粉、白砂糖、食盐、干酵母，混合均匀置于面包机中，加入水或抗冻剂溶液，自动和面15 min，面团分成若干个30 g的小面团，放入面包模具中压实，分别进行0～6次冻融循环(-18 ℃冷冻18 h，4 ℃解冻6 h)后测定相关指标。
1.3.4 鱼胶原肽对冷冻面团相对发酵力的影响
参照GB/T 20886—2007《食品加工用酵母》[14]，采用排水法测定30 g冷冻面团发酵180 min产生的CO2，以CO2体积表示面团中酵母菌的发酵力，其与相应面团0次冻融循环时发酵力的比值表示为相对发酵力。
1.3.5 鱼胶原肽对冷冻面团烘焙特性的影响
面团冻融处理0～6次循环，置于醒发箱中醒发4 h，参照郭星辛等[15]的方法放入预热的烤箱烘烤15 min，室温冷却30 min后测定面包比容和质构。其中，面包比容参照GB/T 20981—2007《面包》[16]采用排菜籽法测定；面包弹性采用质构仪测定[15]。
1.3.6 冷冻面团中湿面筋含量的测定
湿面筋含量参考GB/T 5506.1—2008《小麦和小麦粉 面筋含量》[17]采用手洗法测定。取30 g冷冻面团于200 mL的去离子水中，先静置20 min后用手揉搓面团，期间不断的更换去离子水直至洗涤面团的水无淀粉检出，排水后称重，得湿面筋质量m，湿面筋含量按公式(1)计算：
湿面筋含量
(1)
1.3.7 面筋中巯基含量的测定
将1.3.6中得到的湿面筋，置于-70 ℃预冻过夜，冻干后以粉碎机打碎，过120目筛。粉末参照WANG等[18]的方法分析其活性巯基含量。
1.3.8 数据处理与统计分析
每组试验进行3个平行，以
表示，结果以Microsoft Excel 2010软件计算并绘图；3组样本均数以SPSS 26.0软件进行方差分析，先进行Welch检验(α=0.05)，方差齐者用LSD进行两两比较，方差不齐者用Dunnet-T3分析，结果以小写字母在图表中标注，不同字母表示不同处理样本在相同冻融循环次数时差异显著(P<0.05)，未标注字母则表示各组样本差异不显著。
2 结果与分析
2.1 鱼胶原肽对酵母菌抗冻保护作用
鱼胶原肽对酵母菌悬液冻融过程中酵母菌存活率的影响如图1所示。可见，随着冻融次数的增加，酵母菌存活率逐渐下降，6次冻融循环后，鱼胶原肽组酵母菌存活率为39%，与阳性对照海藻糖组(40%)相当，显著高于(P<0.05)空白组(9%)。郭星辛等[15]将鱼胶原肽作为抗冻剂应用于冷冻面团中，发现6次冻融循环后面团中酵母菌存活率为61%，与海藻糖组(61%)相当。可见，上述结果表明鱼胶原肽对悬液和面团中的酵母菌细胞均具有较好的抗冻保护作用。大量研究已证实来自鱼皮、鱼鳞等的胶原肽能通过羟基及疏水相互作用与冰晶表面结合，减少冰晶的生长，防止细胞膜蛋白变性，从而显示出良好的微生物抗冻保护活性，而且其分子质量主要分布在<3 000 Da 的范围内[19-21]，这与本研究的结果相符。
图1 鱼胶原肽对酵母菌冻融处理后存活率的影响
Fig.1 Effect of fish collagen peptides on the survival rate of yeast with freeze-thaw treatment 注：图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.2 鱼胶原肽质量浓度对酵母菌冻融存活率的影响
将不同质量浓度的鱼胶原肽加入酵母菌悬液中，冻融处理后酵母菌的存活率见图2。可见，随着冻融循环次数增加，酵母菌存活率均呈现下降的趋势，但添加鱼胶原肽能明显提高悬液中酵母菌存活率，其中质量浓度为60 g/L时酵母菌存活率最高(47%)，显著高于空白(0 g/L)组(9%)。此外，鱼胶原肽质量浓度为80 g/L时酵母菌存活率反而较60 g/L时有所降低，可能是因为其质量浓度过大使酵母菌处于高渗透压环境中，导致部分细胞失水过多死亡[22]。
图2 鱼胶原肽质量浓度对酵母菌冻融处理后存活率的影响
Fig.2 Effect of concentration of fish collagen peptides on the survival rate of yeast with freeze-thaw treatment
2.3 鱼胶原肽对冷冻面团相对发酵力的影响
将鱼胶原肽作为抗冻剂加入冷冻面团，分析其对面团冻融循环处理后酵母菌发酵力的影响，结果见图3。随着冻融循环次数增加，面团中酵母菌的相对发酵力呈下降趋势；6次冻融循环后，鱼胶原肽组相对发酵力为0.47，与海藻糖组(0.49)差异不大(P>0.05)；而空白组仅为0.27，显著低于另外2组(P<0.05)。这与图1中结果一致，表明添加胶原肽提高了冷冻面团中酵母菌的存活率，从而较好地保留了其发酵力，这与GONG等[12]和郭星辛等[15]的结果一致。
图3 鱼胶原肽对面团冻融处理后相对发酵力的影响
Fig.3 Effect of fish collagen peptides on the relative fermentability of dough with freeze-thaw treatment
2.4 鱼胶原肽对冷冻面团烘焙特性的影响
鱼胶原肽对冷冻面团面包比容和弹性的影响如图4所示，可见，随冻融循环次数的增加，面包比容和弹性逐渐下降。0次冻融循环时，鱼胶原肽组面包的比容为3.3 mL/g，与海藻糖组(3.2 mL/g)相当，高于空白组(2.8 mL/g)；6次冻融循环后，鱼胶原肽组和海藻糖组面包的比容分别降低了16.1%、13.3%，降幅明显低于空白组(18.4%)。面包弹性与比容的变化趋势基本一致，空白组弹性下降最快，6次冻融循环后下降了38.5%，显著高于(P<0.05)鱼胶原肽组(13.8%)和海藻糖组(9.2%)，这与李灵等[23]的研究结果一致。因此，添加鱼胶原肽有利于维持冷冻面团的焙烤特性，这可能是因为鱼胶原肽具有修饰冰晶及抑制重结晶的作用，使面团冷冻过程中生成的冰晶体积小且比较均匀[24]，减缓了冻融循环对面筋结构的破坏。
a-比容；b-弹性
图4 鱼胶原肽对面团冻融处理后面包比容和弹性的影响
Fig.4 Effect of fish collagen peptides on the specific volume and elasticity of bread made from dough with freeze-thaw treatment
2.5 鱼胶原肽对冷冻面团面筋含量的影响
冻融循环次数处理对冷冻面团中湿面筋含量的影响如图5所示。可见，随着冻融次数的增加，面团湿面筋的含量逐渐下降，可能是因为冰晶形成和重结晶导致了面筋蛋白分子质量下降、面筋网络结构机械损伤[25]，从而导致了面筋蛋白分子溶解性的变化。冻融过程中，空白组的湿面筋含量下降幅度最大，6次冻融后，每100 g面团中湿面筋降低了17%，显著高于(P<0.05)胶原肽组(12%)和海藻糖组(13%)，说明鱼胶原肽能防止面团冻融过程中面筋蛋白变化，减缓面筋含量下降。孙丽洁等[21]发现鱼胶原肽具有较强的亲水性，能降低冷冻面团中可冻结水含量，减少冰晶的形成；而且，还能通过形成氢键使面团形成更致密的面筋网络，从而限制水分流失，保护面筋结构[12,23]。
图5 鱼胶原肽对面团冻融处理后面筋含量的影响
Fig.5 Effect of fish collagen peptides on the gluten content in frozen dough with freeze-thaw treatment
2.6 鱼胶原肽对冷冻面团游离巯基含量的影响
巯基通常以二硫键的形式参与到面筋蛋白聚集行为中，维持面筋蛋白的结构和功能[26]。由图6可知，随着冻融次数的增加，面筋蛋白的游离巯基含量逐渐上升。这可能是由于冻融过程中的水分迁移和冰晶重结晶加速了面筋蛋白挤压和分子间相互作用，导致其二硫键发生弱化和断裂[27]；此外，酵母菌细胞在冻融过程中的机械损伤会释放出还原性物质，也会破坏面筋结构中的二硫键[28]。6次冻融循环后，空白组面筋蛋白的游离巯基含量由5.25 μmol/g升至6.58 μmol/g，增加了25%；而鱼胶原肽组和海藻糖组仅增加了8%和9%，显著低于空白组(P<0.05)。这表明在冻融过程中鱼胶原肽和海藻糖均对冷冻面团具有抗冻保护作用，可能其通过抑制冰晶形成和重结晶减弱了冻融过程中面筋和酵母菌细胞的损伤，从而抑制面筋蛋白的解聚和面筋蛋白中二硫键的断裂[5]。
图6 鱼胶原肽对面团冻融处理后游离巯基含量的影响
Fig.6 Effect of fish collagen peptides on the free sulfhydryl content in dough with freeze-thaw treatment
3 结论
鱼胶原肽是一种潜在的冷冻面团抗冻剂，在冻融循环处理过程中对酵母菌细胞和冷冻面团面筋结构均具有良好的抗冻保护效果。结果表明，添加鱼胶原肽能显著提高酵母菌在冻融过程中的存活率，添加鱼胶原肽冷冻面团的相对发酵力、面包比容和弹性均高于空白组。此外，添加鱼胶原肽还可以抑制大分子蛋白的解聚和面筋蛋白中二硫键的断裂。本研究采用的鱼胶原肽是以鱼鳞为原料经蛋白酶解技术获得小分子肽类产品(分子质量范围500～3 000 Da)，能提高冷冻酵母菌的存活率和发酵活力，减缓冷冻面团中面筋结构的破坏，在改良冷冻面团品质方面显示出很好的应用前景，研究结果为促进国内冷冻面团技术的产业化和品质提升提供了有价值的参考。
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