乳酸菌广泛存在于人体的肠道中,能促进动物生长、调节胃肠道菌群,从而调节胃肠道稳态等,常用于食品生产,但在啤酒酿造中却应用很少。在适当的条件下,啤酒可以作为乳酸菌的载体[1]。
在工业啤酒中,乳酸菌常被认为是啤酒腐败菌,影响啤酒口感,乳酸菌污染占啤酒酿造行业报告所有污染的70%。但并不是所有的乳酸菌都是啤酒腐败菌[2]。酵母菌和乳酸菌都可以通过在发酵过程中产生各种风味化合物来增加感官特征[3]。DYSVIK等[4]研究证明,植物乳酸菌与酿酒酵母共发酵酿造的啤酒比对照啤酒增强了果味和干果味。随着消费者对啤酒品质和个性体验需求的提升,导致由小型啤酒生产线生产,且在酿造过程中不添加与调整啤酒风味无关的物质,风味特点突出的工坊啤酒受到了广大消费者的青睐,而口感酸甜且富含乳酸菌的酸啤酒就是其中的一种[5]。工坊啤酒在酒精度和苦味值(以异α-酸计)上远远高于传统工业啤酒,由于缺乏工坊啤酒酿造专用乳酸菌的选育等应用基础研究工作,目前大部分乳酸菌不能耐受工坊啤酒的较高酒精度和高苦味值,导致酸啤酒良莠不齐,质量波动性大,难以达到消费者的心理预期。
本研究主要通过乳酸菌的对酒精度和异α-酸耐受性的分析,结合益生潜力评价,筛选获得1株适用于工坊啤酒酿造用的乳酸菌,并开发一款口感酸甜、醇厚丰满且果香浓郁的工坊啤酒,同时还富含活性乳酸菌,以期进一步拓展乳酸菌在发酵食品中的应用,丰富工坊啤酒的品类。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酸奶,无锡当地超市；大麦麦芽,粤海永顺泰集团股份有限公司；酒花浸膏、酒花颗粒,上海金啤食品原料有限公司；酿酒酵母S-23,实验室保藏；酵母提取物蛋白胨,英国OXOID公司。
1.2 试验方法
1.2.1 乳酸菌的分离
乳酸菌的分离按照KANG等[6]的方法执行。
1.2.2 乳酸菌的初步筛选
将分离得到的乳酸菌进行2次活化(37 ℃,12 h),按体积分数为2%的接种量分别接种于含有5%(体积分数,下同)酒精的MRS培养基中,12 ℃静置培养7 d,每24 h测其OD600。将耐酒精优势菌株2次活化(37 ℃,12 h),按体积分数为2%的接种量分别接种于苦味值为25 BU的MRS培养基中,12 ℃静置培养7 d,每24 h测其OD600。
1.2.3 啤酒酿造用乳酸菌的确定
乳酸菌细胞表面疏水性采用乳酸菌对2种碳氢化合物的黏附的方法执行[7]。乳酸菌人工胃肠液耐受性按照印伯星[8]的方法执行。
1.2.4 啤酒酿造用乳酸菌的鉴定
乳酸菌鉴定采用基于16S rDNA的方法进行[9]。将乳酸菌的16S rDNA序列通过NCBI BLAST与Genebank中已知细菌的16S rDNA序列进行比对。利用MEGA6软件,构建系统进化树[10]。
1.2.5 乳酸菌啤酒的指标测定
将大麦麦芽采用EBU磨进行粉碎,以料水比为1∶5(g∶mL)进行糖化,糖化工艺为：52 ℃保温10 min,升温至65 ℃保温70 min,再升温至72 ℃保温10 min,最后升温至78 ℃保温10 min；糖化结束后过滤,用78 ℃水洗糟；煮沸60 min,期间酒花分3次添加,分别为煮沸0 min投入0.1 g/L马格努门酒花,煮沸45 min时投入0.1 g/L马格努门酒花,煮沸结束投入0.1 g/L卡斯卡特酒花；最终完成12°P定型麦汁。麦汁冷却充氧后同时接种乳酸菌和酵母共同发酵,乳酸菌接种量为2%(体积分数),酵母数量控制在7 lg CFU/mL,12 ℃发酵至日失量小于0.2 g/d；主发酵结束后,4 ℃进行后发酵7 d。
酒精度、真正发酵度、原麦汁浓度、真正浓度参照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》进行测定；pH值由pH计测定；总酸测定参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》；啤酒挥发性物质按照YANG等[11]的方法测定；感官评价由经过训练的20人品尝小组按照100分的方法进行,感官评价标准见表1。
表1 乳酸菌酸啤酒感官评价表
Table 1 Sensory evaluation standards of sour beer
评价指标评价标准评分评价指标评价标准评分外观(20分)澄清、色泽光亮、无悬浮物和沉淀澄清、略微发暗、无悬浮物和沉淀酒体基本澄清、少量悬浮物和沉淀酒体浑浊,有明显悬浮物和沉淀16～2011～156～100～5香味(20分)香味协调、酒香浓郁16～20香气协调、但酒香不浓郁11～15酒香平淡、无异味6～10明显异味、且无酒香0～5泡沫(20分)泡沫细腻、泡持性长泡沫较细腻、泡持性较长泡沫较粗大、泡持性差16～2011～150～10口味(40分)酒体醇厚丰满、风味协调、酸甜可口31～40酒体柔和爽口、风味协调、酸甜适中21～30酒体寡淡、风味不协调、偏酸11～20酒体不协调、有明显异味、过酸0～10
1.2.6 数据分析
实验均重复3 次,数据以平均值±标准偏差表示。采用SOSS 22进行分析,并进行单因素方差分析(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 工坊啤酒酿造用乳酸菌的初步筛选
对酒花颗粒、啤酒发酵液和酸奶中分离得到形态不一,差异性较大的若干株乳酸菌进行酒精和异α-酸耐受性实验,其在酒精和异α-酸存在时的生长曲线如图1所示。乳酸菌在5%的酒精下有较好的生长。对其进行耐高苦味值能力测定,筛选得到7株优势菌株,分别重新命名为J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7(均来自于啤酒发酵液)。异α-酸对乳酸菌生长有较大的抑制作用,它们作为离子载体,在胞质膜上驱散pH梯度,降低质子移动势(proton motive force,PMF)。因此,依赖于PMF的养分吸收受阻,导致细胞死亡[12]。与其他菌株相比,菌株J6在5%酒精度和25 BU苦味值下生长情况均为最佳。
a-耐酒精生长曲线图；b-耐异α-酸生长曲线图
图1 七株优势乳酸菌耐酒精和耐异α-酸测试
Fig.1 Alcohol and iso-α-acid tolerance detection of seven dominant lactic acid bacteria
2.2 乳酸菌的表面疏水性及人工胃肠液耐受性
乳酸菌对肠道上皮细胞的黏附是其定植的前提,而乳酸菌表面疏水性是其黏附能力的重要表征[13]。乳酸菌的细胞表面疏水性结果如图2所示。菌株J5和J6表现出良好的疏水性,其中菌株J6对2种碳氢化合物的黏附率最高。
图2 七株优势乳酸菌表面疏水性
Fig.2 Surface hydrophobicity of seven dominant lactic acid bacteria
为了使乳酸菌更好的发挥其益生作用,它们应该保持较高的胃肠道存活率。菌株J6在人工胃液和人工肠液2 h中的存活率分别达到77.6%和92.4%。刘江等[14]通过从传统发酵食品中分离得到的植物乳杆菌,其在pH=3.0的培养基中16 h的存活率能够达到87.29%,有很好的耐酸性,这与本研究结果一致。菌株J6在人工肠液2和4 h条件下,其存活率没有显著差异(P>0.05),且有很好的存活率。
综合上述实验结果,只有菌株J6在各项指标中表现出较好的结果,其在5%酒精度和25 BU苦味值下生长情况均为最佳,疏水性、人工胃液和人工肠液存活率分别达到81.6%(正辛烷)、77.6%(2 h)和92.4%(2 h)。故选用该菌株作为酸啤酒酿造菌株。进一步采用16S rDNA测序,经过BLAST分析,鉴定其为植物乳杆菌,将其命名为植物乳杆菌J6,构建的进化树如图3所示。
图3 植物乳杆菌J6的系统进化树
Fig.3 Phylogenetic tree of L.plantarum J6
2.3 植物乳杆菌J6在工坊啤酒中的应用
对成品啤酒进行理化指标的测定,结果如表2所示。乳酸菌啤酒与对照啤酒在真正浓度、原麦汁浓度、发酵度和酒精度上没有显著差异性(P>0.05),表明乳酸菌的加入,并不会对啤酒常规理化指标产生影响；这也与前人报道一致,刘彩霞等[15]研究干酪乳杆菌与酿酒酵母共发酵,发酵结束其酒精度与对照啤酒之间没有显著性差异。但在pH和总酸含量这2个指标与对照之间存在着极显著性差异(P<0.01),且在口感上有着明显酸感[16]；马立娟等[17]在研究乳酸乳球菌、干酪乳杆菌和酵母之间的相互作用,发现干酪乳杆菌与酵母混合发酵比纯酵母发酵能够更大幅度的降低其pH。此外,乳酸菌啤酒中还含有7.34 lgCFU/mL的活性乳酸菌,一般认为活性乳酸菌数>7.00 lgCFU/mL是比较满意的水平[18]。乳酸菌啤酒色泽光亮,泡沫细腻,泡持性久,具有口感酸甜,酒体醇厚丰满,香味协调且有更高的果香,得到较高感官评价分,而对照啤酒泡沫较细腻,酒香平淡,口感柔和。
表2 乳酸菌酸啤酒与对照啤酒指标对比
Table 2 Comparison of indexes between sour beer and control sample
理化指标乳酸菌啤酒对照啤酒酒精度/%4.22±0.01a4.18±0.05a真正浓度/°P4.35±0.61a4.25±0.37a原麦汁浓度/°P12.52±0.82a12.38±0.21a发酵度/%66.73±0.26a67.32±0.16apH3.87±0.08a4.65±0.06b总酸/[mL·(100mL)-1]4.09±0.13a1.69±0.11b乳酸菌活菌数/(lgCFU/mL)7.34±0.05\感官评价(分)87.33±2.49a74.00±3.26b
注：同一行小写字母不一样表示有显著性差异(下同)
乳酸菌酸啤酒和对照啤酒发挥性物质浓度对比见表3。从表3可以看出,乳酸菌啤酒的总高级醇和总酯分别达到了149.25和47.60 mg/L,此对照组分别提高了19.48%和28.68%,其中乙酸乙酯和乙酸异戊酯显著提高(P<0.05),比对照分别提高了26.86%和59.31%,这可能由于植物乳杆菌产生的乙酸被酵母代谢,产生了更多的乙酸乙酯和乙酸异戊酯[19]。根据文献报道,乙酸乙酯和乙酸异戊酯与水果味相关[4]。
表3 乳酸菌酸啤酒和对照啤酒挥发性物质浓度
Table 3 Concentration of volatile compounds in sour beer and control sample
酯乳酸菌啤酒/(mg·L-1)对照啤酒/(mg·L-1)高级醇乳酸菌啤酒/(mg·L-1)对照啤酒/(mg·L-1)乙酸乙酯44.11±0.93a34.77±0.45b异丁醇15.21±1.51a12.24±0.89b乙酸异戊酯2.31±0.08a1.45±0.09b异戊醇90.04±1.18a75.58±1.87b乙酸苯乙酯1.03±0.08a0.60±0.02b苯乙醇44.00±3.24a37.09±0.08b辛酸乙酯0.04±0.00a0.04±0.00a总高级醇149.25124.91癸酸乙酯0.11±0.01a0.13±0.01b总酯47.6036.99
3 结论
分离得到1株具有耐高酒精度和耐高苦味值的植物乳杆菌J6,体外益生潜力评价表明,该菌对正辛烷和正十六烷的疏水性分别是81.6%、80.0%,在人工胃液和人工肠液2 h存活率分别是77.6%、92.4%。同时,在与酿酒酵母混合发酵时有更好的感官评价,泡沫细腻,泡持性久,口感酸甜,酒体醇厚丰满,香味协调,总高级醇和总酯含量分别达到了149.25和47.60 mg/L,更重要的是,还富含活性乳酸菌,大大提高了啤酒的营养价值,符合当今消费者的需求。
[1] CHAN M Z,CHUA J Y,LIU S Q,et al.Survival of probiotic strain Lactobacillus paracasei L26 during co-fermentation with Saccharomyces cerevisiae for the development of a novel beer beverage[J].Food Microbiology,2019,82:541-550.
[2] SAKAMOTO K,KONINGS W N.Beer spoilage bacteria and hop resistance[J].International Journal of Food Microbiology,2003,89(3):105-124.
[3] PEYER L C,ZARNKOW M.Sour brewing:Impact of Lactobacillus amylovorus FST2.11 on technological and quality attributes of acid beers[J].Journal of the American Society of Brewing Chemists,2018,75(3):207-216.
[4] DYSVIK A,LILAND K H,MYHRER K S,et al.Co-fermentation involving Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus species tolerant to brewing-related stress factors for controlled and rapid production of sour beer[J].Frontiers in Microbiology,2020,11;279.
[5] JAEGER S R,WORCH T,PHELPS T,et al.Effects of “craft” vs.“traditional” labels to beer consumers with different flavor preferences:A comprehensive multi-response approach[J].Food Quality and Preference,2021,87:104 043.
[6] KANG W L,PAN L N,PENG C,et al.Isolation and characterization of lactic acid bacteria from human milk[J].Journal of Dairy Science,2020,103:9 980-9 991.
[7] PANICKER A S,ALI S A,ANAND S,et al.Evaluation of some in vitro probiotic properties of Lactobacillus fermentum strains[J].Journal of Food Science and Technology-Mysore,2018,55(7):2 801-2 807.
[8] 印伯星.副干酪乳杆菌的分离鉴定及肠道耐受性研究[J].中国乳品工业,2019,47(5):4-7.
YIN B X.Isolation,identification,and growth tolerance characteristic of Lactobacillus paracasei[J].China Dairy Industry,2019,47(5):4-7.
[9] 陈明, 柯文灿,张娟,等.青藏高原牦牛酸奶中具有抗氧化活性乳酸菌的体内外益生特性[J].食品科学,2017,38(23):178-183.
CHEN M,KE W C,ZHANG J,et al.Probiotic properties in vitro and in vivo of antioxidative lactic acid bacteria from yak yogurt in tibetan plateau[J].Food Science,2017,38(23):178-183.
[10] 左丽丽, 高永欣,王钰涓,等.传统发酵豆酱中乳酸菌的分离及鉴定[J].中国调味品,2020,45(11):117-120.
ZUO L L,GAO Y X,WANG Y J,et al.Separation and identification of lactic acid bacteria in traditionally fermented soybean paste[J].China Condiment,2020,45(11):117-120.
[11] YANG H R,ZONG X Y,CUI C,et al.Peptide(Lys-Leu)and amino acids(Lys and Leu)supplementations improve physiological activity and fermentation performance of brewer’s yeast during very high-gravity(VHG)wort fermentation[J].Biotechnology and Applied Biochemistry,2018,65(4):630-638.
[12] SUN Z,XU J X,REN W J,et al.Hop bitter acids inhibit carbohydrate metabolism,enhance biogenic amine metabolism and alter L-malic acid,glutamic acid and arginine metabolism of Lactobacillus brevis 49[J].International Journal of Food Science and Technology,2019,54(2):361-367.
[13] FALAH F,VASIEE A,BEHBAHANI B A,et al.Evaluation of adherence and anti-infective properties of probiotic Lactobacillus fermentum strain 4-17 against Escherichia coli causing urinary tract infection in humans[J].Microbial Pathogenesis,2019,131:246-253.
[14] 刘江, 程群,王振兴,等.云南乳饼中乳酸菌的筛选及其功能活性[J].食品与发酵工业,2020,46(4):160-166.
LIU J,CHEN Q,WANG Z X,et al.Screening and functional activity of lactic acid bacteria in Yunnan milk cake[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(4):160-166.
[15] 刘彩霞, 郭学武,李玲玲,等.高产酯酿酒酵母与乳酸菌共发酵过程中的相互作用研究[J].现代食品科技,2017,33(7):79-84.
LIU C X,GUO X W,LI L L,et al.Interactions of high ester producing Saccharomyces cerevisiae and lactic acid bacteria during co-fermentation[J].Modern Food Technology,2017,33(7):79-84.
[16] OSBURN K,AMARAL J,METCALF S R,et al.Primary souring:A novel bacteria-free method for sour beer production[J].Food Microbiology,2018,70:76-84.
[17] 马立娟, 王超,杜丽平,等.植物乳杆菌和酿酒酵母发酵菠萝汁的性能比较及产物分析[J].中国酿造,2018,37(3):72-77.
MA L J,WANG C,DU L P,et al.Performance comparison and products analysis of pineapple juice fermented by Lactobacillus plantarum and Saccharomyces cerevisiae[J].China Brewing,2018,37(3):72-77.
[18] SOHRABVANDI S,MOUSAVI S M,RAZAVI S H,et al.Viability of probiotic bacteria in low alcohol-and non-alcoholic beer during refrigerated storage[J].Philippine Agricultural Scientist,2010,93(1):104-108.
[19] REID S J,SPEERS R A,WILLOUGHBY N,et al.Pre-fermentation of malt whisky wort using Lactobacillus plantarum and its influence on new-make spirit character[J].Food Chemistry,2020,320:126 605.