ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是由多个赖氨酸残基通过α-COOH和ε-NH2连接而成的一种同型氨基酸聚合物[1]，聚合度多为5～35，分子质量一般在780～4 600 Da。ε-PL产品为淡黄色粉末，吸湿性强，极易溶于水，不溶于有机溶剂，热稳定性较好，水溶液可以在100 ℃加热 30 min 或者在120 ℃条件下加热20 min不降解[2]。由于其主链上存在许多游离氨基，在酸性到弱碱性环境中表现出多阳离子特性。它对多种微生物，包括大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、酵母、霉菌和噬菌体均有抑制作用[3-6]。ε-PL 作为一种绿色、安全生物食品防腐剂被广泛使用[7-8]。
研究表明，ε-PL的合成是在聚赖氨酸合成酶的催化作用下，以L-赖氨酸为前体，以非核糖体多肽合成方式聚合[9]。ε-PL的抑菌性能受其聚合度影响，日本学者SHIMA等[10]考察了ε-PL的抑菌性能，发现当ε-PL聚合度<9时，抑菌活性很低，ε-PL聚合度>25时，其抑菌性能最佳。在刘庆瑞等[11]的研究中，高聚合度ε-PL对革兰氏阳性和阴性细菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)是发酵产生的ε-PL的1/2 ～1/4；聚合度<20的ε-PL的MIC 值是发酵产生的ε-PL 的2～4倍，ε-PL聚合度越高越有利于抑制细菌。KITO等[12]在Streptomyces albulus细胞膜上发现了ε-PL降解酶(ε-poly-L-lysine-degrading enzyme，PLD)的存在，他们研究发现其最适pH值为7.0，在发酵过程中控制低pH可以避免ε-PL降解，从而积累高聚合度的ε-PL。NISHIKAWA等[13]在ε-PL合成过程中向培养基内同时添加甘油和璜化ε-环糊精，使得ε-PL分子质量由3.5～4.5 kDa减小到2.5 kDa，他们还提出了一种通过调节培养基中多元醇浓度来控制ε-PL中赖氨酸残基数量的方法。现有的对于ε-PL聚合度控制的研究大多集中在菌株改造和发酵过程控制等环节，通过下游分离工艺来控制商品ε-PL的聚合度却尚未见报道。
膜分离技术是以选择性透过膜为介质，借助于外界能量或化学位差的推动，实现多组分混合物进行分离、分级、提纯以及浓缩富集的技术，其过程简单，无相变，无二次污染且分离系数大[14-15]。本团队前期筛选的链霉菌发酵生产的ε-PL聚合度主要分布在5～35，本研究旨在尝试通过膜分离技术，在下游分离提取环节部分分离去除低聚合度(<25)ε-PL，提高产品中高聚合度(25～35)ε-PL含量，以提高单位产品的抑菌性能。
1 材料与方法
1.1 材料
ε-PL，江苏一鸣生物科技有限公司；乙腈(纯度≥99%)、甲基橙、NaClO4·H2O等常规试剂，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。
实验用膜片，泰州星达膜科技有限公司，主要参数如表1所示。
表1 膜片主要性能参数
Table 1 Main parameters of membrane
膜型号材料截留分子质量/DaLMTPES(聚醚砜)5 000LVTPES(聚醚砜)3 000LXTPES(聚醚砜)1 000LNFG聚酰胺600～800NDF聚酰胺500～700
1.2 仪器与设备
Synder小型超滤系统，泰州星达膜科技有限公司；PHS3TC pH计，上海天达仪器有限公司；UV2100分光光度计，优尼科仪器有限公司；AB204N分析天平，瑞士梅特勒公司；Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪，美国Agilent 公司。
1.3 ε-PL的分析
ε-PL浓度采用甲基橙比色法确定[16]。ε-PL聚合度通过离子对色谱[17-18]来测定。TSKgel ODS-80Ts色谱柱(4.6 mm×250 mm;Tosoh，Tokyo)，流动相A：10 mmol/L NaH2PO4、100 mmol/L NaClO4·H2O， 10 mmol/L辛烷磺酸钠，磷酸调pH值至2.6。流动相B：20 mmol/L NaH2PO4，200 mmol/L NaClO4·H2O，20 mmol/L辛烷磺酸钠，磷酸调pH值至2.6，50%(体积分数)乙腈。流动相梯度：50 ℃，85 min内，B从55%线性变化为90%，与A混合，0.4 mL/min。检测波长：215 nm。该色谱条件下不同聚合度的ε-PL的校正因子相近，不同聚合度的ε-PL的含量由归一化法来定量。
1.4 膜的截留率与透过率
膜的截留率如计算公式(1)所示：
截留率
(1)
式中：C0，原料液中的ε-PL质量浓度，g/L；C1，截留液中ε-PL质量浓度，g/L；V0、V1，料液、截留液的体积，L。
膜的透过率计算如公式(2)所示：
透过率
(2)
式中：C2，透过液中ε-PL质量浓度，g/L；V2，透过液的体积，L。
1.5 膜通量的测定
通过测定一定时间得到的透过液体积，根据公式(3)计算膜通量：
膜通量
(3)
式中：V，透过液的体积，L；A，膜面积，m2；t，过滤的时间，h。
1.6 透析过滤
本研究使用的小型膜分离装置结构如图1所示。操作方式参考李芳良等[19]的间歇变容渗滤。
图1 膜分离装置示意图
Fig.1 Schematic diagram of membrane separation device
1.7 ε-PL的抑菌性能
测定不同ε-PL产品的MIC，比较其抑菌性能[10]。细菌采用肉汤液体培养基，酵母菌采用YPD 液体培养基，霉菌采用PDA 液体培养基来培养。向每个试管内加入 1 mL稀释后的ε-PL 溶液和1 mL培养基稀释的菌液，使细菌菌液浓度约为 5×105 CFU/mL，酵母菌、霉菌终浓度为0.5～2.5×103 CFU/mL。其中，细菌第1～11管ε-PL质量浓度分别为 1，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 μg/mL，酵母菌和霉菌第1～11管ε-PL质量浓度分别为 1 200、1 100、1 000、900、800、700、600、500、400、200、100 μg/mL。细菌于37 ℃培养12 h，酵母菌、霉菌于37 ℃培养48 h后，肉眼观察以完全抑制菌体生长的最低ε-PL浓度为最小抑菌浓度[11]。
2 结果与分析
2.1 膜片截留分子质量的选择
ε-PL等电点约为9，在pH=9的溶液中，ε-PL接近电中性，选择该pH条件对料液进行分离，可减少ε-PL带电性在过膜过程中的干扰。选择pH=9，质量浓度为10 g/L的ε-PL水溶液作为待分离料液，在压力为0.25 MPa的条件下进行膜片的预筛。由图2-a 可知，在同样的操作条件下，膜的截留分子质量越大，其膜通量越大。膜MT(5 000 Da)对于ε-PL截留率较低，其他4种膜对ε-PL的截留率均达到80%以上。
通过对不同型号膜的透过液进行聚合度分析(图2-b)，VT膜的综合表现最好。VT膜透过液中低聚合度ε-PL含量最高，其低聚合度(<25)ε-PL含量为41.08%，聚合度在25～35的ε-PL含量为58.92%。VT膜标定的截留分子质量为3 000 Da，而聚合度为25的ε-PL的分子质量为3 348 Da，在后续的研究中，选择VT膜进行研究。
a-截留率与膜通量；b-对高低聚合度ε-PL的透过率
图2 五种不同型号的膜对ε-PL溶液的截留率与膜通量以及对高低聚合度ε-PL的透过率
Fig.2 The rejection rate and membrane flux of five membranes to ε-PL solution and the permeability to high or low degree of polymerization ε-PL
2.2 操作压力对高低聚合度ε-PL分离效果的影响
压力会影响膜分离过程的体积通量，图3-a可知体积通量随着压力的增加而增加。压力基本上不会影响VT膜对高聚合度的ε-PL的透过率(图3-b)，但是压力较小时，低聚合度ε-PL透过率相对较高，可见在分离过程中，低聚合度的ε-PL相对更容易通过膜。但由于循环液中低聚合度ε-PL的含量很低(17.73%)，且高低聚合度的ε-PL分子质量差异并不显著，因此分离效果并不明显。由于压力较低时膜通量很低，选择0.25 MPa(约0.25 MPa)作为后续实验的操作压力。
a-截留率与膜通量；b-对高低聚合度ε-PL的透过率
图3 不同操作压力下VT膜对ε-PL溶液的截留率与膜通量以及对高低聚合度ε-PL的透过率
Fig.3 The rejection rate and membrane flux of VT to ε-PL solution and the permeability to high or low degree of polymerization ε-PL with different operating pressures
2.3 pH对高低聚合度ε-PL分离效果的影响
VT对不同pH溶液中的ε-PL存在不同的筛分效果。VT对ε-PL溶液的截留率随着pH的增加减少，如图4-a所示，而体积通量基本上稳定。由图4-b可知，随着pH增加，透过液中的低聚合度ε-PL比例先增加后减少，在pH=6时，低聚合度ε-PL含量最高，为75.32%，在等电点附近，pH=9时，低聚合度ε-PL含量最低，为22.08%。
由图4-c可知，ε-PL的透过率随着pH的增加而增加。在pH=3时，VT对低聚合度ε-PL透过率为2.89%。当料液pH=10时，对低聚合度ε-PL透过率为37.51%，高聚合度ε-PL透过率为21.67%。而在pH=6时，透过液中低聚合度ε-PL比例较高，在该pH下，低聚合度ε-PL透过速率与高聚合度ε-PL相比差值更大，更有利于高低聚合度ε-PL的分离。
a-截留率与膜通量；b-分子质量分布；c-对高低聚合度ε-PL的透过率
图4 不同pH下VT膜对ε-PL溶液的截留率与膜通量以及对高低聚合度ε-PL的透过率
Fig.4 The rejection rate and membrane flux of VT to ε-PL solution and the permeability to high or low degree of polymerization ε-PL in different pH
2.4 初始进料浓度对高低聚合度ε-PL分离效果的影响
VT膜对ε-PL的筛分效果受料液浓度影响。体积通量会随着料液浓度的增加而降低，越稀的溶液在VT上的透过速率越快，膜对ε-PL的截留率也随料液浓度的增加而减小(图5-a)。进料液质量浓度为5 g/L的VT透过液中，低聚合度ε-PL的含量仅17.74%，VT膜基本上对溶液中高低聚合度的ε-PL没有选择性。而当进料液质量浓度为20 g/L时，低聚合度ε-PL的含量为48.04%，之后随着浓度的增加，透过液中低聚合度的ε-PL比例反而减少。由图5-b可知，低聚合度ε-PL的透过率随着浓度的增加而增大，当初始进料质量浓度为30 g/L时，低聚合度ε-PL的透过率为25.25%。进料浓度会影响ε-PL的透过，随着浓度增加，低聚合度ε-PL透过率得到提高，同时高聚合度ε-PL的透过率也会随之增加，浓度增加到一定值时，膜对高低聚合度的ε-PL的选择性降低。在本研究中，料液质量浓度为20 g/L，透过液中低聚合度ε-PL的比例最高，综合分离效果更好，选择20 g/L作为后续研究中的初始料液浓度。
a-截留率与膜通量；b-对高低聚合度ε-PL的透过率
图5 不同进料浓度下VT膜对ε-PL溶液的截留率与膜通量以及对高低聚合度ε-PL的透过率
Fig.5 The rejection rate and membrane flux of VT to ε-PL solution and the permeability to high or low degree of polymerization ε-PL with different feed concentration
2.5 透析前后产品聚合度变化
ε-PL溶液经VT透析后循环液和透过液色谱图如图6所示。循环液和透过液收集经浓缩控制质量浓度在10 g/L左右。经过不断加水循环透析，循环液中聚合度<25的ε-PL几乎被去除，经过归一化处理，此时循环液中聚合度为25～35的ε-PL含量为91.22%。相对于原产品，25～35的ε-PL比例提高了8.38%。
a-原产品；b-循环液；c-透过液
图6 分离前后ε-PL溶液聚合度
Fig.6 ε-PL solution polymerization degree before and after separation
2.6 不同聚合度分布的ε-PL产品的抑菌活力
通过VT透析后，我们比较了原产品与分离后产品的抑菌活力。由表2、表3可知，经过透析之后，循环液中25～35聚合度的ε-PL比例增加，无论是对于大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌，其MIC值均低于原产品。而对于酵母和霉菌，透析后的产品与原来产品的抑菌活性无明显差异。可见，高聚合度的ε-PL更有利于抑制细菌。
表2 VT透析前后聚合度比例
Table 2 The ratio of polymerization degree before and after VT dialysis
样品低聚合度(<25)/%高聚合度(25～35)/%原产品17.1982.84分离后产品8.7891.22
表3 不同ε-聚赖氨酸产品的最小抑菌浓度
Table 3 The MIC of different ε-PL products
菌株MIC /(μg·mL-1)原产品循环液Gram-positive bacteriaStaphylococcus aureus ATCC 6538128Gram-negative bacteriaEscherichia coli ATCC 80991210YeastSaccharomyces cerevisiae CICIM Y0086600600MoldAspergillus niger ATCC16404>1 200>1 200
2.7 高低聚合度 ε-PL透过VT膜的模型分析
为了研究ε-PL透过膜VT的方式，我们分析了ε-PL的二级结构，结果如表4所示。ε-PL主链是长的脂肪族烃链，几乎不形成螺旋结构，主要为ε-折叠构象[20]。ε-PL侧链氨基的电离常数为8.0～9.0，当pH值低于电离常数时，氨基带有强正电荷，这导致主链中的残基相互排斥，无法形成氢键并自由膨胀，在pH<8～9的循环液和透过液中，ε-PL主要为β-折叠和无规卷曲构型。
表4 不同pH水溶液中ε-PL二级结构
Table 4 Structure of ε-PL in different pH aqueous solutions
溶液pHα-螺旋β-折叠无规则卷曲20.020.510.4740.020.510.4760.020.510.4780.030.50.47100.170.360.46
由图7可知，与循环液相比，透过液中不同聚合度的ε-PL均有透过，而低聚合度ε-PL透过较多。VT由PES制成的表面活性层与支撑层2层组成，该膜的分离作用主要取决于表面活性层，活性层内含有相互交联的孔道。在pH<8～9的循环液和透过液中，不同分子质量的ε-PL呈折叠线型分子结构。当线型分子与膜面垂直时均能进入膜通道并透过，分子质量>3 000 Da的ε-PL仍然可能通过膜内的通道，分子质量<3 000 Da的ε-PL也可能会因为在膜的表面“架桥”而被截留下来，如图8所示。分子质量越大，在膜表面“架桥”的几率越大。在透析的过程中，分子质量<3 000 Da的ε-PL更容易透过膜，导致了高低聚合度ε-PL透过速度的差异，通过不停地向循环液加水循环，循环液中低聚合度ε-PL含量降低。但由于高低聚合度ε-PL分子质量差异不大，且均能透过膜片，单纯靠分子质量的差异，并不能实现高低聚合度ε-PL的绝对分离。
a-截留液；b-透过液
图7 VT膜的初始截留液与透过液色谱图
Fig.7 Chromatograms of the initial circulated and permeated fluid of the VT membrane
图8 透过模型示意图
Fig.8 Diagram of dialysis
3 结论
本研究尝试在下游分离提取环节提高产品中高聚合度(25～35)ε-PL含量，筛选了截留分子质量为3 000 Da的PES膜VT，确定了该膜片用来高低聚合度ε-PL的操作压力、料液pH和初始料液浓度。在操作压力0.25 MPa下，对pH=6，初始质量浓度为20 g/L的料液进行了透析，透析之后的产品中聚合度在25～35的ε-PL含量达91.22%，较原产品提高了8.38%；比较透析前后产品的抑菌性能，透析之后产品更有利于细菌的抑制。最后，对于膜工艺分离ε-PL的分离过程进行了分析。膜分离工艺不能实现不同聚合度ε-PL的绝对分离，但可以提高产品中高聚合度ε-PL的比例，提高产品对细菌的抑菌性能，对于提高ε-PL应用价值具有重要意义。
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