三七花是五加科人参属植物三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)的干燥花蕾。三七距今已有400多年的使用历史[1],在传统的使用习惯中多半以三七根及剪口入药,三七茎叶用来生产酒,而三七花则用来代茶饮用或者炒肉食用[2]。三七中公认的活性成分是皂苷类成分,即三七总皂苷[3],三七花是全株三七中皂苷含量最高的部位,在一级三七花中总皂苷含量达28.48%[4]。虽然在民间一直存在食用三七花的习惯,但因为没有相关的食品标准,不能作为普通食品原料开发利用,而且三七花经干燥处理后,易碎且不能长期储存[5],极大限制了三七花市场的发展。经过多年的努力,2016年云南省卫计委正式将三七花、茎叶作为普通地方特色食品原料进行管理[6],自此各类三七花保健产品相继问世,比如三七花醋[7]、三七花苷元牙膏[8]、三七花花生酥糖[9]、三七花菠萝夹心软糖[10]、三七花保健硬糖[11]、三七花啤酒[12]、三七花姜茶[13]等,但用三七花研制的复合饮料产品却较少,以三七花搭配玫瑰花研制的复合饮料就更少。本研究选用文山三七花、云南墨红玫瑰搭配白砂糖、蜂蜜、柠檬酸研制一款酸甜可口、色香俱全、营养丰富的三七花玫瑰饮料。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干燥三七花,云南文山中药材市场,经昆明理工大学崔秀明研究员鉴定为五加科人参属植物三七的干燥花蕾；干燥墨红玫瑰花瓣,云南省昆明市花太美花茶店；白砂糖,云南云县甘化有限公司；蜂蜜,云南滇云蜜语生物科技有限公司；柠檬酸,潍坊英轩实业有限公司；三七总皂苷(纯度>90%),上海源叶生物科技有限公司；人参皂苷Rc、Rb1、Rb2、Rb3对照品(纯度≥98%),四川省维克奇生物科技有限公司；95%(体积分数)食用乙醇,河南鑫河阳酒精有限公司；香草醛、冰乙酸、高氯酸,天津市致远化学试剂有限公司；色谱级甲醇、乙腈,德国Sigma-Aldrich公司。
1.2 仪器与设备
UV—2600紫外-可见分光光度计、SPD-20 A型高效液相色谱仪,日本岛津公司；UPT-I-20 T优普系列超纯水器,成都超纯科技有限公司；BL10-250A超声清洗仪,上海比朗有限公司；RE-5205旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂；MS-0212经济型磁力搅拌器,上海泰坦科技股份有限公司；BS-3型10L小型巴氏灭菌机,上东商厨电器科技有限公司；pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
1.3 工艺流程
三七花提取液浸膏制备：
三七花粉→过50目筛→食用乙醇回流提取→抽滤→减压浓缩滤液→浸膏。
墨红玫瑰花提取液制备：
干燥墨红玫瑰花瓣→研磨→水浴浸泡、超声辅助提取→抽滤→玫瑰花提取液。
三七花玫瑰复合饮料调配：
三七花提取液浸膏、白砂糖、蜂蜜、墨红玫瑰花提取液、柠檬酸→混合调配→均质→密封→加热灭菌→冷却→饮料成品。
1.4 操作要点
1.4.1 三七花总皂苷的制备
本实验采用乙醇回流法[14-16]对三七花中的总皂苷进行提取,用60%(体积分数)食用乙醇进行提取,料液比1∶14(g∶mL),提取时间1.5 h,温度60 ℃,过滤得滤液,滤渣按上述条件重复提取1次,合并滤液浓缩成浸膏,经比色法[17]测定所提取的三七花浸膏中三七总皂苷的含量为26.6%。
1.4.2 墨红玫瑰花提取液制备
墨红玫瑰花提取液制备工艺选用何菁等[18]优化的超声辅助水浸提法,水浴温度65 ℃,加热75 min,料液比1∶25(g∶mL),超声20 min。
1.4.3 三七花玫瑰复合饮料制作
称取三七花提取液浸膏用适量纯净饮用水超声溶解,加入白砂糖、蜂蜜、墨红玫瑰花提取液、柠檬酸粉,根据具体设计用纯净水补足复合饮料总质量,超声溶解10 min,磁力搅拌10 min,将饮料装入玻璃瓶中立即封口,82 ℃杀菌30 min,立即冰水浴20 min即得三七花玫瑰复合饮料成品。
1.4.4 三七花玫瑰复合饮料配方优化
复合饮料的主要用料是三七花提取液浸膏、白砂糖、蜂蜜、墨红玫瑰花提取液、柠檬酸,通过单因素试验及正交试验设计对三七花玫瑰复合饮料配方进行优化,得到一个具有统计学意义的最佳配方组合。
1.4.4.1 复合饮料配方优化的单因素试验
各因素水平分别设置为三七花浸膏0.03%、0.08%、0.13%、0.18%、0.23%；白砂糖2.50%、5.00%、7.50%、10.00%、12.50%；蜂蜜1.50%、3.00%、4.50%、6.00%、7.50%；墨红玫瑰花提取液1.50%、3.00%、4.50%、6.00%、7.50%；柠檬酸0.08%、0.10%、0.13%、0.15%、0.18%,均为质量分数。复合饮料感官评分由10名学生(5男,5女)组成的小组评价得出。
1.4.4.2 复合饮料配方优化的正交试验
在单因素试验基础上,选取3个因素水平设计正交试验,为使试验设计更加合理,将“误差项”也作为一个因素纳入试验设计,运用软件Minitab 15进行L27(36)的正交试验设计、结果分析和最佳配方预测。
1.5 感官评分方法
感官评价主要包括色泽、香味、滋味、组织状态4个方面,评分标准及分值比例如表1所示。
表1 感官评定标准表
Table 1 Sensory evaluation criteria
项目标准分值色泽(15分)呈鲜红色,色泽光亮,均匀一致11～15呈淡红色,色泽略暗,均匀不一5～10颜色暗淡,浑浊<5香味(20分)具有清爽的玫瑰香味16～20玫瑰香较淡,蜂蜜香味略明显10～15香味不协调<10滋味(50分)酸甜可口,口感润滑41～50酸甜不协调31～40口感较差,过酸、过苦或过甜<30组织状态(15分)透明清亮,无明显悬浮物11～15半透明,有少许悬浮物5～10有明显沉淀物<5
1.6 三七花特征皂苷的高效液相色谱分析
人参皂苷Rc、Rb1、Rb2、Rb3是三七花主要的特征性皂苷,对其含量的测定便于明确三七花玫瑰复合饮料中保健成分皂苷的含量。高效液相色谱分析条件：C18柱(5 μm,250 mm×4.6 mm)；检测波长203 nm；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL/min；进样量20 μL；流动相0.05%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)；洗脱程序:0～12 min,19% B；12～60 min,19%～36% B；60～75 min,36%～70% B；75～80 min,70%～100% B。分别精确称取人参皂苷Rc、Rb1、Rb2、Rb3 0.8、1.1、0.7、0.5 mg,用甲醇定容至10 mL,得到混合对照品溶液,分别吸取0.1、0.3、0.5、1、1.5、2.0、2.5 mL混合对照品溶液用甲醇定容至10 mL,用于标准曲线绘制,并对标准曲线方程进行包括精密度试验、稳定性试验、重复性试验、加样回收试验在内的方法学考察。
1.7 理化指标及微生物指标测定
总酸的测定参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》;还原糖的测定参照GB/T 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》;pH值的测定使用pH计。大肠菌群和菌落总数测定分别参照GB/T 4789.3—2016《食品微生物学检测大肠菌群计数》和GB/T 4789.2—2016《食品微生物学检测菌落总数测定》;微生物限量值参照食品安全国家标准GB 7101—2015《饮料》。
2 结果与分析
2.1 三七花玫瑰复合饮料配方优化
2.1.1 复合饮料配方优化的单因素试验
单因素试验结果如图1所示。结果表明三七花浸膏、墨红玫瑰花提取液、柠檬酸存在较高评分的添加量水平,而白砂糖、蜂蜜随添加量增加,感官评分呈上升趋势,这可能因为在一定甜度范围内,糖分含量越高产品越容易被人接受,但根据2016版《中国居民膳食指南》中每天摄糖量不超过50 g的相关建议,经综合考虑,白砂糖和蜂蜜的最适添加量分别选择7.50%、6.00%,三七花浸膏、玫瑰花提取液、柠檬酸的最适添加量分别为0.08%、6.00%、0.13%。
a-三七花浓缩浸膏添加量；b-白砂糖添加量；c-蜂蜜添加量；d-玫瑰花提取液添加量；e-柠檬酸添加量
图1 饮料配方优化的单因素试验结果
Fig.1 Single factor test results for beverage formulation optimization
2.1.2 复合饮料配方优化的正交试验
在单因素试验基础上,得如表2所示的正交因素水平表,运用软件Minitab 15进行L27(36)正交试验设计,结果如表3所示。
表2 正交因素水平表 单位：%
Table 2 Design of orthogonal test
水平因素三七花浸膏白砂糖蜂蜜玫瑰花提取液柠檬酸空白10.035.004.504.500.10120.087.506.006.000.13230.1310.007.507.500.153
表3 正交试验结果
Table 3 Orthogonal test results
三七花浸膏/%白砂糖/%蜂蜜/%玫瑰花提取液/%柠檬酸/%空白感官评分/分0.035.004.504.500.10179.440.035.004.504.500.13273.880.035.004.504.500.15376.770.037.506.006.000.10183.550.037.506.006.000.13282.220.037.506.006.000.15383.220.0310.007.507.500.10182.220.0310.007.507.500.13287.000.0310.007.507.500.15387.500.085.006.007.500.10267.830.085.006.007.500.13373.000.085.006.007.500.15177.000.087.507.504.500.10268.330.087.507.504.500.13374.550.087.507.504.500.15173.000.0810.004.506.000.10277.880.0810.004.506.000.13376.880.0810.004.506.000.15179.000.135.007.506.000.10367.000.135.007.506.000.13172.44
续表3
三七花浸膏/%白砂糖/%蜂蜜/%玫瑰花提取液/%柠檬酸/%空白感官评分/分0.135.007.506.000.15275.110.137.504.507.500.10374.440.137.504.507.500.13177.220.137.504.507.500.15277.660.1310.006.004.500.10371.330.1310.006.004.500.13173.000.1310.006.004.500.15276.77
对正交试验结果进行极差分析得表4的结果,各因素对复合饮料影响程度的顺序依次为：三七花浸膏>白砂糖>玫瑰花提取液>柠檬酸>蜂蜜。
表4 正交试验极差分析结果
Table 4 Range analysis results of orthogonal test
水平三七花浸膏白砂糖蜂蜜玫瑰花提取液柠檬酸空白181.7673.6177.0274.1274.6777.43274.1677.1376.4477.4876.6976.30373.8979.0676.3578.2178.4576.08Delta7.875.460.674.093.781.35排序125345
对正交试验结果进行方差分析得表5的结果,从结果可知,选取置信水平α=0.05时,三七花浸膏、白砂糖、墨红玫瑰花提取液、柠檬酸对复合饮料品质的影响具有显著性差异,而蜂蜜对其无显著性差异。最终得到复合饮料的最佳预测组合。三七花浸膏0.03%, 白砂糖10.00%, 蜂蜜4.50%, 玫瑰花提取液7.50%, 柠檬酸0.15%.此时预测响应值为88.088 5。
表5 感官评分的方差分析表
Table 5 Results of variance analysis of sensory scores
注：在检验中使用调整的平方和；“**”表示极显著；“*”表示显著
来源自由度平方和调整平方和调整均方FP显著性三七花浸膏2358.968358.968179.48431.080.000**白砂糖2137.791137.79168.89611.930.001**蜂蜜22.3852.3851.1930.210.816-玫瑰花提取液285.60285.60242.8017.410.006**柠檬酸264.36164.36132.1805.570.017*空白29.4879.4874.7430.820.460-误差1480.85180.8515.775合计26739.445
2.1.3 验证试验
按照软件预测的三七花玫瑰复合饮料最佳配方组合进行实际验证,最终得87.99的感官评分与预测值仅相差0.098 5分,说明模型建立良好,复合饮料的最佳配方预测结果可靠。
2.2 三七花特征皂苷的高效液相色谱分析
4种三七花特征性人参皂苷Rc、Rb1、Rb2、Rb3的高效液相色谱分析结果如图2所示。
a-混合对照品；b-未加热灭菌饮料；c-加热灭菌饮料；1-人参皂苷Rb1；2-人参皂苷Rc；3-人参皂苷Rb2；4-人参皂苷Rb3
图2 复合饮料中人参皂苷的高效液相色谱检测结果
Fig.2 HPLC detection results of ginsenoside in beverage
2.2.1 方法学考察
精密度试验。取人参皂苷Rc、Rb1、Rb2、Rb3混合对照品溶液适量,连续进样6次,计算峰面积。结果显示人参皂苷Rc、Rb1、Rb2、Rb3峰面积的相对标准差(relative standard deviation,RSD)分别为2.25%、1.89%、0.83%、2.55%,仪器精密度良好。
稳定性试验。取三七花玫瑰复合饮料成品适量,分别于室温下放置0、4、16、24 h后进样测定峰面积,Rc、Rb1、Rb2、Rb3峰面积的RSD分别为0.55%、0.24%、0.27%、0.42%。
重复性试验。取三七花玫瑰复合饮料成品适量,平行设置6份进行峰面积测定,结果人参皂苷Rc、Rb1、Rb2、Rb3峰面积的RSD分别为0.92%、0.66%、0.25%、1.24%。
加样回收试验。取一定量三七花玫瑰复合饮料成品,平行设置6份,通过已建立的标准曲线方程初步计算出饮料中4种人参皂苷的质量,再按质量比1∶1加入4种人参皂苷对照品。人参皂苷Rc、Rb1、Rb2、Rb3的加样回收率分别为98.13%、96.24%、95.61%、96.88%。
2.2.2 特征性皂苷含量测定
通过表6所示的标准曲线方程对三七花玫瑰复合饮料中的4种三七花特征性人参皂苷进行测定,结果如表7所示。高温灭菌过程会破坏三七花中人参皂苷的结构,导致复合饮料中保健成分人参皂苷含量降低。
表6 三七花特征性皂苷的标准曲线方程
Table 6 Standard curve equation of ginsenoside characteristic of Panax notoginseng flower
人参皂苷种类线性方程r线性范围/(mg·L-1)RcY=3 674 758X-2 4430.999 72.4～80Rb1Y=6 355 362X-7 2400.999 73.3～110Rb2Y = 5 372 906X-2 9260.999 82.1～70Rb3Y=7 707 215X-3 4890.999 71.5～50
表7 复合饮料中人参皂苷含量
Table 7 Ginsenoside content in beverage
注：(X±S,n=3)
人参皂苷种类饮料中人参皂苷含量/(mg·L-1)未加热灭菌已加热灭菌Rc6.679±0.0274.199±0.028Rb128.161±0.0062.252±0.011Rb28.667±0.0161.338±0.002Rb313.890±0.0131.740±0.016
2.3 复合饮料理化指标及卫生指标测定
三七花玫瑰复合饮料的理化指标及微生物指标测定结果如表8所示,其中的微生物指标限量值参照食品安全国家标准GB 7101—2015《饮料》,从结果可知该饮料的微生物指标合格。
表8 理化指标及微生物指标测定结果
Table 8 Detection results of physical and chemical indexes and microbial indexes
检测指标含量国标限量值总酸/(g·L-1)3.2-总糖/%15-pH2.91-大肠菌群数/(CFU·mL-1)<0.031总菌落数/(CFU·mL-1)15100
3 结论
本实验通过单因素试验和正交试验对三七花玫瑰复合饮料配方进行优化,得到的最佳配方组合是三七花浸膏0.03%,白砂糖10.00%,蜂蜜4.50%,墨红玫瑰花提取液7.50%,柠檬酸0.15%,用该配方配制的三七花玫瑰复合饮料成品酸甜可口,色香兼备。饮料成品中三七花特征性人参皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3的含量分别为4.20、2.25、1.34、1.74 mg/L。
在测定三七花总皂苷(主要是原人参二醇型皂苷)提取率时,使用的对照品是三七总皂苷,其中既含原人参二醇型皂苷也含原人参三醇型皂苷,用于表征提取效果虽然是可行的,但如果选用原人参二醇组苷元作为对照品,那么提取率的测定可能会更加准确。从三七花特征性皂苷含量测定结果来看,加热灭菌的过程会破坏皂苷结构,使保健成分减少,如果能改善饮料的灭菌方式,将会较大程度地保留其中的人参皂苷。
[1] 马逢升. 三七在养生保健方面的应用[J].云南中医学院学报,2000,23(1):51-52;54.
MA F S.The application of Panax notoginseng in health care[J].Journal of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,2000,23(1):51-52;54.
[2] 刘英. 三七地上部分新食品原料开发研究[D].昆明:昆明理工大学,2015.
LIU Y.Research and development of the aerial part of Panax notoginseng as new resource food[D].Kunming:Kunming University of Science and Technology,2015.
[3] 张静静, 刘桂芹,王庆鹏,等.植物三七中皂苷类化学成分的研究进展[J].聊城大学学报(自然科学版),2018,31(2):43-52;59.
ZHANG J J,LIU G Q,WANG Q P,et al.Researchprogress of chemical constituents of saponins in Panax notoginseng [J].Journal of Liaocheng University(Natural Science Edition),2018,31(2):43-52;59.
[4] 高明菊, 崔秀明,曾江,等.三七花的研究进展[J].人参研究,2009,21(2):5-7.
GAO M J,CUI X M,ZENG J,et al.Research progress of Panax notoginseng flowers[J].Ginseng Research,2009,21(2):5-7.
[5] 杨光, 崔秀明,陈敏,等.三七茎叶、三七花新食品原料研究[J].中国药学杂志,2017,52(7):543-547.
YANG G,CUI X M,CHEN M,et al.Research on using stems and leaves of Panax notoginseng and flowers of Panax notoginseng as new food ingredients[J].Chinese Pharmaceutical Journal,2017,52(7):543-547.
[6] 周家明, 赵爱,马妮,等.三七的养生保健应用[J].人参研究,2017,29(5):49-50.
ZHOU J M,ZHAO A,MA N,et al.The health care application of Panax notoginseng[J].Ginseng Research,2017,29(5):49-50.
[7] 罗永常, 韦正宏.一种三七花醋及其制备工艺[P].云南:CN107034122A,2017-08-11.
LUO Y C,WEI Z H.The invention relates to Panax notoginseng flower vinegar and its preparation process[P].Yunnan:CN107034122A,2017-08-11.
[8] 周家明, 王朝梁,赵爱,等.三七花苷元牙膏[P].云南:CN109077944A,2018-12-25.
ZHOU J M,WANG C L,ZHAO A,et al.The invention relates to toothpaste by Panax notoginseng flower aglycone[P].Yunnan:CN109077944A,2018-12-25.
[9] 曹洁. 三七花花生酥糖的研制[J].湖北农业科学2019,58(9):90-93;127.
CAO J.Development of crispy peanut candy with Sanchi flower[J].Hubei Agricultural Sciences,2019,58(9):90-93;127.
[10] 曹洁, 刘俊.三七花菠萝夹心软糖的研制[J].农产品加工,2019(1):20-22;26.
CAO J,LIU J.Development of bonbon of Sanchi flowers and pineapple[J].Farm Products Processing,2019(1):20-22;26.
[11] 曹洁, 刘俊.三七花保健硬糖的研制[J].文山学院学报,2018,31(6):31-34.
CAO J,LIU J.Development of notoginseng flower hard candy[J].Journal of Wenshan University,2018,31(6):31-34.
[12] 朱卓, 朱虹江.三七花啤酒的研制[J].云南中医学院学报,2018,41(6):19-21.
ZHU Z,ZHU H J.The development of notoginseng flower beer[J].Journal of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,2018,41(6):19-21.
[13] 谭晓明, 谢清欣.一种三七花姜茶制备方法[P].云南:CN109260451A,2019-01-25.
TANG X M,XIE Q X.The invention relates to a preparation method for Panax notoginseng flower ginger tea[P].Yunnan:CN109260451A,2019-01-25.
[14] 郑义, 陆辉.三七总皂苷的测定及提取工艺的优化研究[J].南京晓庄学院学报,2008(3):56-58.
ZHENG Y,LU H.Study on content determination and extraction nethod of total saponins in Panax notoginseng[J].Journal of Nanjing Xiaozhuang University,2008(3):56-58.
[15] 索建兰, 沈峰,米海林.三七总皂苷提取工艺的研究[J].药物分析杂志,2011,31(6):1 197-1 198.
SUO J L,SHEN F,MI H L.Study on extraction of total Panax notoginseng saponin[J].Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis,2011,31(6):1 197-1 198.
[16] 曾以旺, 王少平,陈燕瑞,等.三七乙醇提取工艺优选[J].辽宁中医药大学学报,2014,16(12):44-46.
ZENG Y W,WANG S P,CHEN Y R,et al.Optimization of Panax notoginseng ethanol extraction process[J].Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,2014,16(12):44-46.
[17] 杜金凤, 宋鉴达,朱传翔,等.比色法测定人参保健饮料中人参总皂苷含量[J].现代食品,2017(11):79-80.
DU J F,SONG J D,ZHU C X,et al.Determination of ginsenosides in Ginseng health drink by colorimetry[J].Modern Food,2017(11):79-80.
[18] 何菁, 吴荣书.玫瑰花洛神花复合浓缩饮料的研究及其成分测定[J].食品工业,2019,40(4):1-4.
HE J,WU R S.Study on the compound beverage of rose roselle and its components determination[J].The Food Industry,2019,40(4):1-4.