具有良好风味德氏乳杆菌保加利亚亚种的筛选及其产香性能分析

酸奶是以新鲜牛奶为原料，经乳酸菌发酵制成的一种传统发酵乳制品[1-2]。酸奶中含有大量的活性乳酸菌，这些乳酸菌在发酵过程中可产生多种代谢产物，包括有机酸、胞外多糖、风味化合物以及人体所必需的维生素和矿物质等。这些菌体及其代谢产物具有改善酸奶风味，提高发酵乳营养价值，调节并维持肠道菌群平衡，抑制肿瘤和免疫赋活等优良功能[3-5]。

乳酸菌在牛乳发酵和贮藏过程中可产生挥发性化合物，赋予产品独特的风味。近年来，一些国内外研究学者采用固相微萃取(solid phase micro-extraction，SPME)和GC-MS技术从发酵乳制品中检测出多种风味化合物。如2014年，PAN等[6]采用SPME-GC-MS技术分析戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)发酵乳中的挥发性风味物质，发现乙醇、2，3-丁二酮和乙酸等化合物对产品风味的形成发挥重要作用；BELT width=14,height=17,dpi=110

N-BARRIENTOS等[7]利用此项技术从乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)发酵乳中鉴定了酸类、醛类、酮类、醇类等化合物。李安等[8]运用GC-MS技术对开菲尔，西藏灵菇乳以及开菲尔粒-西藏灵菇混合发酵乳中的挥发性风味化合物进行检测，发现开菲尔粒-西藏灵菇混合发酵乳的风味明显优于其他2组。

德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)是生产酸奶及发酵乳制品的常用菌株之一，在酸奶发酵和贮藏过程中可产生多种风味化合物[9-10]。本实验采用SPME-GC-MS技术，以科汉森公司提供的商业发酵剂为对照组，从分离自传统发酵乳制品中的具有良好发酵特性的德氏乳杆菌保加利亚亚种中筛选出1株具有良好风味的菌株，并在此基础上继续分析该菌株在牛乳发酵和贮藏过程中产生的挥发性风味化合物，为酸奶发酵剂的开发应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株来源

实验用菌株及来源如表1所示。

脱脂乳粉，美国New Zealand公司；全脂乳粉，美国Fonterra公司；MRS液体培养基，赛默飞世尔科技(北京)有限公司；实验气体：高纯氦(纯度>99.999%)。

ZHJH-C1214C型超净工作台、DHP-9272型生化培养箱，上海一恒科技有限公司；SRH60-70型高压均质机，上海申鹿均质机有限公司；7890B GC-5977A MSD型GC-MC仪、HP-5毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美国Agilent公司；手动SPME进样手柄、二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)萃取头(50/30 μm)，美国Supelco公司。

1.4.1 制备培养基

于100 g/L脱脂乳粉培养基中添加1 g/L酵母粉，灭菌(115 ℃,7 min)，制备脱脂乳培养基；按11.5∶100(g∶mL)配制成全脂乳粉培养基，均质(60 ℃,20 MPa)2次后，95 ℃灭菌10 min，急冷备用。

按照体积分数为2%的接种量，将实验菌株接种于脱脂乳培养基中，37 ℃培养24 h，然后以同样的接种量接种于MRS液体培养基中，37 ℃继续培养 24 h，以同样方式连续传代培养2～3次。

按照5×106 CFU/mL接种量把上述活化的菌株接种于全脂乳培养基中，在42 ℃下发酵，直至发酵乳pH值降至4.5，停止发酵，得到发酵乳样品。

1.4.4 发酵乳中风味物质的检测方法

样品前处理：将5 mL发酵乳样品装入15 mL样品瓶中，55 ℃下平衡10 min，将老化(250 ℃，5 min)后的萃取头插入样品瓶中萃取50 min后插入气相色谱仪进样口中，于250 ℃下解吸附3 min。

气相色谱条件：起始温度35 ℃，保持5 min；以5 ℃/min 升温至140 ℃，保持2 min；以10 ℃/min继续升温至250 ℃。进样口温度250 ℃；传输线温度250 ℃；载气为He，流速1.0 mL/min；不分流进样。

质谱条件：电离方式为EI源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；质量扫描范围m/z 35～500；发射电流100 μA，检测电压1.4 kV，无溶剂延迟。

2 结果与分析

2.1 发酵乳中风味化合物比较分析

采用SPME-GC-MS技术，以商业发酵剂为对照组，比对分析6株德氏乳杆菌保加利亚亚种在牛乳发酵终点时产生的挥发性风味化合物，结果如表2所示。酸类化合物能赋予发酵乳酸爽的口感[11-12]。Tb1-1、MGA17-6发酵乳和对照组中均检测到乙酸，分别为6.8%、4.01%和3.68%。MGD4-2发酵乳中己酸的相对含量最高，达到9.14%，其次为Tb1-1，对照组中未检测到己酸。乙醛是发酵乳中的重要特征风味化合物，一定浓度的乙醛可以赋予产品良好的风味，但浓度过高时会产生刺鼻气味[13]。除MGB30-1、MGB45-5外，其他发酵乳和对照组中均检测到乙醛。乙偶姻可赋予发酵乳浓郁的奶油香味[14]。MGB30-1、MGD4-2和Tb1-1发酵乳中均检测到乙偶姻，其相对含量分别为7.08%、9.63%和17.4%。醇类化合物阈值较高，对发酵乳风味影响较小，但醇类化合物可使发酵乳风味更加饱满[15]。除MGB30-1外，其余5组德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵乳中均检测到1-壬醇，其相对含量分别为1.8%、2.64%、3.91%、2.47%、0.49%和0.54%。甲酸乙烯酯可赋予发酵乳愉快的水果甜味[16]。MGB30-1、MGD4-2、MGA17-6发酵乳中均检测到甲酸乙烯酯，其中MGB30-1发酵乳中甲酸乙烯酯含量最高，达到61.17%。

主成分分析(principal component analysis，PCA)是一种经典的特征抽取降维技术，通过少数几个主分量来解释多变量间的内部关系，并通过图形间重叠部分的大小与距离远近直观反映化合物间的相似成分。本试验通过对6株德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵乳和对照组JD中的挥发性风味化合物在发酵终点时产生的挥发性物质成分进行PCA，结果如图1所示。6株德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵乳和对照组可聚为3个类群，其中MGD4-2与Tb1-1聚为一类，MGB29-2和MGB45-5聚为一类，MGB30-1、MGA17-6和对照组JD聚为一类。观察发现，MGB30-1与对照组无重叠部分且有较小距离，MGA17-6与对照组两者之间距离最近且有部分重叠，说明MGA17-6发酵乳中的挥发性风味化合物组成及含量与对照组相似度最高，有较好的开发利用研究价值，因此，选择MGA17-6作为实验菌株，进一步分析该菌株从牛乳发酵到贮藏期间产生挥发性风味化合物的动态变化规律。

2.2 发酵乳中风味化合物动态变化

MGA17-6在牛乳发酵(3、6 h)和贮藏(0、1、3、7、14 d)期间产生酸类、醛类、酮类、酯类、醇类、碳氢类、含氮类和杂环类等化合物，其中一些对发酵乳风味的形成有影响的挥发性化合物的种类和相对含量如表3所示。

2.2.1 酸类化合物

酸类化合物一般由脂肪分解与微生物发酵产生[17]。乙酸是乳酸菌发酵产生的重要酸类化合物之一[18]，在发酵后期(6 h)和贮藏期间其相对含量分别为3.66%、4.01%、4.68%、6.09%、4.91%和7.88%。己酸可赋予发酵乳酸味、脂肪味及乳酪味[19]，试验结果发现，己酸从发酵初期至贮藏后期相对含量分别为1.07%、2.42%、3.43%、4.25%、3.49%、1.58%、0.56%，呈先上升后下降的趋势，于贮藏1 d时达到峰值。辛酸具有微弱水果酸味[20]，在发酵和贮藏期间其相对含量分别为0.32%、1.22%、1.80%、1.80%、2.29%、1.55%和2.04%，整体呈上升趋势。

2.2.2 醛类化合物

醛类化合物阈值较低，对发酵乳风味的构成具有重要作用[21]。乙醛是发酵乳中的重要风味化合物。一般认为，德氏乳杆菌保加利亚亚种是生产乙醛的主要菌株，主要是因为德氏乳杆菌保加利亚亚种不含乙醛脱氢酶，可以使乙醛不被还原而在发酵乳中累积[22]。本实验中乙醛相对含量较高，特别是在贮藏0 d时达到峰值(30.09%)。庚醛具有强烈的油脂味[23]，发酵和贮藏期间均检测到庚醛。

2.2.3 酮类化合物

酮类化合物是由多不饱和脂肪酸经氧化或热降解、氨基酸降解或微生物代谢所产生[24]。在鉴定的酮类化合物中，2-庚酮具有轻微的药香气味[25]，在发酵和贮藏期间检测到2-庚酮的相对含量分别为26.83%、14.62%、11.99%、16.90%、11.53%、14.10%和8.35%，远高于其他酮类化合物。此外，相对含量较高的酮类化合物还有2-壬酮，2-壬酮具有乳酪、奶香气味[26]，在发酵(3、6 h)和贮藏(0、1、3、7 d)期间相对含量分别为10.57%、6.34%、4.37%、7.33%、5.51%和4.59%。

2.2.4 酯类化合物

酯类化合物是发酵乳中重要挥发性化合物，具有很低的香味阈值，对发酵乳风味的形成影响较大[27]。本实验所检测到的酯类化合物中，相对含量较高的有甲酸乙烯酯，其在发酵(3、6 h)和贮藏(0、1、3 d)期间相对含量分别达到2.68%、5.68%、7.92%、6.23%和4.63%，整体呈先上升后下降的趋势，是发酵乳中重要的风味化合物。

2.2.5 醇类化合物

本实验检测到的醇类化合物主要有(S)-1，3-丁二醇、2-己氧基-乙醇、1-己醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基正乙醇等。在这些醇类化合物中，一些低分子醇在发酵和贮藏期间的相对含量较高，如1-己醇的相对含量分别为2.01%、2.56%、2.21%、2.93%、3.52%、3.22%和2.71%。

2.3 发酵和贮藏期间发酵乳中挥发性风味物质热图聚类分析

利用热图对MGA17-6在牛乳发酵和贮藏过程中产生的挥发性风味物质进行聚类分析，结果如图2所示。根据热图的垂直方向，所有样品被分为两大类，发酵初期(3 h)、发酵后期(6 h)及贮藏初期(0、1 d)与贮藏中后期(3、7、14 d)挥发性风味化合物的种类与相对含量差异明显，发酵初期与发酵后期风味化合物较为相似，贮藏初期、贮藏中期发酵乳中挥发性风味化合物的种类和含量相似度较高，说明牛乳在发酵和贮藏期间发酵乳的品质发生了明显变化。香气成分种类繁多，物质间相互作用，赋予发酵乳良好的品质[10]，如醛类物质化学性质活泼，主要通过氨基酸降解产生，多为中间体化合物，一般不能稳定存在，在后熟阶段容易被还原成相应的酸类化合物和醇类化合物[28]。醇类化合物的生成与乳糖代谢、甲基酮还原、氨基酸代谢、亚油酸和亚麻酸降解有关[29]，分子质量较小的酸类物质与醇类物质发生酯化反应产生酯类化合物。

3 结论

(1)以科汉森公司提供的发酵剂为对照，采用SPME-GC-MS技术分析6株德氏乳杆菌保加利亚亚种在牛乳发酵终点(pH 4.5)时产生的风味物质，从中筛选出1株具有良好风味的菌株(MGA17-6)。

(2)MGA17-6在牛乳发酵和贮藏期间产生的主要风味化合物包括酸类、醛类、酮类、酯类、醇类等，其中一些重要的化合物如乙酸、乙醛、庚醛、乙偶姻、1-庚醇等对发酵乳的风味产生重要的影响。

(3)在发酵和贮藏期间，MGA17-6发酵乳中的挥发性风味物质的聚类分析结果表明，发酵乳中的风味物质在牛乳发酵及贮藏期间变化显著，发酵初期(3 h)、发酵中后期(6 h)、贮藏初期(0、1 d)与贮藏中后期(3、7、14 d)差异显著，说明发酵及贮藏期间发酵乳中的挥发性风味化合物的种类与相对含量差异明显。

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具有良好风味德氏乳杆菌保加利亚亚种的筛选及其产香性能分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论

Screening of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus with good flavor properties and analysis of its aroma production