芸豆,学名菜豆(Phaseolus vulgaris Linn.sp),属豆科(Leguminosae)菜豆属(Phaseolus),是一年生草本植物的籽粒[1]。我国芸豆种植面积在世界范围内排名第三[2],年总产量约8～9 万t,主要分布在黑、蒙、冀、晋、甘、新、川、滇、黔等地[3]。芸豆中蛋白质含量为17.91%～22.03%,脂肪含量为2.56%～8.46%,总糖含量4.50%～5.42%[4],并且含有丰富的维生素与矿物质[5]。

1945年,BOWMAN[6]首次在芸豆中发现α-淀粉酶抑制剂(α-amylase inhibitor,α-AI),α-AI是一种糖蛋白[7],可与淀粉酶形成复合物,从而有效抑制其活性[8],阻碍碳水化合物水解与消化,进而降低血糖水平[9],可作为降糖控糖食品的原料。芸豆α-AI纯品提取过程复杂、周期长、成本高[10],其水提物提取简单,对α-淀粉酶也具有较强的抑制效果,但其中存在凝集素[9],会促使红细胞凝集,引起小肠表面绒毛细胞病变,影响消化吸收,进而对机体免疫功能造成损害[11]。目前常用降低凝集素活力的方法有热处理[12]、超高压处理[13]、辐照处理[12]以及调控pH[14]等。其中超高压与辐照处理成本较高,且无法完全去除；而热处理及调控pH在去除凝集素活力的同时,也将芸豆α-AI活力完全去除[15],无法在保留提取物α-淀粉酶抑制活力的同时去除凝集活力。

针对目前存在的问题,本研究计划通过在控制pH与温度等条件时,同时添加蛋白酶,在最大程度保留提取物α-淀粉酶抑制活力并去除凝集活力。以花芸豆为原料,α-淀粉酶抑制率与凝集活力为指标,在筛选出最佳用酶的基础上,优化提取物的制备工艺。另外,研究了提取物对日常主食估计血糖生成指数(estimated glycemic index,eGI)的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花芸豆由国家现代农业产业技术体系食用豆体系提供；面包、米饭、白馒头及玉米馒头,当地超市；2%兔血红细胞,上海源叶生物科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶,北京索莱宝生物有限公司；中性蛋白酶、碱性蛋白酶,日本天野酶制品株式会社；α-淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶,美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

CT410旋风式样品磨,福斯赛诺分析仪器(苏州)有限公司;SP-Max 2300A光吸收型全波长酶标仪,上海闪谱生物科技有限公司；LUX-24数显恒温水浴锅,北京陆希科技有限公司；LXJ-ⅡB低速大容量多管离心机,上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 花芸豆粗提物的制备与工艺优化

将经旋风磨磨粉,过60目筛后的花芸豆粉与去离子水以料液比1∶5(g∶mL)的比例混合,室温下搅拌提取2 h,8 000 r/min离心30 min,收集上清液,随后分别加入菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶,根据各蛋白酶最适条件反应1 h,以α-淀粉酶抑制活力与凝集活力为指标确定最佳酶。

以凝集活力与α-淀粉酶抑制率为指标,进行时间(30、60、90、120、150 min)、pH(2、2.5、3、3.5、4)、温度(30、40、50、60、70 ℃)和酶底比(500、1 000、1 500、2 000、2 500 U/g)单因素试验,因为本实验主要目的是制得无凝集活力的花芸豆提取物,因此在单因素试验的基础上,以去除凝集活力为主要目的,兼顾α-淀粉酶抑制率进行L9(34)正交试验。

1.3.2 α-淀粉酶抑制率测定

α-淀粉酶抑制率的测定参考YANG等[16]的方法稍作修改。将0.25 mL猪胰α-淀粉酶溶液(1.5 U/mL)和0.25 mL适当稀释的芸豆提取液在37 ℃水浴中孵育10 min,加入10 g/L可溶性淀粉0.25 mL,准确反应5 min后立刻加入1.0 mL DNS溶液终止反应。将混合物置于沸水浴中10 min,随后在冰浴中冷却至室温,用5 mL去离子水稀释后在540 nm波长处测定吸光度。

1.3.3 凝集活力测定

凝集活力的测定参考HE等[17]的方法稍作修改。在96孔“V”型板的每1孔中加入50 μL 磷酸缓冲盐溶液(10 mmol/L,pH 7.4),在第1孔加入提取液,混匀后取出50 μL加入第2孔,混匀,以此类推,倍比稀释,第12孔取出50 μL溶液弃去,最后在各孔中加入2%兔血红细胞50 μL,4 ℃条件下静置2 h后观察血凝结果。凝集活力按公式(1)计算：

凝聚活力

(1)

式中：n,96孔“V”型板中显示血凝的最高孔数,n=0表示无凝集活力;ρ,样品蛋白质量浓度,mg/mL,V,添加到每孔的样品体积,mL。

1.3.4 总淀粉含量测定

采用Megazyme assays Kit(K-TSTA)试剂盒法测定。

1.3.5 蛋白浓度的测定

采用LORRY法[18],以牛血清蛋白为标准蛋白。

1.3.6 模拟胃肠道处理对提取物α-淀粉酶抑制率的影响

模拟胃肠处理主要参考让一峰等[19]的方法稍作修改。将经过处理后的提取物于37 ℃金属浴中振摇,用1 mol/L HCl溶液调节pH至2并加入胃蛋白酶来模拟胃环境,用1 mol/L NaOH溶液调节pH至8.2并加入胰蛋白酶来模拟肠环境。各反应120 min后回调温度与pH,测定其对α-淀粉酶的抑制率。

1.3.7 血糖生成指数的测定

按照FERRER-MAIRAL等[20]的方法测定血糖生成指数,并做了适当修改。准确称取样品(含淀粉50 mg),添加花芸豆提取物,添加α-淀粉酶,于37 ℃金属浴中振摇2 min,调节pH至2,加入胃蛋白酶,37 ℃金属浴中振摇60 min,中和调节pH,加入α-淀粉酶与胰蛋白酶,在0、10、20、30、60、90、120、180、240 min处取样,沸水浴5 min灭酶活性后离心,取上清液进行葡萄糖含量测定。参考GOI等[21]的方法建立非线性模型,淀粉水解动力学按公式(2)计算：

C=C∞×(1-(exp-kt))

(2)

式中:C,C∞,k分别表示各时间点的淀粉水解率、最终水解率和动力学常数。水解指数(HI)为样品的水解曲线的面积与葡萄糖相应面积的百分比。估计血糖生成指数按公式(3)[22]计算：

eGI=0.862×HI+8.198

(3)

1.3.8 数据分析

实验重复3次,数据为平均值±标准偏差。使用SPSS 21.0软件进行显著性分析,使用Origin 2018进行做图。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶对芸豆提取物α-淀粉酶抑制活力和凝集活力的影响

不同蛋白酶处理结果见表1。在α-淀粉酶抑制活力方面,菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶与中性蛋白酶对提取物抑制活力无显著影响(P>0.05),且凝集活力保留超过95%；碱性蛋白酶处理后,提取物抑制率保留率为80.30%,凝集活力保留超过90%；酸性蛋白酶处理效果较好,提取物α-淀粉酶抑制率保留率为85.89%,推测活力降低的主要原因是酸性环境与温度的协同作用[15],凝集活力降低至6.97%,原因可能是酸性蛋白酶在酶解凝集素的同时,pH对温度诱导的凝集素的失活也具有协同效应[23]。因此,选择酸性蛋白酶进行后续研究。

2.2 花芸豆α-淀粉酶抑制提取物制备工艺优化

2.2.1 pH的影响

在温度50 ℃、时间60 min、加酶量1 000 U/g条件下,研究了pH对花芸豆粗提液α-淀粉酶抑制活力与凝集活力的影响,结果以相对活力表示。如图1所示,在α-淀粉酶抑制活力方面,随着pH在2～4范围内升高,提取物α-淀粉酶抑制活力呈现出先下降后升高的趋势,在pH 3.5时抑制活力保留率最低为87.53%,此时凝集活力保留11.65%。在pH 3条件下,凝集活力保留率最低仅为5.76%,这可能是因为酸与热的协同作用会使粗提物中凝集素活力显著降低[23],同时pH变化过程中酸性蛋白酶活力也发生改变[24]。综合考虑,选择处理pH值为3。

2.2.2 温度的影响

由图2可知,在加酶量1 000 U/g、时间60 min、pH 3条件下,随着温度的升高,花芸豆提取物对α-淀粉酶的抑制活力与凝集活力均呈现降低趋势。当温度为30 ℃,提取物抑制活力与凝集活力保留率约为90%。温度升高至40 ℃,抑制活力变化不显著,凝集活力保留率降低至86.06%。温度>50 ℃时,抑制活力随着温度的升高显著降低(P<0.05),这是因为芸豆α-AI热稳定性较低,随着温度的升高,活力降低[7]。当温度达到70 ℃时,抑制活力保留81.87%。此时凝集活力保留率仅为0.16%。综合考虑,选择温度为70 ℃。

2.2.3 时间的影响

在加酶量1 000 U/g、温度50 ℃、pH 3条件下,处理时间对花芸豆提取液α-淀粉酶抑制活力与凝集活力的影响如图3所示。在60 min内,随着处理时间的增加,提取液对α-淀粉酶的抑制活力呈现降低的趋势,当时间>60 min时,抑制活力不再变化,保留率约为87.22%,此时凝集活力也趋于稳定,不再随着时间的增加而变化,保留率约为5.51%。综合考虑,处理时间选择60 min。

2.2.4 加酶量的影响

在温度50 ℃、时间60 min、pH 3条件下,加酶量对花芸豆提取液α-淀粉酶抑制活力与凝集活力的影响如图4所示。随着加酶量由500 U/g增加到1 000 U/g,花芸豆提取物相对抑制活力与相对凝集活力均显著降低,分别从95.62%和42.18%降低至87.22%和5.31%,随着加酶量的进一步增加,相对抑制活力与相对凝集活力均不再变化,这是因为当底物分子与酶分子百分之百结合的时候,再增加酶的用量也不会对反应造成显著影响[25]。综合考虑,选择加酶量为1 000 U/g。

2.3 正交试验结果

综合单因素试验结果,以相对凝集活力为指标,进行正交试验,结果如表2所示。可以得出去除凝集活力的最佳条件为A1B3C3D2,即pH 2.5、温度70 ℃、时间90 min、加酶量1 000 U/g。

进行验证试验,发现此时血凝板中未出现血凝现象(n=0),即相对凝集活力为0%,表明正交试验结果可靠。各影响因素主次顺序为温度>加酶量>时间>pH。凝集素对人体有害,将其去除是花芸豆提取物应用于食品工业的前提,所以选择A1B3C3D2方法,此时相对抑制率为75.38%,相对凝集活力为0%。方差分析结果表明(表3),各因素对粗提物凝集活力影响显著。

2.4 模拟胃肠道对提取物α-淀粉酶抑制率的影响

无凝集活力花芸豆提取物分别经体外胃、肠环境模拟后,α-淀粉酶抑制率的变化如图5所示,在模拟胃液处理后,抑制率显著降低,从63.15%降低至55.18%,这说明提取物对胃蛋白酶的水解具有一定的抵抗力,仍能保持一定的α-淀粉酶抑制率[26]。模拟肠液处理后,提取物对α-淀粉酶的抑制率变化不显著,与让一峰等[19]的研究结果相符。提取物先后经体外胃环境模拟和体外肠环境模拟后,仍具有53.53%抑制率。总而言之,花芸豆提取物在体外模拟胃、肠环境后仍对α-淀粉酶具有抑制效果,较为稳定。

2.5 花芸豆提取物添加量对日常主食eGI的影响

日常主食淀粉水解度如图6所示,淀粉水解度随着水解时间的增加而增加,然后趋于平衡。面包淀粉水解平衡的时间为120 min,米饭、白馒头和玉米馒头则为180 min。添加了1%～3%的花芸豆提取物后,米饭、白馒头和玉米馒头淀粉水解平衡的时间降低至120 min,同时随着花芸豆提取物添加量的增加,淀粉水解度显著降低,在添加3%提取物后,面包、米饭、白馒头与玉米馒头的水解度分别从77.79%、84.58%、84.91%和77.90%降低至30.48%、40.98%、19.08%和15.12%。说明花芸豆提取物能够有效抑制不同淀粉的水解。

不同提取物添加量对主食eGI的影响如表4所示,面包、米饭、白馒头与玉米馒头的eGI值分别为65.00、71.65、68.17和63.41,其中米饭属于高GI食品,面包、白馒头与玉米馒头属于中GI食品,随着花芸豆提取物的添加,4种主食eGI值都得到显著降低,且随着添加量的增加,eGI值进一步降低,当添加量为3%时,面包、米饭、白馒头与玉米馒头的eGI值分别降低至30.69、39.51、22.30和19.69,属于低GI食品。说明花芸豆提取物可应用于低GI食品中生产中,添加提取物的食品会降低餐后葡萄糖的升高,有益于糖尿病,肥胖症等疾病患者[27]。

3 结论

花芸豆粗提物具有较强的α-淀粉酶抑制活力与凝集活力,比较了菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶与碱性蛋白酶处理对粗提物α-淀粉酶抑制活力与凝集活力的影响,最终选择酸性蛋白酶制备无凝集活力花芸豆提取物。正交试验结果表明,温度70 ℃,pH 2.5,处理时间90 min,加酶量1 000 U/g条件下,花芸豆粗提物的凝集活力被完全去除的同时α-淀粉酶的抑制活力保留75.38%。对花芸豆粗提物凝集活力影响最大的因素是温度。体外模拟胃环境后,花芸豆提取物α-淀粉酶抑制活力显著降低,体外模拟肠环境则无显著影响。花芸豆提取物的添加会显著降低面包、米饭、白馒头与玉米馒头的eGI值,且随着添加量的增加进一步降低。

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Preparation of α-amylase inhibitor without lectin activity from kidney bean and its effect on eGI of staple food

WANG Yunji1,LIU Liya2,TONG Litao2,LI Yan1,QIAN Haifeng1,ZHOU Sumei2,WANG Li1*

1(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China) 2(Institute of Food Science and Technology,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China)

ABSTRACT To produce the α-amylase inhibitor without lectin activity from kidney beans, the effect of the extract on the estimated glycemic index(eGI)of staple food was investigated.The results showed that the acid protease had the best lectin removal activity from kidney bean extract.The process was optimized as follows: enzyme dosage of 1 000 U/g, pH 2.5 and 90 min hydrolysis at 70 ℃.In this condition, the lectin activity of the kidney bean extract was completely eliminated and the inhibitory activity of α-amylase remained 75.38%.The α-amylase inhibitory of extract remained 87.37% in simulated gastric environment, while the simulated intestinal environment had no effect on it.When 3% of the kidney bean α-amylase inhibitor was added, the eGI of bread, rice, steamed bread and corn steamed bread reduced from 65.00, 71.65, 68.17 and 63.41 to 30.69, 39.51, 22.30 and 19.69, respectively.Consequently, the kidney bean extract could be used to produce low glycemic index food, which was helpful for utilization of kidney beans.

Key words kidney bean; lectin; α-amylase inhibition; estimated glycemic index

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.026521

引用格式:汪云吉,刘丽娅,佟立涛,等.无凝集活力花芸豆α-淀粉酶抑制剂提取物的制备及其对主食eGI的影响[J].食品与发酵工业,2021,47(13):112-118.WANG Yunji,LIU Liya,TONG Litao,et al.Preparation of α-amylase inhibitor without lectin activity from kidney bean and its effect on eGI of staple food[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(13):112-118.

第一作者：硕士研究生(王立教授为通讯作者，E-mail：wl0519@163.com)

基金项目：国家现代农业产业技术体系专项资金项目(CARS-08-G19)

收稿日期：2020-12-23,改回日期：2021-01-06