铅是一种有蓄积性毒性的非必需金属,在土壤、空气和水中均能稳定存在。铅通过消化道进入机体后,一部分可通过尿液和粪便排泄排出体外,剩余部分则被肠道吸收后随血液循环作用于各个靶器官。铅在体内能与酶官能团及高亲和力金属结合蛋白(如铅结合蛋白和金属硫蛋白)相互作用,进而介导铅与酶的相互作用[1]。同时,铅还能和人体多种必需微量元素竞争肠道吸收位点、酶作用靶点等诱导机体产生大量活性氧,破坏蛋白质、核酸和脂质,导致细胞死亡[2],从而引起相关疾病发生。
目前公认的铅中毒螯合剂主要有依地酸二钠钙和二巯基琥珀酸,但伴有中性粒细胞减少、肠胃不适、必需矿物质排泄以及肾功能障碍等副作用[3-4],故不适合长期高剂量服用。植物乳杆菌CCFM8661是江南大学食品生物技术中心研发团队从泡菜中筛选到的一株益生菌,并通过生理特性、动物体内实验以及细胞实验三方面对其进行了缓解铅毒性功能评价及其机制解析,发现CCFM8661对铅的吸附具有高效性和稳定性,同时,其对铅的耐受能力较强,可通过保护肠道屏障和缓解脂质过氧化反应减少铅对机体的损伤[5-6]。
植物蛋白主要包括从豆类和水稻中提取的大豆蛋白及大米蛋白,由于其氨基酸组成、营养素组成以及其他活性物质,不仅营养充足,同时还具有多种功效,可以调节糖尿病、心脏病、慢性肾病以及重金属损伤等多种急性和慢性疾病[7-9]。同时,重金属可以与大米蛋白上的巯基结合,从而降低重金属的生物利用率[10]。研究表明,植物乳杆菌发酵植物类食品,可以提高植物乳杆菌的活力和食物的抗氧化能力[11],植物蛋白和植物乳杆菌共培养可能会提高菌体活性,进而提升其功能特性。通过不同植物蛋白与CCFM8661进行复配,探究不同复配方式对其铅毒性缓解能力的影响。同时,市面上缺乏具有排铅功能的复合膳食补充剂产品,本研究在发现植物乳杆菌CCFM8661具有缓解铅毒性的基础上,开发提高其铅毒性缓解功效的新膳食配方,以期为市场应用提供指导。
1 材料与方法
1.1 动物实验设计
将78只3周龄的雄性C57BL/6 J小鼠随机分为8组,如表1所示。空白组实验动物正常饮食饮水,每天灌胃0.2 mL脱脂乳溶液；染铅组、CCFM8661组、CCFM8661+大豆蛋白、CCFM8661+大米蛋白、大豆蛋白组、大米蛋白组和DMSA高剂量组饮用醋酸铅溶液(铅离子质量浓度为1 g/L),持续8周,第9周换成普通饮水[12]。前8周饮用铅水同时,染铅组、二巯丁二酸(dimercaptosuccinic acid,DMSA)组每天灌胃0.2 mL脱脂乳,CCFM8661组每天灌胃0.2 mL活菌数为1×109 CFU的菌悬液；CCFM8661+大豆蛋白组每天灌胃0.2 mL活菌数为1×109 CFU的菌悬液,大豆蛋白灌胃剂量为8 g/kg；大豆蛋白组每天灌胃0.2 mL,其大豆蛋白灌胃剂量为8 g/kg；CCFM8661+大米蛋白组每天灌胃0.2 mL活菌数为1×109 CFU的菌悬液,大米蛋白灌胃剂量为8 g/kg；大米蛋白组每天灌胃0.2 mL,其大米蛋白灌胃剂量为8 g/kg。第9周普通饮水同时,DMSA组每天灌胃0.2 mL,质量浓度为10 mg/mL的DMSA溶液,其他组均灌胃等体积的PBS溶液。本实验中,CCFM8661、大豆蛋白、大米蛋白的给药剂量在前人研究的基础上,结合相关预实验结果进行了调整[13-15]。在实验的前期、中期、后期分别单独收集每只小鼠的粪便,实验结束前进行行为学实验,实验结束后,牺牲小鼠并采集血液和组织样品,置于-80 ℃储存。
表1 动物实验方案
Table 1 Protocol of animal experiment
组别实验时间0～8周9周空白组(n=7)脱脂乳+普通水无菌PBS+普通水染铅组(n=7)脱脂乳+铅水无菌PBS+普通水CCFM8661(n=7)CCFM8661+铅水无菌PBS+普通水CCFM8661+大豆蛋白(n=15)CCFM8661+大豆蛋白+铅水无菌PBS+普通水CCFM8661+大米蛋白(n=15)CCFM8661+大米蛋白+铅水无菌PBS+普通水大豆蛋白(n=10)大豆蛋白+铅水无菌PBS+普通水大米蛋白(n=10)大米蛋白+铅水无菌PBS+普通水DMSA高剂量(n=7)脱脂乳+铅水DMSA高剂量溶液+普通水
1.2 小鼠行为学指标的测定
1.2.1 小鼠避暗实验
参照FERLEMI等[16]与LU等[17]的方法,测定小鼠的避暗潜伏期(小鼠第1次完全进入暗室的时间)与进入暗室的次数(错误次数)。
1.2.2 小鼠水迷宫实验
参照RIBES等[18]的报道进行测定,记录小鼠1 min内的游泳轨迹,以用于考察小鼠对原平台的记忆。
1.3 小鼠粪便、血液及组织中铅含量的测定
按照ZHAI等[19]的方法称取适量粪便、血液、组织样品置于微波消解罐,加入适量浓硝酸,使用微波消解系统进行消化后,再使用石墨炉或火焰原子吸收分光光度计测定样品中铅含量。
1.4 小鼠组织氧化应激指标测定
按试剂盒说明书要求,对小鼠肝脏、肾脏中SOD活性和MDA含量进行检测。
1.5 小鼠组织细胞因子及免疫球蛋白含量测定
取小鼠空肠及结肠,研磨离心后取上清液,按照试剂盒说明书测定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和sIgA的含量。
1.6 小鼠肠道菌群结构组成分析
参考MAO等[20]的研究,在实验结束前,每只小鼠分别收集500 mg粪便,并对其粪便菌群提取测定。参照毛丙永[21]的方法,对下机数据进行处理。在Qiime平台计算样品的α多样性和β多样性。
2 结果与讨论
2.1 CCFM8661+植物蛋白膳食补充剂对小鼠的学习和记忆能力的影响
如图1所示,染铅组进入暗室的时间与空白组有显著差异,说明铅暴露可损伤机体的神经系统。大豆蛋白及CCFM8661+大豆蛋白有提高避暗潜伏期的趋势,但并不具备显著性,说明这2种膳食干预方法不能显著缓解铅暴露对小鼠学习及记忆能力的干扰。而膳食干预组中CCFM8661(99.04 s)及CCFM8661+大米蛋白(176.16 s)可提高避暗潜伏期,有效缓解铅暴露对小鼠智力的损害,其中CCFM8661+大米蛋白效果最优,甚至显著高于DMSA药物治疗组。说明相比于单菌或单一膳食成分,大米蛋白与植物乳杆菌CCFM8661复配具有更强的缓解铅的神经毒性作用的效果。
1-空白组；2-染铅组；3-DMSA组；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白组；8-大米蛋白组
图1 膳食补充剂对铅暴露小鼠避暗潜伏期的影响
Fig.1 Effect of dietary supplements on the dark-avoidance latency of lead-exposed mice
注：柱形图上的a-e表示不同组之间的显著性差异(P<0.05),下同
水迷宫实验结果表明DMSA药物治疗组、CCFM8661组、大豆蛋白组、大米蛋白组、CCFM8661+大豆蛋白及CCFM8661+大米蛋白都可以有效缩短逃逸潜伏期,提高穿越平台的次数以及在目的象限的停留时间(图2)。其中,CCFM8661+大豆蛋白及CCFM8661+大米蛋白缓解神经毒性效果最佳。
1-空白组；2-染铅组；3-DMSA组；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白组；8-大米蛋白组a-第6天的逃逸潜伏期；b-第6天穿越平台次数；c-第6天目的象限与其他象限的时间比
图2 膳食补充剂对铅暴露小鼠水迷宫测试的作用
Fig.2 Effect of dietary supplements on the Morris water maze test in lead exposed mice
2.2 CCFM8661+植物蛋白膳食补充剂对小鼠机体铅含量的影响
如图3所示,相比于铅造模组,大豆蛋白、大米蛋白、植物乳杆菌 CCFM8661以及CCFM8661+大米蛋白组均可以显著增加粪便中铅含量,表明其可促进机体铅排泄。同时,除大米蛋白组的血铅含量、大豆蛋白组和大米蛋白组的肝脏铅含量有下降趋势但不明显外,其余膳食干预组小鼠血液及组织中的铅含量均显著下降,其中CCFM8661+大豆蛋白和CCFM8661+大米蛋白缓解铅毒性的效果最显著。CCFM8661+大豆蛋白在降低血铅、肝铅、脑铅含量方面与DMSA药物治疗组效果相当,CCFM8661+大米蛋白在缓解血液铅含量方面与DMSA给药组达到相同水平,同时2种复合膳食补充剂缓解肾脏铅毒性的能力显著高于DMSA给药组。表明大豆蛋白和大米蛋白与CCFM8661进行复配可以显著降低铅在体内的蓄积。
1-空白组；2-染铅组；3-DMSA组；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白组；8-大米蛋白组a-血液中的铅含量；b-肝脏中的铅含量；c-脑中的铅含量；d-肾脏中的铅含量；e-粪便中的铅含量
图3 膳食补充剂对铅暴露小鼠血液、组织及粪便中铅含量的影响
Fig.3 Effect of dietary supplements on lead content in blood,tissue and feces of mice
研究表明,植物乳杆菌发酵豆乳可有效增强益生菌的活力,提高发酵豆乳中的矿物质和异黄酮的生物利用度,改善机体异常氧化应激及肠道菌群组成[22]。益生菌发酵后的大豆蛋白在微生物酶的作用下,被降解成许多具有新功能的多肽和生物活性物质,从而降低大豆蛋白的免疫反应性[23],提高营养利用率[24]。本研究中的植物乳杆菌CCFM8661和植物性膳食成分大豆蛋白、大米蛋白复配可能也能通过相似机制产生相互作用,从而提高CCFM8661缓解铅毒性的效果。
2.3 CCFM8661+植物蛋白膳食补充剂对小鼠组织氧化应激水平的影响
由图4可知,铅中毒导致小鼠肝脏及肾脏中MDA含量升高、SOD活性下降。药物治疗及膳食成分干预均能显著降低肝脏及肾脏中的MDA含量,其中CCFM8661+大米蛋白效果最明显；此外,补充DMSA及所有膳食成分均能够使小鼠肝脏中SOD活性显著提高,其中大米蛋白复配CCFM8661效果最显著,而肾脏中SOD活性在DMSA药物治疗组、CCFM8661+大豆蛋白组及CCFM8661+大米蛋白组均表现出显著提升,其中大豆蛋白与大米蛋白和CCFM8661的复配效果最显著。
1-空白组；2-染铅组；3-DMSA组；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白组；8-大米蛋白组a-肝脏MDA含量；b-肝脏SOD活性；c-肾脏MDA含量；d-肾脏SOD活性
图4 膳食补充剂对铅暴露小鼠组织氧化应激水平的影响
Fig.4 Effects of dietary supplements on oxidative stress levels in mice exposed to lead
综合以上研究结果,CCFM8661+大米蛋白对恢复铅中毒引起的异常的氧化应激反应效果最明显。这可能因为大米蛋白及其衍生的水解产物和特定的多肽组分具有强大的抗氧化等生物活性功能[25-26],而且植物乳杆菌CCFM8661在铅诱导的氧化应激中发挥了显著的保护作用[13],故与单一组分相比,大米蛋白与植物乳杆菌CCFM8661复配能够更显著的缓解铅中毒引起的脂质过氧化并提高SOD活性。
2.4 CCFM8661+植物蛋白膳食补充剂对小鼠肠道免疫功能的影响
铅暴露可以通过加剧炎症反应破坏免疫屏障,进而损伤机体肠道物理屏障,加速重金属铅进入机体。CCFM8661+植物蛋白对小鼠肠道免疫指标的影响见图5和图6。结果表明铅暴露会增加小鼠肠道IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量,同时降低sIgA含量；除空肠中大豆蛋白组和大米蛋白组的TNF-α含量,以及结肠中的大米蛋白组和CCFM8661+大米蛋白组的IL-1β含量无显著变化外,所有膳食干预组均显著降低了炎症因子含量并增加了sIgA含量。
1-空白组；2-染铅组；3-DMSA组；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白组；8-大米蛋白组a-IL-1β含量；、b-IL-6含量；c-IL-8含量；d-TNF-α含量；e-sIgA的含量
图5 膳食补充剂对铅暴露小鼠结肠细胞因子及sIgA含量的影响
Fig.5 Effects of dietary supplements on cytokines and sIgA content in the colon of mice
1-空白组；2-染铅组；3-DMSA组；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白组；8-大米蛋白组a-IL-1β含量；、b-IL-6含量；c-IL-8含量；d-TNF-α含量；e-sIgA的含量
图6 膳食补充剂对铅暴露小鼠空肠细胞因子及sIgA
Fig.6 Effects of dietary supplements on cytokines and sIgA content in jejunum of mice
在结肠中,大豆蛋白复配CCFM8661相比于单一CCFM8661及大豆蛋白对IL-1β、IL-6和TNF-α的恢复效果更显著,并与DMSA药物治疗恢复至相同水平；同时,相比于单独灌胃CCFM8661和大米蛋白,灌胃CCFM8661+大米蛋白可以显著降低IL-6的含量,并在恢复IL-6、IL-8、sIgA和TNF-α含量方面的效果与DMSA一致或更强。而在空肠中,与灌胃单一组分的膳食成分相比,CCFM8661+大豆蛋白和大米蛋白膳食补充剂显著降低了促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的含量,与DMSA给药组相同,恢复至空白组水平。以上结果说明CCFM8661+大豆蛋白和CCFM8661+大米蛋白可显著缓解铅暴露引起的炎症反应,保护肠道免疫屏障。
研究表明,富含异黄酮的大豆蛋白可以使血浆和肝脏中的TNF-α、IL-1β降低,缓解脂肪肝小鼠的肝脏炎症[27]。大米蛋白水解物可通过抑制TNF-α的释放显示出显著的抗炎和免疫特性,且补充大米蛋白水解物与TNF-α、IL-6和IL-1β的降低呈剂量依赖关系[28]。此外,益生菌已经被证实能够调节肠道炎症,本研究表明相比于单一组分,益生菌分别与大豆蛋白和大米蛋白复配的膳食补充剂能够更加有效缓解铅中毒引起的肠道炎症反应。
2.5 CCFM8661+植物蛋白膳食补充剂对小鼠肠道菌群的影响
由图7可知,经分析有变化的特定门水平发现,染铅组可显著降低了小鼠Actinobacteria和Bacteroidetes的相对丰度,提高了Proteobacteria的丰度,这与ZHAI等[29]的研究结果一致。DMSA给药组可以恢复铅暴露引起的菌群紊乱至正常水平,抑制铅中毒现象。补充CCFM8661+大豆蛋白和CCFM8661+大米蛋白可以使Bacteroidetes和Proteobacteria的含量恢复至空白组水平,与DMSA给药组呈现相同的趋势,说明2种复合膳食补充剂可能通过改善菌群结构保护肠道健康。
1-空白组；2-染铅组；3-DMSA组；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白组；8-大米蛋白组a-Actinobacteria的相对丰度；b-Bacteroidetes的相对丰度；c-Proteobacteria的相对丰度
图7 小鼠肠道菌群门水平上相对丰度的变化
Fig.7 Changes in relative abundance of main phyla in mice
针对小鼠的肠道菌群在属水平上的组成进行进一步分析发现(图8),铅暴露能显著降低了Allobaculum和Bacteroides的相对丰度。MENG等[30]研究报道铜暴露小鼠中Allobaculum、Bacteroides的相对丰度减少,表明肠道免疫反应异常,这与本研究研究结果一致。作为肠道菌膜屏障的组成部分,铅暴露后,参与哺乳动物结肠中黏膜相关代谢的Bacteroides和Allobaculum等在肠道中的含量下降,为肠球菌、肠杆菌等致病菌的侵袭和定殖提供了机会,致病菌产生过量内毒素,导致肠道生态失调,形成恶性循环[31]。与铅造模组相比,补充CCFM8661+大豆蛋白和CCFM8661+大米蛋白可有效恢复上述种属变化,使其接近空白组水平,同时还可显著上调Akkermansia和Pseudomonas的相对丰度。其中Akkermansia具有潜在的免疫调节和抗炎作用[32],也可增强肠黏膜伤口的修复,并诱导紧密连接蛋白的表达[33-34],降低肠道通透性,从而保护肠道屏障。虽然2种复合膳食补充剂的排铅功能与种属的特定变化有一定关联,但具体的关联机制还需进一步研究分析。
1-空白组；2-染铅组；3-DMSA组；4-CCFM8661；5-CCFM8661+大豆蛋白；6-CCFM8661+大米蛋白；7-大豆蛋白组；8-大米蛋白组a-Akkermansia的相对丰度；b-Pseudomonas的相对丰度；c-Allobaculum的相对丰度；d-Bacteroides的相对丰度
图8 小鼠肠道菌群属水平上相对丰度的变化
Fig.8 Changes in relative abundance of main genera in mice
3 结论
综上所述,CCFM8661与植物蛋白复配能够显著增强其铅毒性缓解能力。其中CCFM8661+大豆蛋白促进粪便铅排泄,降低组织铅含量及缓解肠道炎症的效果更显著,这可能由于植物乳杆菌发酵大豆蛋白能显著提高益生菌的活力,促进肠道蠕动,提高粪便铅排泄,而大豆蛋白被降解成多肽和生物活性物质,两者共同改善机体异常氧化应激及肠道菌群组成,保护肠道免疫屏障并阻碍铅被胃肠道吸收利用。此外,补充CCFM8661+大米蛋白能显著缓解铅对神经系统的毒害及肝肾脏的氧化损伤,其主要作用机制可能是通过CCFM8661发酵大米蛋白产生的水解产物和多肽组分具有强大的抗氧化等生物活性功能,而且发酵后活性增强的CCFM8661能通过脑肠轴更好地缓解铅的神经毒性。以上表明,CCFM8661能够与植物蛋白进行复配,并作为一款具有排铅功能的复合膳食补充剂产品进入市场,弥补目前市场上关于这类产品的空白。同时,复配产生的功能增强效果也为同类功能性菌株的进一步开发与应用提供了指导。
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