酸奶是世界上最受欢迎的发酵乳制品之一。近年来，消费者对乳制品的需求增加，促进混合型酸奶的研发[1]。大豆产品在亚洲国家消费量较高。然而，西方国家的消费者不接受豆制品中的豆腥味和青草味[2]，同时大豆中的低聚糖可能会引起胃肠胀气[3]，因此限制豆制品在西方国家的消费。
与牛乳类似，豆乳中含有低聚糖和氨基酸，可以维持益生菌的生长[3]。研究表明，利用益生菌发酵豆乳可以解决大豆的风味不良和肠胃胀气的问题[3]，但是也有研究表明发酵生产的大豆酸奶存在钙含量低、风味差、质地粗糙等缺点[4]。另外，豆乳不能维持某些微生物的生长，例如保加利亚乳杆菌，从而导致产酸不足[5]。因此，很多研究人员利用牛乳和豆乳混合发酵来改善大豆酸奶的营养、风味和质地，开发新品种酸奶[6]。
GRANATA等[4]以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为发酵剂，研究酪蛋白酸盐、酪蛋白水解物和乳清蛋白水解物对豆乳酸奶类产品风味和质地的影响，发现添加酪蛋白酸盐和酪蛋白水解物的产品的品质与纯牛乳酸奶的品质类似。DRAKE等[7]以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为发酵剂，制备添加大豆浓缩蛋白的低脂酸奶，发现添加1%～2.5%大豆浓缩蛋白的酸奶的品质与纯牛乳酸奶的品质最为接近。SHAHABBASPOUR等[1]探究发酵剂(酸乳杆菌和干酪乳杆菌)和不同质量配比的脱脂牛乳和豆乳(100∶0、75∶25、50∶50、25∶75、0∶100)对大豆饮料品质的影响，发现脱脂牛乳和豆乳的质量配比为50∶50、以干酪乳杆菌作为发酵剂时大豆饮料的品质最好。KAZEMI等[8]将豆乳与牛乳混合，以嗜酸乳杆菌作为发酵剂，探究酸奶的理化性质、微生物和感官特性的变化，发现牛乳和豆乳的体积比为5∶1混合制备的酸奶的品质最好。以上研究表明，牛乳和豆乳的混合会对酸奶的品质产生积极影响。有研究指出酸奶的品质与发酵剂关系密切。目前生产酸奶最常用的发酵剂是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，然而关于利用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为发酵剂，探究不同配比的牛乳和豆乳对酸奶品质影响的研究较为缺乏。
因此，本研究利用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为发酵剂，探究牛乳和豆乳配比对酸奶品质的影响。利用持水力(water holding capactiy,WHC)评价酸奶的稳定性，利用微观结构与流变学指标揭示酸奶的凝胶强度，利用感官指标评价消费者偏好和产品可接受性。本研究将为混合乳酸奶的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试剂与设备
生牛乳，蛋白质含量(3.05±0.03)%(质量分数)，脂肪含量(3.62±0.04)%(质量分数)，北京富春农场；直投式发酵剂(经典益生菌型，含有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌)，安琪酵母股份有限公司；大豆，黑龙江黑土小镇现代农业开发有限公司；白砂糖，太古糖业有限公司；浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠、盐酸、甲基红、溴甲酚绿、无水乙醇、石油醚、乙醚等，北京化工厂。
DH-101-2恒温培养箱，中国中环有限公司；AR2000流变仪，TA仪器公司；S-3000 N冷冻扫描电子显微镜，日本Hitachi公司；K1100全自动凯氏定氮仪，海能科学仪器有限公司；Centrifuge5810低速离心机，德国Eppendorf公司；pH计，上海仪电科学仪器有限公司。
1.2 酸奶的制备
豆乳的制备参考MULLIN等[9]的方法，最终得到的豆乳含有(3.41±0.05)%蛋白质和(1.82±0.06)%脂肪。混合乳酸奶的设置如下：M，m(牛乳)∶m(豆乳)=100∶0；A，m(牛乳)∶m(豆乳)=75∶25；B，m(牛乳)∶m(豆乳)=50∶50；C，m(牛乳)∶m(豆乳)=25∶75；S，m(牛乳)∶m(豆乳)=0∶100。将纯乳或者混合乳搅拌均匀后，加入80 g/L蔗糖，在20 MPa、55 ℃条件下均质，90 ℃加热10 min杀菌后，迅速冷却至43 ℃接种1 g/L发酵剂，发酵至pH=4.8，冷却并在4 ℃贮存。在酸奶制备过程中采用pH计进行pH值的测定。
1.3 理化指标的测定
根据WANG等[10]的方法采用凯氏定氮(Kjeldahl)法和罗兹-戈特里(Rose-Gottlieb)法对贮存1 d酸奶中的蛋白质含量和脂肪含量进行测定。
1.4 持水力的测定
采用FERRAGUT等[11]的方法测定贮存1 d酸奶的持水力。取30 g酸奶样品在20 ℃，480×g条件下离心10 min。持水力为离心除去上清液后的样品质量与样品初始质量的比值。
1.5 流变学指标的测定
将贮存1 d的酸奶在25 ℃下平衡5 min，按顺时针方向搅拌5次，取适量置于载物台上，使用直径40 mm 的铝探针，间距1 mm，温度25 ℃，在线性黏弹性区域内，以0.5%的应变进行频率扫描(频率0.1～10 Hz)。
1.6 微观结构的测定
采用LI等[12]方法测定贮存1 d酸奶的微观结构。取少量酸奶样品至冷冻标本保持架上，放置于液氮中固定，固定后将样品折断，在-85 ℃下升华35 min，样品断面喷金，使用冷冻扫描电子显微镜观察，放大倍数为3 000倍。
1.7 感官评定
在酸奶分别贮存1、3、7、14、21、28 d后取样进行感官分析。选择本校食品科学与工程学院50名喜爱酸奶的同学组成感官评定小组。小组成员被安排在私密的隔间里，在品尝样品之间提供蒸馏水。酸奶样品(50 mL)装在透明塑料杯中并随机编号。感官属性为风味(50分)、质地(30分)、外观(20分)，总分为100分。参考LI等[13]方法，每种感官属性都以10分制评分(从1分=非常不喜欢～10分=非常喜欢)，然后按比例转换成相应的分数。样品的总分为各成员得分总分的平均分。
1.8 数据分析
所有样品均重复测定3次。方差分析借助SPSS 17.0完成，所得数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行分析。P<0.05为差异显著；图表借助Origin 8.0完成。
2 结果与分析
2.1 酸奶发酵过程中pH值的变化
牛乳和豆乳配比对酸奶发酵过程中pH值的影响如图1所示。所有样品在发酵过程中pH值的变化趋势基本一致：发酵开始的3 h，pH值下降缓慢，之后下降迅速。样品间初始pH值无显著性差异(P>0.05)；但pH值从6.5降至4.8所需时间差异显著(P<0.05)。M和S样品的发酵时间约为6.2 h，A、B、C样品发酵后期pH值下降速度较快，发酵时间显著性缩短，约为5 h，且3个样品间无显著性差异(P>0.05)。
图1 牛乳和豆乳配比对酸奶发酵过程中pH值的影响
Fig.1 Changes in pH during the fermentation of yogurt
prepared from different ratios of cow milk and soymilk
注：M、A、B、C、S分别代表m(牛乳)∶m(豆乳)=100∶0、75∶25、
50∶50、25∶75、0∶100(下同)
2.2 蛋白质和脂肪含量
图2为牛乳与豆乳配比对贮存1 d的酸奶的蛋白质和脂肪含量的影响。随着豆乳比例的增加，酸奶中蛋白质含量显著性增加，脂肪含量显著性降低(P<0.05)。
图2 牛乳与豆乳配比对贮存1 d的酸奶的蛋白质和脂肪含量的影响
Fig.2 The protein and fat content of yogurt prepared from different ratios of cow milk and soymilk at 1 d
2.3 持水力
牛乳与豆乳配比对贮存1 d的酸奶的持水力的影响如表1所示。与含有豆乳的样品相比，仅用牛乳制备的M样品持水力最高。随着豆乳比例的增加，A、B、C样品的持水力显著性降低(P<0.05)，25%牛乳和75%豆乳制备的C样品的持水力最低。S样品的持水力略有增加，达到A样品的水平，但仍显著性低于M组的持水力(P<0.05)。
表1 不同配比的牛乳与豆乳制备的酸奶贮存1 d的持水力
Table 1 The water holding capacity of yogurt prepared from different ratios of cow milk and soymilk at 1 d
指标样品MABCSWHC(98.32±0.51)%a(97.16±0.67)%b(95.22±1.10)%cd(93.71±0.52)%e(96.28±0.11)%bc
注：肩标不同字母表示有显著性差异(P<0.05)
2.4 流变学特性
图3为牛乳与豆乳配比对贮存1 d的酸奶的流变学特性的影响。所有样品的储能模量均高于损耗模量(图3-a，图3-b)，tanδ值在0.24～0.36(图3-c)。在频率扫描过程中，储能模量和损耗模量随剪切频率的增加而增加，tanδ值先略有下降，然后呈现不同程度的增长，最后降低。C和S样品的储能模量和损耗模量的变化较其他样品更加显著。在任何剪切频率下，酸奶的储能模量和损耗模量的大小顺序为C>S>B>A>M，tanδ值的大小顺序为M>A>B>S>C。
a-储能模量；b-损耗模量；c-tanδ
图3 牛乳与豆乳配比对贮存1 d的酸奶储能模量、
损耗模量和tanδ的影响
Fig.3 The storage modulus, loss modulus and tanδ of yogurt
prepared from different ratios of cow milk and soymilk at 1 d
2.5 微观结构
图4为利用冷冻扫描电子显微镜对储存1 d的酸奶进行微观结构测定的结果。所有酸奶的微观结构均呈现三维网状结构，但是在蛋白质结构的平滑度、乳清通道的大小以及微孔的数量上存在显著性差异。M样品的蛋白质结构光滑规则，由酪蛋白胶束和分布均匀的乳清通道组成(图4-a)。S样品的蛋白质结构也比较光滑平整，但是与M样品相比，乳清通道更大，蛋白质基质密度更大(图4-e)。与M和S样品相比，A、B和C的蛋白质结构更加粗糙，大量微孔分散其中(图4-b～图4-d)，乳清通道的大小和蛋白质基质的密度介于S和M样品之间。其中，B样品的乳清通道更大，微孔数量也更多。
a-样品M；b-样品A；c-样品B；d-样品C;e-样品S
图4 牛乳与豆乳配比对贮存1 d的酸奶的微观结构的影响
Fig.4 The microstructure of yogurt prepared from different
ratios of cow milk and soymilk at 1 d
2.6 感官评定
牛乳与豆乳的配比对酸奶贮存过程中感官评价的影响如图5所示。所有样品在贮存初期的总分均较为稳定，之后显著性下降。M样品在贮存前7 d品质最好，之后总分下降，尤其在第28天总分下降最为显著。贮存前期，A样品的总分与M样品的总分无显著性差异(P>0.05)，但在贮存28 d时A样品的总分显著性高于M样品的总分(P<0.05)。m(牛乳)∶m(豆乳)=50∶50制得的B样品在贮存前21 d总分较高，之后略有下降，但也显著性高于相同贮存时间的其他样品(P<0.05)。随着豆乳比例的进一步增加，C和S样品的总分在整个贮存期间都显著性低于其他样品(P<0.05)。
图5 不同配比的牛乳与豆乳制备的酸奶在贮存期间的感官总得分
Fig.5 Sensory evaluation of yogurt prepared from different ratios of cow milk and soymilk during storage from flavor
2.7 M组纯牛乳酸奶
与奶酪的制备相比，酸奶的加工过程中没有排乳清过程，因此产品中的蛋白质和脂肪含量取决于原料中的蛋白质和脂肪含量。牛乳中可溶性磷酸钙、酪蛋白胶束的碱性氨基酸侧链等都具有高缓冲能力[1,14]，因此在发酵初期，M样品的pH值无显著变化。随后，发酵剂发酵乳糖产生大量乳酸，pH值迅速下降。随着牛乳pH值的降低，酪蛋白胶束之间的静电斥力降低，疏水作用增强，从而形成包裹脂肪和乳清的三维网状结构。本研究中，M样品的微观结构与之前报道过的酸奶的微观结构相似[15]。紧密的网状结构和较小的乳清通道赋予M样品较高的持水力，这与其他研究中紧密的酪蛋白胶束网状结构能够保持水分的现象是一致的[16]。在频率扫描过程中，储能模量总是高于损耗模量，表明酸奶是以弹性为主的凝胶，与以前的研究一致[17]。酸奶中蛋白质之间键的数量、类型和强度是流变学特性的基础。M样品的蛋白质含量最低，蛋白质之间键少，导致较低的储能模量和损耗模量以及较高的tanδ。酸奶贮存1 d时，M样品呈现乳白色，具有典型的奶油味，酸甜适中，质地均匀，因此总分较高。贮存过程中，蛋白质的水解产生多种风味化合物，如乙醛和2,3-戊二酮[13]等，使M样品感官评分略有提高。然而，pH值的不断降低使酪蛋白胶束发生聚集，导致乳清分离和酸度增加，因此贮存后期M样品总分下降。类似的现象在以前的研究中也有报道[13]。
2.8 S组纯豆乳酸奶
豆乳中蛋白质含量比牛乳中蛋白质含量高，脂肪含量比牛乳中脂肪含量低，因此S样品的蛋白质和脂肪含量分别高于和低于M样品，这与LEE等[18]的报道一致。已有研究表明，豆乳的缓冲能力低于牛乳[1]，此外，豆乳中的益生元(如低聚糖)可以丰富发酵菌的培养基[8]，因此S样品的发酵过程可能快于M样品的发酵过程。然而也有报道表明，保加利亚乳杆菌不能发酵蔗糖和大豆中其他碳水化合物，因此使用100%豆乳会导致特定发酵菌缺乏必要的营养物质，从而减慢酸奶的发酵过程。上述2种影响的共同作用导致S和M样品的发酵时间无明显差异。对豆乳进行热处理后，蛋白质(主要为7S和11S)组分发生变性并重新排列成可溶性复合物，发酵过程中，蛋白质之间的静电斥力减小，在疏水作用、氢键等相互作用下形成网状结构。与M样品相似，S样品的微观结构也较为均匀，这与之前研究报道指出酸诱导的豆乳凝块具有均匀的结构是一致的[19]。S样品的蛋白质含量高于M样品，因此蛋白基质密度更大，这与之前的研究相似，即添加蛋白质的强化酸奶比不添加蛋白质的酸奶的结构更为致密[15]。大豆蛋白具有较高的持水力，可能贡献于S样品的持水力，这在含有乳清蛋白和多糖的酸奶中也有报道[16,20]。然而，微观结构显示S样品乳清通道更大，从而造成S样品的持水力显著性低于M样品的持水力。由于S样品中蛋白质含量高，蛋白质之间键更多，因此储能模量和损耗模量较高。PARK等[21]发现不同配比的脱脂乳和豆乳制备的酸奶的硬度随豆乳添加量的增加而增加。CHENG等[22]研究发现，豆乳酸奶的穿透力是纯牛乳酸奶的3倍。这些结果与本研究中S样品的模量值高于M样品的模量值的结果是一致的。酸奶贮存1 d时，S和M样品除味道外，在外观和质地上无显著性差异。与M样品的奶油味相比，S样品具有明显的大豆味。大豆气味在西方国家不受欢迎，因此在一些研究中仅用豆乳制备的酸奶风味得分低[1]。然而本研究的小组成员是常吃豆制品的中国人，因此S和M样品的感官总分无显著性差异。在贮存后期，S样品酸度增加、质地变得粗糙导致总分下降。
2.9 A、B、C组混合乳酸奶
在牛乳中添加豆乳可以增加蛋白质含量、降低脂肪含量，因此豆乳比例高的酸奶中蛋白质含量高、脂肪含量低。A、B、C样品同时含有益生元和必要营养物质(主要是乳糖)，因此A、B、C样品的发酵过程要快于M和S样品。SHAHABBASPOUR等[1]发现，用牛乳和豆乳混合制备的酸奶(质量比75∶25或50∶50)的pH值下降和酸度增加的速度比只用牛乳或豆乳制备的酸奶要快，这与本研究结果一致。GRYGORCZYK等[23]发现，在脱脂乳(2%蛋白质)和豆乳(2.5%蛋白质)与葡萄糖酸内酯的混合物中，大豆蛋白在酪蛋白胶束形成之前就已经聚集，因此未聚集的酪蛋白胶束被包裹在大豆蛋白凝胶的网状结构中。我们推测B和C样品中豆乳比例高，少量的酪蛋白胶束会阻碍发酵过程中大豆蛋白的聚集，导致微孔的形成，B样品比C样品的酪蛋白胶束更多，因此存在更多的微孔。在A样品中，大豆蛋白含量较低，酪蛋白胶束的聚集占据主要地位，因此微孔数量较少。与M样品相比，A、B、C样品的乳清通道更大，微孔数量更多。多孔的微观结构导致较差的持水力[20]。A样品的乳清通道更小，但存在微孔，因此A样品与S样品的持水力无显著性差异。多孔的微观结构导致B和C样品的持水力低于S样品的持水力。豆乳比例增加造成A、B、C样品的储能模量和损耗模量高于M样品，但A、B样品的储能模量和损耗模量仍低于S样品。酸奶贮存1 d时，A、B样品的总分均高于其他组。除质地和外观，A和B样品的风味较好，包括适宜的酸味、甜味和轻微的大豆味。C样品中豆乳比例较高，大豆味更重，因此总分低于A和B样品。贮存过程中，B样品的总分较高，酸度的增加造成贮存28 d 时总分下降。大豆蛋白的高持水力是贮存28 d时A样品的总分高于M样品的主要贡献者。C和S样品在贮存期间总分无显著性差异。
3 结论
与纯牛乳和纯豆乳制备的酸奶相比，混合乳酸奶显示出不同的理化性质、流变学特性、微观结构和感官特性。在纯牛乳和纯豆乳酸奶中，酪蛋白胶束或大豆蛋白的单独聚集赋予酸奶光滑的微观结构和较高的持水力。在混合乳酸奶中，酪蛋白胶束与大豆蛋白的双重聚集导致酸奶结构粗糙，产生大量微孔，持水力降低。然而，牛乳和豆乳的混合赋予酸奶独特的风味和良好的贮存品质，随着豆乳比例增加，混合乳酸奶的储能模量和损耗模量增加，大豆风味增强。整体上，m(牛乳)∶m(豆乳)=50∶50制备的酸奶在28 d贮存期内具有良好的风味、较高的感官分数和贮存稳定性。
[1] SHAHABBASPOUR Z, MORTAZAVIAN A M, POURAHMAD R, et al.The effects of ratio of cow′s milk to soymilk, probiotic strain and fruit concentrate on qualitative aspects of probiotic flavoured fermented drinks[J].International Journal of Dairy Technology, 2013, 66(1):135-144.
[2] SCALABRINI P, ROSSI M, SPETTOLI P, et al.Characterization of Bifidobacterium strains for use in soymilk fermentation[J].International Journal of Food Microbiology, 1998, 39(3):213-219.
[3] TSANGALIS D, SHAH N P.Metabolism of oligosaccharides and aldehydes and production of organic acids in soymilk by probiotic Bifidobacteria[J].International Journal of Food Science and Technology, 2004, 39(5):541-554.
[4] GRANATA L A, MORR C V.Improved acid, flavor and volatile compound production in a high protein and fiber soymilk yogurt-like product[J].Journal of Food Science, 1996, 61(2):331-336.
[5] PHAM T T, SHAH N P.Biotransformation of isoflavone glycosides by Bifidobacterium animalis in soymilk supplemented with skim milk powder[J].Journal of Food Science, 2007, 72(8):M316-M324.
[6] RUI X, ZHANG Q Q, HUANG J, et al.Does lactic fermentation influence soy yogurt protein digestibility-A comparative study between soymilk and soy yogurt at different pH[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 2019, 99(2):861-867.
[7] DRAKE M A, CHEN X Q, TAMARAPU S, et al.Soy protein fortification affects sensory, chemical, and microbiological properties of dairy yogurts[J].Journal of Food Science, 2000, 65(7):1 244-1 247.
[8] KAZEMI A, MAZLOOMI S M, HASSANZADEH-ROSTAMI Z, et al.Effect of adding soymilk on physicochemical, microbial, and sensory characteristics of probiotic fermented milk containing Lactobacillus acidophilus[J].Iranian Journal of Veterinary Research, 2014, 15(3):206-210.
[9] MULLIN W J, FREGEAU-REID J A, BUTLER M, et al.An interlaboratory test of a procedure to assess soybean quality for soymilk and tofu production[J].Food Research International, 2001, 34(8):669-677.
[10] WANG F, TONG Q G, LUO J, et al.Effect of carrageenan on physicochemical and functional properties of low-fat Colby cheese[J].Journal of Food Science, 2016, 81(8):E1 949-E1 955.
[11] FERRAGUT V, CRUZ N S, TRUJILLO A, et al.Physical characteristics during storage of soy yogurt made from ultra-high pressure homogenized soymilk[J].Journal of Food Engineering, 2009, 92(1):63-69.
[12] LI H L, YANG C, CHEN C, et al.The use of trisodium citrate to improve the textural properties of acid-induced, transglutaminase-treated micellar casein gels[J].Molecules, 2018, 23(7):1 632.
[13] LI C K, SONG J H, KWOK L Y, et al.Influence of Lactobacillus plantarum on yogurt fermentation properties and subsequent changes during postfermentation storage[J].Journal of Dairy Science, 2017, 100(4):2 512-2 525.
[14] ZHAO L L, WANG X L, TIAN Q, et al.Effect of casein to whey protein ratios on the protein interactions and coagulation properties of low-fat yogurt[J].Journal of Dairy Science, 2016, 99(10):7 768-7 775.
[15] MARAFON A P, SUMI A, GRANATO D, et al.Effects of partially replacing skimmed milk powder with dairy ingredients on rheology, sensory profiling, and microstructure of probiotic stirred-type yogurt during cold storage[J].Journal of Dairy Science, 2011, 94(11):5 330-5 340.
[16] RAIKOS V, GRANT S B, HAYES H, et al.Use of β-glucan from spent brewer′s yeast as a thickener in skimmed yogurt:Physicochemical, textural, and structural properties related to sensory perception[J].Journal of Dairy Science, 2018, 101(7):5 821-5 831.
[17] BONG D D, MORARU C I.Use of micellar casein concentrate for Greek-style yogurt manufacturing:Effects on processing and product properties[J].Journal of Dairy Science, 2014, 97(3):1 259-1 269.
[18] LEE S Y, MORR C V, SEO A.Comparison of milk-based and soymilk-based yogurt[J].Journal of Food Science, 1990, 55(2):532-536.
[19] MALAKI NIK A, ALEXANDER M, POYSA V, et al.Effect of soy protein subunit composition on the rheological properties of soymilk during acidification[J].Food Biophysics, 2011, 6(1):26-36.
[20] AKALIN A S, UNAL G, DINKCI N, et al.Microstructural, textural, and sensory characteristics of probiotic yogurts fortified with sodium calcium caseinate or whey protein concentrate[J].Journal of Dairy Science, 2012, 95(7):3 617-3 628.
[21] PARK D J, OH S, KU K H, et al.Characteristics of yogurt-like products prepared from the combination of skim milk and soymilk containing saccharified-rice solution[J].International Journal of Food Sciences and Nutrition, 2005, 56(1):23-34.
[22] CHENG Y J, THOMPSON I D, BRITTIN H C.Sogurt, a yogurt-like soybean product:Development and properties[J].Journal of Food Science, 1990, 55(4):1 178-1 179.
[23] GRYGORCZYK A, ALEXANDER M, CORREDIG M.Combined acid- and rennet-induced gelation of a mixed soya milk-cow′s milk system[J].International Journal of Food Science & Technology, 2013, 48(11):2 306-2 314.