中国市售酱腌菜中生物胺含量分析

生物胺是一类低分子质量的含氮有机化合物，主要通过氨基酸脱羧形成。根据结构可划分为脂肪族胺(腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等)、芳香族胺(酪胺、苯乙胺等)、杂环族胺(组胺、色胺等)。根据组成可分为单胺(组胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、苯乙胺等)和多胺(精胺、亚精胺等)[1-3]。

发酵食品本身存在或发酵过程中污染面存在的含氨基酸脱羧酶的微生物，它们利用底物中的游离氨基酸脱羧产生生物胺[4]。由于发酵过程通常会导致微生物生长和游离氨基酸的产生，这为生物胺的积累提供了前提条件。常报道发酵肉、奶制品、鱼产品和发酵蔬菜中生物胺含量偏高[5]。人体适量摄入生物胺能促进生长、增强代谢活力、清除自由基等，但摄入过多可能会引起恶心、头痛和呼吸不适等不良反应[6-7]。

酱腌菜是一种以新鲜蔬菜为主要原料制成的蔬菜产品，添加或不添加香料，经盐或食用盐水处理而成，是我国生鲜蔬菜最基本和最主要的贮藏及加工方式[8]。在中国市场上商业化的酱腌菜主要包括四川泡菜、东北酸菜、辣白菜、冬菜、宜宾芽菜、现代工业泡菜、调味海带等。根据主要加工特征，将酱腌菜分为强发酵、弱发酵和不发酵。以泡菜为代表的酱腌菜，目前仍以自然发酵为主，依赖于蔬菜表面的以乳酸菌为主的微生物，生物胺的产生不可避免[9-10]。

考虑到生物胺的毒理学意义以及发酵食品风险评估的数据支持，本研究的目的是阐明某些类型的酱腌菜是否是高含量生物胺来源，因为这与消费者饮食健康直接相关。因此，本文采用高效液相色谱法对全国299个酱腌菜样品中的生物胺含量进行检测，根据区域、蔬菜品种、工艺等特征分析生物胺差异，找出影响生物胺产生的主要影响因素。

1 材料与方法

根据全国各地酱腌菜产量确定采购的相对数量，从线上平台以及全国各地企业进行采样，共收集到299个酱腌菜样品，其中包装样品(n=139)来自四川、黑龙江、沈阳、山东、河北、广东、吉林和天津。散装的样品(n=160)主要来自四川，是从家庭、农贸市场、餐馆和四川工厂收集，包含现代工业泡菜样品(n=51)。将包装好的产品密封并在冷藏条件下或室温下保存。在室温下24 h内分析未包装腌菜的样品。根据发酵特性，将299个样品分为强发酵类(n=77，东北酸菜、现代工业泡菜半成品)、弱发酵类(n=151，传统四川泡菜、辣白菜、冬菜、宜宾芽菜等)、不发酵类(n=77，现代工业泡菜成品和调味海带等)。各工艺酱腌菜特征及取样量如图1所示。

组胺二盐酸盐(98%，histamine dihydrochloride，HIM)、腐胺(99.9%，putrescine，PUT)、苯乙胺(97.5%，2-phenylethylamine，PHE)、尸胺(98%，cadaverine，CAD)、色胺(≥97.5%，tryptamine，TRPM)、酪胺(≥98.5%，tyramine，TYM)、亚精胺(≥98%，spermidine，SPD)、亚精胺(≥98%，spermine，SPM)和1,7-二氨基庚烷(98%，internal standard，IS), 美国Sigma公司；丹磺酰氯(≥98%)，上海麦克林生化科技有限公司；乙腈(色谱纯)和甲醇(色谱纯)，上海安谱科学仪器有限公司；丙酮、盐酸、高氯酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、氨水、乙酸铵和三氯乙酸等均为分析纯试剂，成都市科隆化学品有限公司。

LC-2030 高效液相色谱分析仪，日本岛津仪器公司；HH-6 数显恒温水浴锅，上海析达仪器有限公司；TGL-20bR冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；VORTEX-2 旋涡混合器，美国GENE公司；TP-214 分析天平，美国DENVER公司。

1.4.1 生物胺标准溶液及内标配制

生物胺单标储存液：准确称量酪胺、色胺、苯乙胺、精胺、亚精胺、腐胺、尸胺和组胺标准品0.01 g，用0.1 mol/L HCl溶液溶解后定容为1 mg/mL的标准储备溶液，置于-20 ℃下储存。

内标使用液的配制：准确称取1,7-二氨基庚烷0.1 g，用0.1 mol/L HCl溶液稀释呈10 mg/mL的内标标准储备溶液，使用时采用梯度稀释至0.1 mg/mL，现用现配。

生物胺混标使用液：分别吸取各单标储存液1 mL，用0.1 mol/L HCl溶液配制成100 μg/mL的混标液，备用。

1.4.2 生物胺提取和衍生

参考MORET等[11]和FR width=8,height=17,dpi=110

AS等[12]的方法，并进行优化。称取10 g切碎研磨后的样品置于离心管中，加入1.25 mL 1.0 mg/mL内标使用液和15 mL 0.1 mol/L HCl溶液进行混匀，振荡提取30 min，4 000 r/min的转速下离心20 min，得到上清液1，沉淀部分加入15 mL 0.1 mol/L HCl溶液进行混匀，振荡提取30 min，4 000 r/min的转速下离心20 min，得到上清液2，合并2次取得的上清液，用0.1 mol/L HCl溶液定容至50 mL。取1.0 mL上述溶液，依次加入200 μL 2 mol/L NaOH溶液、300 μL饱和NaHCO3溶液和2.0 mL 10 mg/mL丹磺酰氯溶液，于40 ℃ 下避光反应60 min，然后加入200 μL 100 mg/mL 脯氨酸溶液，漩涡1 min后于室温避光放置15 min，然后加入0.4 g NaCl漩涡振荡至NaCl完全溶解后加入1 mL 乙醚，涡旋振荡30 s，待静置分层后取上层有机相，重复萃取1次，合并两次有机相。将有机溶剂于40 ℃水浴中挥干，然后用1.0 mL乙腈溶解残留物，再用0.22 μm滤膜过滤待测。

1.4.3 高效液相色谱条件

色谱柱：Agilent ZOBAX SB-Aq-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为乙腈∶0.01 mol/L乙酸铵溶液(90∶10，V/V)，流动相B为0.01 mol/L乙酸铵溶液∶乙腈(90∶10，V/V)；流速：0.8 mL/min；紫外检测波长：254 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；采用梯度洗脱，洗脱程序如表1所示。

2 结果与分析

2.1 生物胺标曲及回收率

为了评估分析方法的性能，结果如图2和表2所示。酱腌菜中8种生物胺峰型独立，生物胺的线性范围为0.25～60 mg/L，相关系数R2为0.991 1～0.994。以信噪比(S/N)大于3和10分别作为检出限和定量限的判断标准，得出检出限为0.06～0.36 mg/L，定限量为0.20～1.19 mg/L。以上结果表明本方法可有效检测痕量生物胺。

为评估方法在酱腌菜中的实际适用性，使用HPLC方法分析3种不同质量浓度生物胺添加到酱腌菜中的回收率。结果如表3所示，回收率在71%～105%，相对标准偏差为0.01%～0.57%，相对标准偏差<5%。说明酱腌菜中的基质对HPLC方法测定生物胺的影响很小，该方法检测酱腌菜中生物胺含量是可靠的。

2.2 强发酵类酱腌菜生物胺含量

收集到的71个强发酵类型酱腌菜包括20个东北酸菜和51个现代工业泡菜半成品。其中东北酸菜属于低盐、低温、长时间发酵，现代工业泡菜发酵成熟后大多采用高盐长时间贮藏，两者都属于深度发酵泡菜，含大量乳酸，其总酸含量普遍达到为10 g/kg(数据未显示)。强发酵类酱腌菜生物胺含量如表4所示，包装的东北酸菜生物胺平均含量约为(613.4±163.1) mg/kg(n= 20)，含量在364.4～968.2 mg/kg，研究结果与LIU等[9]和KALAC等[13]相一致。51个现代工业泡菜半成品生物胺平均含量为(800.4±370.9) mg/kg(n= 51)，含量在106.4～1 708.5 mg/kg，其中有27%的样品中生物胺含量超过1 000 mg/kg。有研究报道，当食品中的总生物胺含量超过1 000 mg/kg时对健康有风险[14-16]。现代工业泡菜中高含量生物胺的累积可能归因于长时间发酵，其中RABIE等[17]研究发现德国酸菜贮藏45 d后的生物胺总量高达1 553 mg/kg，组胺和酪胺的含量都高于200 mg/kg。PE width=14,height=14,dpi=110

AS等[18]也研究得出贮藏时间对德国酸菜中生物胺含量有显著的影响。其中氨基酸脱羧酶的微生物扮演着重要的作用，唐垚等[19]从四川泡菜中筛选出解鸟氨酸拉乌尔菌，含有赖氨酸脱羧酶cacd基因和组氨酸脱羧酶hdc基因，回接发酵48 h产尸胺达(766.67±2.17) mg/L。基于此，筛选及接种不产生物胺的乳酸菌来调控泡菜发酵，从源头上减少生物胺的形成是一种有效途径。LARANJO等[20]和RABIE等[17]提出采用乳酸菌发酵剂可以减少泡菜中生物胺的累积，RABIE等[17]将植物乳杆菌2142、干酪乳杆菌干酪亚种2763和弯曲乳杆菌2771接种于自然发酵泡菜中，总的生物胺含量仍大大低于对照组，所有泡菜中腐胺降低10倍。

强发酵类酱腌菜中8种生物胺分布如表5所示，腐胺、尸胺、组胺和酪胺是东北酸菜和现代工业泡菜半成品中的主要生物胺，其中尸胺含量最高。组胺和酪胺被认为是毒性最高的，特别是与不良健康影响有关[21]，其中腐胺和尸胺被称为组胺的增强剂[22]。另外，腐胺和尸胺可以与亚硝酸盐结合形成可致癌的N-亚硝胺[23-24]。然而有关总生物胺毒性的研究比较有限，大多数集中在组胺和酪胺，当组胺摄入量为8～40、40～100和高于100 mg时分别可能引起轻度、中度和重度中毒[25]。摄入100 g组胺含量高于400 mg/kg的食物会引起中毒，欧盟和美国食品药品监督管理局分别将组胺含量限定为100和50 mg/kg[26]。组胺是我国唯一被正式限制的生物胺，在鱼制品中限定为300 mg/kg，而酱腌菜中的生物胺含量没有官方限制。若以国际上组胺的限量，至少有50%东北酸菜样品和45%工业泡菜半成品是不合格。据报道，酪胺的最高允许含量为100～800 mg/kg，摄入过量是有毒的[14]。目前，尚未建立对食品中腐胺和尸胺的官方限量标准，RAUSCHER等[23]建议将泡菜腐胺和尸胺的最高容许浓度分别设定为140和430 mg/kg。若根据酪胺、腐胺和尸胺的建议含量，至少50%东北酸菜样品和73%的现代工业泡菜半成品可能对健康有风险，但两者都不直接食用，都属于酱腌菜加工过程中的原料，后期经过清洗等，生物胺浓度会出现大幅降低。

强发酵类酱腌菜中发现的主要生物胺是腐胺、尸胺、组胺和酪胺。生物胺积累主要归因于酱腌菜的生产过程，在相同工艺中，蔬菜类型是影响生物胺产生的重要因素。工业泡萝卜半成品显示出最低的生物胺含量，平均含量为(383.6±180.0) mg/kg，和其他原料半成品间呈显著性差异(P<0.05)，而工业泡豇豆半成品具有较高的生物胺含量，平均含量达到(1 113.0±434.1) mg/kg。尽管半成品酱腌菜显示出较高的生物胺含量，但通常不直接用于消费，这些酱腌菜作为现代工业泡菜生产的原料。

2.3 强发酵类酱腌菜生物胺含量

根据发酵程度差异，弱发酵类酱腌菜包含传统四川泡菜、辣白菜、芽菜、冬菜等，属于地方特色产品，总酸含量介于0.3～0.4 g/kg，其生物胺含量如表6和表7所示。收集到不同蔬菜原料和不同包装形式的传统四川泡菜样品87个，平均生物胺含量为(126.2±162.1) mg/kg，介于9.9～987.8 mg/kg。不同蔬菜原料制备的传统四川泡菜生物胺含量差异明显，其中由青芥菜制成的泡菜生物胺含量[(323.3±317.2) mg/kg，n = 10]比其他蔬菜原料泡菜明显更高。与强发酵类酱腌菜生物胺结果相一致，腐胺、尸胺、组胺和酪胺是传统四川泡菜中的主要生物胺，但腐胺浓度最高，达到(44.1±47.0) mg/kg。根据国际上对组胺的限量，传统四川泡菜大部分属于合格产品。根据酪胺、腐胺和尸胺的建议含量，2.3%的传统四川泡菜可能存在健康风险。辣白菜生物胺含量[(147.0±123.5) mg/kg，n=12]与传统四川泡菜类似，范围介于65.8～486.2 mg/kg，主要生物胺为腐胺、尸胺和酪胺，但组胺含量较低，尸胺含量高达(80.6±47.0) mg/kg。其他样品生物胺平均含量为(175.9±127.3) mg/kg，介于15.6～666.5 mg/kg，仅发现1个样品生物胺含量超过500 mg/kg。综合来看，腐胺、尸胺、组胺和酪胺是我国地方特色酱腌菜中最常见的生物胺，其中尸胺含量偏高，达到(74.4±57.5) mg/kg。

以芽菜和冬菜为代表的高盐、低水分等作用下，微生物作用弱，生物胺积累少；大部分餐馆中的传统四川泡菜属于“洗澡泡菜”，又称“过夜泡菜”，其发酵时间短，产酸量低等，泡菜中生物胺主要来自原料和泡菜液长期累积的生物胺。弱发酵类酱腌菜发酵程度低，生物胺的积累较少，腌制质量更好。有趣的是辣白菜中组胺含量较低，可能与其发酵环境不利于产组胺微生物的生长，使组胺的积累少。发酵程度越深，将产生更多的生物胺，这主要与产胺微生物有关。

在相同的工艺生产中，生物胺的产生也受蔬菜类型的影响。弱发酵类酱腌菜中的叶类蔬菜(青芥菜)和果类蔬菜(豇豆)比根类蔬菜(萝卜)更容易产生生物胺。传统泡豇豆生物胺含量[(222.1±219.0) mg/kg，n=11]比泡辣椒[(83.3±59.3) mg/kg，n=11]明显更高，即使豇豆和辣椒都是水果蔬菜。该结果可能归因于蔬菜表面的微生物差异和产胺微生物的数量。散装泡甘蓝中生物胺含量明显高于包装产品，这可能是家庭、餐馆加工的卫生环境比工厂化加工环境差有关。由于工厂包装产品经过灭菌处理，而散装样品在运输和存储过程中容易受到污染，导致生物胺累积。

2.4 不发酵类酱腌菜生物胺含量

不发酵酱腌菜包含现代工业泡菜成品和调味海带，其生物胺含量如表8所示，所有产品生物胺含量都低于500 mg/kg，其中现代工业泡菜成品生物胺含量[(177.6±105.1) mg/kg，n=70]明显低于半成品[(800.4±370.9) mg/kg，n=51]，介于21.2～493.9 mg/kg。相比半成品，可能是由于在加工过程中的脱盐和脱水工序使生物胺浓度被稀释。工业泡萝卜产品显示出最高的生物胺含量，达到(203.4±143.9) mg/kg，值得注意。调味海带生物胺含量明显低于蔬菜制品的酱腌菜，包装和散装调味海带生物胺的含量相一致[(36.2±27.9) mg/kg，n = 19]，介于5.3～74.0 mg/kg。通常认为散装样品中生物胺平均含量较高，可能与发酵过程中违反了卫生指标和/或制造工艺不当有关。

不发酵类酱腌菜生物胺含量分布如表9所示，腐胺、尸胺、组胺和酪胺也是现代工业泡菜产品中主要的生物胺，其中尸胺含量高达(79.4±79.3) mg/kg。根据国际上组胺限量标准，现代工业泡菜产品中有4.3%(70个样品中的3个)超过100 mg/kg，存在健康有风险，仅有1个样品的酪胺高于100 mg/kg。

除萝卜外，由其他现代工业泡菜半成品制成的产品在通过脱盐和脱水过程显著降低了生物胺含量，从而使现代工业泡菜满足了食品安全要求。但是，由于原料和发酵程度的不同，现代工业泡菜样品比调味海带样品显示出更高的生物胺含量。19个调味海带中未发现色胺，并且95%(总计18个)中含有酪胺，且含量最高，平均浓度达(13.2±9.0) mg/kg，但明显低于大部分蔬菜制品酱腌菜。说明发酵过程对酱腌菜中生物胺的积累非常重要，不发酵类酱腌菜生物胺的含量取决于原料中生物胺的浓度，该结果和郭晓丽等[27]研究结果相一致。

3 结论

本文通过研究我国不同工艺299个酱腌菜样品中生物胺含量分布，首次比较不同加工酱腌菜中生物胺含量。尽管腌制食品安全性评估的结果尚需进一步补充，但在这项研究中发现了影响生物胺产生的主要因素。首先，加工工艺是产生生物胺的最重要因素。其次，蔬菜类型和卫生状况会影响酱腌菜中生物胺的积累。

大多数酱腌菜中的生物胺以腐胺、尸胺、组胺和酪胺为主，但辣白菜中组胺含量较低，调味海带的生物胺含量明显低于发酵类酱腌菜。从所有分析的样品中，至少有50%的东北酸菜样品、4.5%的传统四川泡菜样品和4.3%的现代工业泡菜样品超出了欧盟和美国食品药品监督管理局报告的组胺限量。因此，大多数商业化或家庭生产的泡菜都可以被认为是安全的。但是，需要一种更有效的质量控制系统来提高我国酱腌菜食品的安全性。

[1] BARD

CZ S, GRANT G, BROWN D S, et al.Polyamines in food—Implications for growth and health[J].The Journal of Nutritional Biochemistry, 1993, 4(2):66-71.

[2] DAPKEVICIUS M L E, NOUT M R, ROMBOUTS F M, et al.Biogenic amine formation and degradation by potential fish silage starter microorganisms[J].International Journal of Food Microbiology, 2000, 57(1-2):107-114.

[3] LEE J I, KIM Y W.Characterization of amine oxidases from Arthrobacter aurescens and application for determination of biogenic amines[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology volume, 2013, 29(4):673-682.

[4] ALVAREZ M A, MORENO-ARRIBAS M V.The problem of biogenic amines in fermented foods and the use of potential biogenic amine-degrading microorganisms as a solution[J].Trends in Food Science & Technology, 2014, 39(2):146-155.

[5] ORD

EZ J L, TRONCOSO A M, GARC width=5,height=14,dpi=110

A-PARRILLA M D C, et al.Recent trends in the determination of biogenic amines in fermented beverages-A review[J].Analytica Chimica Acta, 2016, 939:10-25.

[6] SPANO G, RUSSO P, LONVAUD-FUNEL A, et al.Biogenic amines in fermented foods[J].European Journal of Clinical Nutrition, 2010, 64(3):95-100.

[7] 刘景, 任婧, 孙克杰.食品中生物胺的安全性研究进展[J].食品科学, 2013, 34(5):322-326.

LIU J, REN J, SUN K J.Safety of biogenic amines in foods[J].Food Science, 2013, 34(5):322-326.

[8] 陈功. 中国泡菜加工技术[M].北京:中国轻工业出版社，2011.

CHEN G.Chinese Paocai Processing Technology[M].Beijing:China Light Industry Press, 2011.

[9] LIU L, DU P, ZHANG G, et al.Residual nitrite and biogenic amines of traditional northeast sauerkraut in China[J].International Journal of Food Properties, 2017, 20(11):2 448-2 455.

[10] JUNG J Y, LEE S H, JEON C O.Kimchi microflora:History, current status, and perspectives for industrial kimchi production[J].Applied Microbiology & Biotechnology, 2014, 98(6):2 385-2 393.

[11] MORET S, SMELA D, POPULIN T, et al.A survey on free biogenic amine content of fresh and preserved vegetables[J].Food Chemistry, 2005, 89(3):355-361.

[12] FR

AS J, MART width=5,height=14,dpi=110

NEZ-VILLALUENGA C, GULEWICZ P, et al.Biogenic amines and HL60 citotoxicity of alfalfa and fenugreek sprouts[J].Food Chemistry, 2007, 105(3):959-967.

[13]

M, et al.Concentrations of seven biogenic amines in sauerkraut[J].Food Chemistry, 1999, 67(3):275-280.

[14] BILGIN B, GENÇCELEP H.Determination of biogenic amines in fish products[J].Food Science and Biotechnology, 2015, 24(5):1 907-1 913.

[15] FERNA-EZ M, FL width=11,height=14,dpi=110

REZ A B, LINARES D M, et al.Early PCR detection of tyraminea-producing bacteria during cheese production[J].The Journal of Dairy Research, 2006, 73(3):318-321.

[16] ROIG-SAGUÉS A X, MOLINA A P, HERNáNDEZ-HERRERO M.Histamine and tyramine-forming microorganisms in Spanish traditional cheeses[J].European Food Research & Technology, 2002, 215(2):96-100.

[17] RABIE M A, SILIHA H, EL-SAIDY S, et al.Reduced biogenic amine contents in sauerkraut via addition of selected lactic acid bacteria[J].Food Chemistry, 2011, 129(4):1 778-1 782.

[18] PE

AS E, FRIAS J, SIDRO B, et al.Impact of fermentation co-itions and refrigerated storage on microbial quality and biogenic amine content of sauerkraut[J].Food Chemistry, 2010, 123(1):143-50.

[19] 唐垚, 唐小曼, 明建英, 等.四川泡菜产生物胺细菌的筛选及产胺能力验证[J].中国调味品, 2019,44(7):81-84.

TANG Y, TANG X M, MING J Y, et al.Screening of amine-producing bacteria from Sichuan pickles and verification of amine-producing ability[J].China Condiment, 2019,44(7):81-84.

[20] LARANJO M, GOMES A, AGULHEIRO-SANTOS A C, et al.Impact of salt reduction on biogenic amines, fatty acids, microbiota, texture and sensory profile in traditional blood dry-cured sausages[J].Food Chemistry, 2017, 218:129-136.

[21] KUNG H F, LEE Y C, HUANG Y L, et al.Degradation of histamine by Lactobacillus plantarum isolated from miso products[J].Journal of Food Protection, 2017, 80(10):1 682-1 688.

[22] TAYLOR S L, EITENMILLER R R.Histamine food poisoning:Toxicology and clinical aspects[J].CRC Critical Reviews in Toxicology, 1986, 17(2):91-128.

[23] RAUSCHER-GABERNIG E, GABERNIG R, BRUELLER W, et al.Dietary exposure assessment of putrescine and cadaverine and derivation of tolerable levels in selected foods consumed in Austria[J].European Food Research & Technology, 2012, 235(2):209-220.

[24]

P.Health effects and occurrence of dietary polyamines:A review for the period 2005—mid 2013[J].Food Chemistry, 2014, 161(15):27-39.

[25] MAIJALA R, EEROLA S.Contaminant lactic acid bacteria of dry sausages produce histamine and tyramine[J].Meat Science, 1993, 35(3):387-395.

[26] SHALABY A R.Significance of biogenic amines to food safety and human health[J].Food Research International, 1996, 29(7):675-690.

[27] 郭晓丽, 李二虎, 王鲁峰, 等.一种新的柱前衍生RP-HPLC法分析酱腌菜中的生物胺[J].现代食品科技, 2017, 33(10):237-244.

GUO X L, LI E H, WANG L F, et al.Analysis of biogenic amines in pickled vegetable by a new pre-column derivatization of RP-HPLC[J].Modern Food Science & Technology, 2017, 33(10):237-244.

中国市售酱腌菜中生物胺含量分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结论

Analysis of the biogenic amines content in Chinese pickles