餐厨垃圾，俗称“泔脚”，主要是指居民日常生活、食品加工、餐饮服务、单位供餐等活动中产生的食物废料和食物残留[1]。随着我国居民生活水平的日益提高，餐厨垃圾产生量也随之增多，已经成为我国城市生活垃圾的主要组成部分。按照生态环境部发布的《2019年全国大、中城市固体废物污染环境防治年报》数据显示，2018年度全国200个大中型城市的生活垃圾产生量达到21 147.3万t，其中餐厨垃圾产生量约为1亿t/年，到2020年预计将会突破至1.2亿t[2]。
餐厨垃圾经精细化分选和三相分离后，餐厨固渣中有机组分主要包括淀粉、蛋白质和纤维素类物质[3]。其中，淀粉类有机质是生化性非常好的有机碳源。从市政环境治理整体需求来看，我国污水处理厂普遍存在碳源缺乏问题，需要大量的外加碳源[4]。如能从餐厨固渣中回收碳源用于污水处理脱氮除磷过程，则能有效降低运行成本。然而，超声、水热和微波等物化方法很难实现碳源的有效分离[5-6]。酶催化水解技术具有反应专一、效率高、反应条件温和等优点，能够定向催化特定物质的水解反应，从而实现目标产物从固相到液相的定向分离[7-8]。但是目前有关从餐厨固渣中回收碳源的研究报道较少。鉴于此，本研究采用复合淀粉酶水解法回收餐厨固渣中的有机碳源，通过单因素实验考察酶解条件对碳源提取效果的影响，建立关键影响因子的响应面回归模型并分析相互间的交互关系，明确最佳酶解条件。在此基础上，借助等电点沉淀法进一步提高回收碳源纯度。
1 材料与方法
1.1 实验材料
餐厨固渣取自于江苏省张家港市某餐厨垃圾处理厂。餐厨垃圾经分质分选、制浆和三相分离等预处理后，餐厨固渣含水率为72.1%(质量分数)，挥发性固体(volatile solid，VS)占总固体(total solid，TS)的质量分数为92.8%。粗蛋白、粗淀粉、粗纤维和粗脂肪占TS的质量分数分别为(38.7±1.7)%、(33.2±1.4)%、(16.5±0.9)%和(1.8±0.2)%。α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶购于酷尔化学科技(北京)有限公司，酶活分别为4、35、100 U/mg。3种酶的最佳作用pH值分别为6.0、5.0、5.0；最佳作用温度分别为60、55、55 ℃。其他试验试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 淀粉酶的筛选
餐厨固渣样品采集完成后，在105 ℃下烘干并用高速粉碎机粉碎，然后放置密封袋中于4 ℃下保藏待用。称取20 g餐厨固渣(以TS计)分别加至血清瓶中，用去离子水调节底物质量浓度至200 g/L，在恒温摇床中(120 r/min，60 ℃)糊化60 min后，分别加入α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。酶添加质量分数以单位质量餐厨固渣(g TS)添加酶量(g)的百分比计。恒温摇床中(120 r/min)酶解5 h，不添加任何酶的体系为空白对照，不同酶解体系的最适反应条件如表1所示。反应结束后，将血清瓶置于100 ℃水浴锅中热处理15 min以灭活淀粉酶，5 000 r/min离心10 min后，提取上清液测定总糖和还原糖质量浓度以对比酶解效果。
表1 不同种类淀粉酶的最适酶解条件
Table 1 Optimal enzymatic conditions of different kinds of amylase
酶种类温度/℃pH值酶添加质量分数/%底物质量浓度/(g·L-1)对照组606.0-200α-淀粉酶606.01.0200β-淀粉酶555.01.0200γ-淀粉酶555.01.0200
1.2.2 复合淀粉酶水解的单因素试验
在对比不同淀粉酶水解效果的基础上，选取α-和γ-复合淀粉酶提取餐厨固渣碳源，并对水解条件进行单因素试验。以酶添加质量分数、复合淀粉酶质量比(α/γ)、酶解温度、酶解pH和底物质量浓度为自变量，以碳源提取率(E)为响应值，研究各因素对碳源提取效果的影响。酶解步骤参照1.2.1，反应基本条件为：底物质量浓度200 g/L、酶添加质量分数1.0%(以g/g TS计)、复合淀粉酶质量比3∶1、酶解温度60 ℃和酶解pH 6.0。
1.2.3 响应面优化实验
根据单因素试验结果筛选出关键影响因素，采用Box-Behnken响应面设计法进一步优化组合反应条件。以底物质量浓度、酶解温度和pH为自变量，以碳源提取率(E)为响应值进行中心组合试验，分析自变量对响应值的主效应和交互作用。响应面优化试验因素与水平设计如表2所示。
1.2.4 等电点沉淀法去除蛋白质
餐厨固渣经复合淀粉酶处理后所获得的碳源提取液中，仍然存在一定浓度的可溶性蛋白。为了进一步提高碳源纯度，借助等电点沉淀法去除碳源提取液中的蛋白质。采用0.2 mol/L HCl和0.2 mol/L NaOH调节提取液pH值分别至3、3.25、3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75 、5，充分搅拌混合，在25 ℃条件下静置1 h后，5 000 r/min离心10 min，收集上清液进行测定分析。
表2 响应面试验因素与水平表
Table 2 Factors and levels of response surface experiment
水平pH值(A)底物质量浓度(B)/(g· L-1)温度(C)/℃-151505006200601725070
1.3 分析测试方法
餐厨固渣的TS和VS质量分数测定采用烘干恒重法(HJ 613—2011)；粗淀粉质量分数测定采用酸水解法(GB 5009.9—2016)；蛋白质质量分数测定采用凯氏定氮法(GB/T 6432—2018)；粗脂肪质量分数测定采用索氏抽提法(GB 5009.6—2016)。碳源提取液中总糖质量浓度采用苯酚-硫酸法(GB/T 15672—2009)；还原糖质量浓度测定采用3,5-二硝基水杨酸法(NY/T 2742—2015)；生化需氧量(biochemical oxygen demand,BOD)的测定采用稀释接种法(GB/T 7488—1987)。
碳源提取率(E)的计算如公式(1)所示：
(1)
式中：C1，酶解后提取液中总糖的质量浓度，g/L；V1，提取液体积，L；M0，餐厨固渣中粗淀粉质量分数，%；W0，餐厨固渣的干重(以TS计)，g。
蛋白质去除率(R)的计算如公式(2)所示：
(2)
式中：P0，提取液中蛋白质的质量浓度，g/L；P1，等电点沉淀后提取液中蛋白质的质量浓度，g/L。
2 结果与分析
2.1 不同种类淀粉酶对餐厨固渣碳源的提取效果
淀粉酶是能催化淀粉、糖原水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其他低聚糖的一群酶的总称，主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶[9]。α-淀粉酶作用于淀粉内部的α-1,4-糖苷键，水解产物包括糊精、低聚糖和单糖；β-淀粉酶是从非还原性末端依次切开相隔的α-1,4-糖苷键，当作用于直链淀粉时，其最终产物主要为麦芽糖。但是β-淀粉酶不能水解和跨过支链淀粉的α-1,6-糖苷键，因此水解支链淀粉时其最终产物除了麦芽糖还会残留下大分子的β-极限糊精。γ-淀粉酶也是一种外切酶，从淀粉分子非还原端依次切割α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键，逐个切下葡萄糖残基。无论作用于直链淀粉还是支链淀粉，γ-淀粉酶的最终产物均为葡萄糖。首先比较分析了3种淀粉酶对餐厨固渣中碳源的最佳水解效果。如图1所示，餐厨固渣经不同淀粉酶处理后，提取液中的总糖质量浓度分别为53.8 g/L(α-淀粉酶)、29.0 g/L(β-淀粉酶)和39.5 g/L(γ-淀粉酶)，而对照组仅为15.4 g/L。很显然，α-淀粉酶最有利于餐厨固渣中淀粉的溶出，碳源提取率达到64.8%。此外，γ-淀粉酶处理后的还原糖质量浓度最高，达到21.3 g/L，约占溶解性总糖的53.9%。已有文献表明，还原糖浓度高说明淀粉水解更为彻底，水解液则更加稳定[10]。对比以上3种淀粉酶的水解效果，可以看出α-淀粉酶和γ-淀粉酶的碳源提取率均优于β-淀粉酶，而γ-淀粉酶处理后的还原糖浓度要高于α-淀粉酶。因此进一步选取α-淀粉酶和γ-淀粉酶协同处理餐厨固渣以提高碳源提取效果，并对其复合酶解条件进行单因素试验。
图1 三种淀粉酶对餐厨固渣碳源的提取效果对比
Fig.1 Comparison of carbon source extraction from food-waste solid residue by three different amylases
2.2 复合淀粉酶水解餐厨固渣的单因素实验
2.2.1 酶添加质量分数与α/γ添加质量比对碳源提取效果的影响
如图2-a所示，通过添加复合淀粉酶能够有效促进餐厨固渣的碳源提取。当复合酶添加质量分数分别为0.6%、0.8%和1.0%时，碳源提取率分别达到了72.1%、75.3%和75.9%，均明显优于单一淀粉酶的作用效果。进一步考察了复合酶质量比(α/γ)对餐厨固渣碳源水解的影响。结果显示，碳源提取率随着α/γ添加质量比的增加呈先升后降的趋势；当复合酶质量比为3∶1时，碳源提取率达到最高值(图2-b)。由此可见，复合淀粉酶的协同作用可以更为有效地回收餐厨固渣中的碳源。这是因为当α-淀粉酶与γ-淀粉酶共同作用时，α-淀粉酶可将淀粉水解成糊精和低聚糖等产物，从而为γ-淀粉酶提供了更多的非还原性末端；而γ-淀粉酶能够将糊精和低聚糖进一步水解，理论上有助于α-淀粉酶的催化反应[11]。此外，在一定范围内，酶添加质量分数(0.6%、0.8%、1.0%)和添加质量比(2∶1、3∶1、4∶1)对复合酶的作用效果影响并不显著(P>0.05)。从成本等方面综合考虑，最佳酶添加质量分数和复合酶质量比分别确定为0.6%和3∶1。由此可见，相较于单一淀粉酶，α-淀粉酶和γ-淀粉酶协同处理不仅可以提高碳源提取效果，而且酶使用量更少。
a-酶添加质量分数；b-α-淀粉酶与γ-淀粉酶添加质量比
图2 酶添加质量分数与复合酶质量比对餐厨固渣碳源提取率的影响
Fig.2 Effects of the added enzyme mass fraction and ratio on the extraction efficiency of carbon source from food-waste solid residue
2.2.2 酶解温度对复合酶作用效果的影响
温度是影响酶催化活性的关键因素之一[12]。针对2种淀粉酶反应条件的差异，进一步分析了酶解温度对复合淀粉酶作用效果的影响。如图3所示，餐厨固渣碳源提取率随着酶解温度的上升呈现先增加后降低的趋势。当反应温度从40 ℃升高至60 ℃，碳源提取率从65.0%逐步增加至73.9%；但是进一步提高反应温度会破坏酶的空间结构，导致酶活性降低，碳源提取率显著下降至50.4%(80 ℃)。实验结果表明，温度对碳源提取率的影响极显著(P<0.01)，因此进一步选择50、60、70 ℃ 3个水平进行响应面分析。
图3 反应温度对餐厨固渣碳源提取率的影响
Fig.3 Effects of enzymatic temperature on the extraction efficiency of carbon source from food-waste solid residue
2.2.3 pH值对复合酶作用效果的影响
在酶促反应过程中，pH变化不仅影响底物的解离状态，而且会改变酶分子活性位点的必需基团解离形态和空间构象，进而影响酶活性[13]，且不同的酶对pH变化的响应各不相同。因此本研究考察了不同pH条件下复合淀粉酶的协同作用效果。如图4所示，当pH值为3～6时，餐厨固渣碳源提取率从44.0%显著提高至73.2%；继续提高pH会导致酶解效果下降，碳源提取率在pH 8.0的条件下显著降低至52.6%。实验结果分析表明复合淀粉酶的作用效能受pH影响较为显著(P<0.01)，因此进一步选择pH 5.0、6.0和7.0三个水平进行响应面分析。
图4 pH值对餐厨固渣碳源提取率的影响
Fig.4 Effects of pH on the extraction efficiency of carbon source from food-waste solid residue
2.2.4 底物质量浓度对复合酶作用效果的影响
底物质量浓度对复合淀粉酶作用效果的影响如图5所示。餐厨固渣碳源提取率呈现先增加后下降的趋势。当底物质量浓度为200 g/L时，复合酶解效果最好，餐厨固渣碳源提取率达到73.6%。适当的底物浓度能够在保证酶分子与反应底物充分接触的同时，促进更多的底物转化，因此有助于提高酶催化效率[14]。但是过高的底物浓度会造成有效浓度下降，反应体系黏度的增大会抑制各组分的扩散，酶分子和底物无法充分结合，导致酶解效率降低。此外，高浓度底物还可能与酶分子形成无活性的中间复合物，从而抑制酶促反应[15]。实验结果分析表明，底物质量浓度对餐厨固渣碳源提取效果影响极显著(P<0.01)，因此进一步选择底物质量浓度150、200、250 g/L 3个水平进行响应面分析。
图5 底物质量浓度对餐厨固渣碳源提取率的影响
Fig.5 Effects of substrate mass concentration on the extraction efficiency of carbon source from food-waste solid residue
2.3 Box-Behnken响应面优化结果
2.3.1 模型的建立与显著性分析
单因素实验结果表明，酶解pH(A)、底物质量浓度(B)和温度(C)对复合淀粉酶作用效果的影响极为显著(P<0.01)。因此，本研究以此3个因素为自变量，以碳源提取率为响应值(E)，进一步采用Box-Behnken响应面法对餐厨固渣碳源提取工艺条件展开优化。响应面分析结果如表3所示，1～12号是析因实验，13～17号是中心实验。17个实验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量，零点为区域的中心点，零点实验重复5次。通过数据拟合建立二次回归模型：
E=74.66+1.82A-3.55B-1.93C+0.9AB-0.78AC+1.72BC-6.28A2-12.58B2-3.81C2。
表3 优化响应面试验设计及结果
Table 3 Design and result of response surface experiment
编号试验值编码值响应值pH值底物质量浓度/(g·L-1)温度/℃ABC(E)/%15.00150.060.00-1-1059.3227.00150.060.001-1059.2135.00250.060.00-11050.647.00250.060.0011054.1155.00200.050.00-10-163.267.00200.050.0010-170.3375.00200.070.00-10160.487.00200.070.0010164.3996.00150.050.000-1-165.32106.00250.050.0001-154.6116.00150.070.000-1158.52126.00250.070.0001154.68136.00200.060.0000074.96146.00200.060.0000073.89156.00200.060.0000075.52166.00200.060.0000073.29176.00200.060.0000075.65
对上述回归模型进行方差分析(表4)，回归模型的F值为72.26，具有高度的显著性(P<0.000 1)；但失拟项不显著(P=0.198 4>0.05)，说明失拟和纯误差相关不显著，存在失拟因素[16]。模型多元相关系数R2=98.9%，校正决定系数
响应值(碳源提取率)的变化有98.9%来自于所选的变量(pH值、温度和底物质量浓度)，说明该模型对实验拟合较好。此外，通过各自变量F值比较可以看出，3个因素对碳源提取率影响大小依次为底物质量浓度>温度>pH值。回归方程方差分析表明，一次项pH值(A)、底物质量浓度(B)、温度(C)和二次项A2、B2、C2对响应值影响极显著(P<0.01)；交互项影响大小依次为BC>AB>AC，其中因子BC对响应值影响显著(P<0.05)，其他均不显著(P>0.05)。由此可见，各因素对碳源提取率的影响并不是简单线性关系。
表4 回归模型方差分析
Table 4 The variance analysis of regression model
参数平方和自由度方差F值P值显著水平模型1 143.49127.0472.26< 0.000 1**A26.35126.3514.990.006 1**B100.681100.6857.260.000 1**C29.88129.8816.990.004 4**AB3.2813.281.860.214 5AC2.4612.461.40.275BC11.83111.836.730.035 7*A2165.841165.8494.32< 0.000 1**B2665.921665.92378.74< 0.000 1**C260.99160.9934.690.000 6**残差12.3171.76失拟项8.0332.682.50.198 4纯误差4.2841.07总和1 155.7116
注：**表示差异极显著(P<0.01)；*表示差异显著(P<0.05)
2.3.2 最佳酶解条件的预测及实验验证
通过对二次多项数学模型进行解析，3个显著性影响因素的最佳条件为：酶解温度56.96 ℃、pH 6.15、底物质量浓度192.2 g/L，理论碳源提取率预测值为75.4%。进一步通过实验对模拟结果进行验证，实验条件设置为：酶解温度57.0 ℃、pH 6.2、底物质量浓度190 g/L，酶添加质量分数0.6%以及复合酶质量比3∶1。通过4次验证实验，最终获得的餐厨固渣碳源提取率为(76.9±3.1)%，与理论预测值误差仅为1.5%，确认了该模型的有效性。
2.4 等电点沉淀法提高碳源纯度
餐厨固渣复合酶解提取碳源过程中会有一些蛋白质随之溶出，影响碳源纯度。等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低的特性，通过调节液相pH使蛋白质沉淀析出的方法[17]。施正华等[18]通过等电点沉淀法回收污泥水解液中的蛋白质，蛋白质回收率可达到87.5%，展现出较好的沉淀效果。因此本研究进一步考察了等电点沉淀法对餐厨固渣复合淀粉酶水解液中蛋白质的去除效果。初始水解液中蛋白质质量浓度为13.6 g/L。通过动态调节pH可以发现蛋白质浓度在pH 3.0～5.0呈现出U型曲线(图6)。当pH值为3.75时，水解液中蛋白质质量浓度下降至9.4 g/L，蛋白质去除率达到30.9%。结果表明，借助蛋白质等电点沉淀法可以进一步提高水解液中的碳源纯度。
图6 等电点沉淀法对水解液中蛋白质的去除效果
Fig.6 The protein removal from the hydrolysate by isoelectric precipitation
经等电点沉淀处理后，碳源提取液中的总糖质量浓度没有发生无明显变化(表5)，意味着蛋白质等电点沉淀并不会造成溶解性碳源的损失。通过蛋白质的沉淀去除，生化需氧量与氮素的比值(BOD/N)由38.3显著提高至51.2。我国城市污水处理生物脱氮工艺普遍需要投加大量的外加碳源[19]。理论上，反硝化生物脱氮过程中去除
需要2.86 g BOD，但是由于一部分有机物会被消耗用于微生物生长和其他代谢途径，所以在实际脱氮过程中需要消耗更多的碳源。目前我国市政污水BOD/N往往较低[20]，在实际处理工艺中就需要通过补充碳源才能满足充分的反硝化脱氮。通过复合淀粉酶水解结合等电点沉淀法，餐厨固渣碳源提取液中的BOD质量浓度和BOD/N分别达到了76.8 g/L和51.2，显然非常适合用于污水处理的外加碳源，从而可实现“变废为宝”。
表5 等电点处理前后提取液有机质浓度变化
Table 5 Changes of organic matter concentration in the extracting solution by isoelectric precipitation
样品总糖质量浓度/(g·L-1)蛋白质质量浓度/(g·L-1)BOD质量浓度/(g·L-1)BOD/N等电点处理前63.8±2.113.6±0.583.6±5.838.3等电点处理后62.2±2.69.4±0.376.8±2.551.2
3 结论
采用淀粉酶水解结合等电点沉淀法可以较好地回收餐厨固渣中的有机碳源。研究结果证明，相较于单一淀粉酶，α-淀粉酶和γ-淀粉酶的协同作用能够在较少的酶使用量下显著提高碳源提取效率。通过单因素实验和响应面优化得到最佳酶解条件：酶解温度57.0 ℃、pH 6.2、底物质量浓度190 g/L，酶添加质量分数0.6%以及复合酶质量比3∶1，碳源提取率达到76.9%。等电点沉淀法能够进一步提高回收碳源纯度，回收液中BOD质量浓度和BOD/N分别达到了76.8 g/L和51.2，完全有潜力作为污水处理的外加碳源使用。研究结果可为我国餐厨垃圾的精细化、资源化利用提供有益思路。
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