离心式圆盘状微流控芯片以离心力驱动液体流动,具有集成度高、通量大、易操作等特点,在食品安全快速检测[1-2]、临床诊断[3-4]等领域得到了广泛应用。但通常待测样品的前处理需要借助额外的设备[5-6],在芯片外部完成后再将检测液体转移至芯片中,大大降低了检测系统的集成度,因此在芯片内部储存微量液体试剂并完成样本前处理是微流控分析技术目前面临的挑战之一[7-8]。已有文献报道采用玻璃[9]和铝基复合薄膜[10]的液囊集成到芯片中,但玻璃液囊加工难度大、成本高,复合材料液囊的封装及液体释放条件要求苛刻。
基于农药残留对健康的危害性[11-12]和农残速测的紧迫性[13-14],微流控技术用于农残快速检测已见报道[15],但样品的前处理仍需在农残提取仪上完成,不利于检测效率的提高。本研究采用透明聚乙烯(polyethylene,PE)膜制备微型液囊储存液体试剂,并将其集成于芯片中,与预先固化反应试剂构成全集成微流控圆盘芯片,用于农药残留的快速检测。通过拇指按压挤破液囊的方式完成液体在线释放,实现从样品提取到最终检测的全集成和自动化操作,省去常规方法中必需的农残提取仪；结合实验室自制的便携式离心检测系统,可以实现对果蔬类产品农药残留的快速、大规模筛查。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA)板材、双面胶、PE、力致黏性膜,杭州九洋生物科技有限公司；乙酰胆碱酯酶(500 U/mg)、碘化硫代乙酰胆碱、5,5-二硫二硝基苯甲酸,国药集团化学试剂有限公司；克百威标准品,上海市农药研究所；pH 8.0磷酸盐缓冲溶液,中国计量科学院；小白菜,当地超市。
1.2 仪器与设备
Spirit LCD-30TI型激光精密切割机,广州里程科技发展有限公司；CoolSafe55型冷冻干燥机,香港药化科技公司；FR-400封口机,上海易诺包装材料有限公司；GL124型分析天平,德国赛多利斯；Master-S15超纯水系统,上海和泰仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 芯片的设计与制备
离心式微流控芯片由3层组成,直径80 mm,底层为厚度0.3 mm的空白PMMA基片,中间层为厚度3 mm的PMMA通道层,盖板层为厚度0.1 mm的力致黏性膜。如图1所示,每个单元包含：液囊池、样品提取池、酶抑制反应池、显色检测池、废液池、通气孔及连接通道。其中液囊池存放装有农残提取液的液囊,样品提取池用于样品振荡洗脱,酶抑制反应池和显色检测池通过冷冻干燥方法分别固定胆碱酯酶和检测试剂[16]。制备芯片时将芯片结构图输入激光切割机软件,选择合适的激光功率和扫描速度,获得带有各种结构单元PMMA圆形盘片；双面胶黏合空白底板和中间层,力致黏性膜作为盖板层将其密封制得最终芯片。
a-立体结构；b-平面图1-液囊池；2-样品提取池；3-酶抑制反应池；4-检测池；5-废液池和通气孔；6-液囊
图1 芯片结构示意图
Fig.1 Schematic diagram of chip structure
1.3.2 检测流程及原理
称取0.2 g样本碎片放入样品提取池,力致黏性膜封装后将芯片放置在实验室搭建的检测仪中,拇指挤压液囊池上方力致黏性薄膜,外力使液囊发生形变并破碎,完成液体释放；检测仪按设定转速带动芯片旋转,离心力驱动提取液进入样品池与待测样品混合后,芯片顺时针、逆时针周期性往复旋转,以达到振荡提取菜叶表面残留农药的目的；之后芯片顺时针离心驱动提取液依次进入酶抑制反应池和检测池,进行混合、生化和显色反应,最后测量溶液在波长410 nm处吸光度变化值并计算农残抑制率[17-18]。芯片上液体的流动状态如图2所示。
a-存储；b-提取；c-反应；d-检测
图2 液体的流动
Fig.2 Fluid control in the chips
注:箭头所指处为液体位置
1.3.3 实验平台搭建
实验室搭建了台桌面型检测系统,包含控温、离心、光学检测和数据处理模块,该系统可以保持芯片所处的腔室恒温37 ℃,离心转速100～5 000 r/min,检测芯片反应池内液体的吸光度值并计算农残抑制率。
2 结果与分析
2.1 芯片的结构设计
芯片主要由四级串联反应池构成,从圆心开始依次为液囊池、样品提取池、酶抑制反应池、显色检测池。液囊池存放体积1 mL的农残提取液囊；样品提取池容积为3 mL,较大的体积利于固、液样品在其中振荡混合提取；酶抑制反应池、检测池体积均为1 mL。液囊池与提取池通过短粗通道相连,便于液体在外力的作用下快速流入；剩余反应池的连接为细长通道,液体的流动通过离心力驱动完成,其中流体从提取池至酶抑制反应池离心转速为1 500 r/min,从酶抑制反应池至检测池转速为2 000 r/min；废液池200 μL,收集过量的反应液；排气孔保持盘片内部压力与外界大气压一致。
2.2 液体试剂的集成与释放
以厚度0.02 mm的PE膜为液囊材料,首先热压制成一端开口的PE塑料袋,精密注入1 mL的磷酸缓冲液,热压密封制成液囊,放入微流控芯片液囊池中。如图3所示,使用时拇指挤压液囊池上方力致黏性薄膜,外力使液囊发生形变并破碎,完成液体释放,撤去外力后力致黏性薄膜迅速恢复原形貌,该薄膜在液体释放时保证提取池的密封性,避免可能的外界接触污染。PE液囊长期存储实验(25 ℃,60 d)显示它的质量变化小于1%。结果表明采用本工作方法可实现液体试剂在微流控芯片中的简易、长期封装存储。
a-液体试剂的集成；b-液体试剂的释放
图3 液体试剂的集成与释放
Fig.3 Integrationand release of liquid reagents
2.3 芯片中酶抑制反应动力学考察
常规速测法中酶抑制反应需在37 ℃恒温反应10～15 min。本研究将0.1 mg/L克百威标准液加入芯片中,37 ℃恒温条件下考察芯片中酶抑制反应动力学,结果显示反应时间超过60 s后农残抑制率不再变化,因此取1 min作为芯片中酶抑制反应时间。
2.4 农药标样检测及检出限
配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1 mg/L的克百威标准液,按1.3.2方法检测,结果见图4。Origin软件拟合抑制率-农药浓度曲线,得出本方法对克百威农药的检出限为0.01 mg/L,低于GB/T 5009.199—2003 蔬菜中有机磷与氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测要求的检出限0.05 mg/L。
图4 微流控芯片中克百威农药标样检测结果
Fig.4 Analytical results of carbofuran in the chip
2.5 芯片中样品提取时间的确定
针对微反应体系,将喷洒农药的小白菜样品0.2 g 放入样品提取池,考察农残抑制率随样品提取时间的变化趋势。如图5所示,抑制率随提取时间的延长而增大,2 min后达到69%并保持稳定,本研究采用2 min作为芯片中样品提取时间,与常规速测方法的提取时间保持一致。
图5 芯片中农残抑制率随样品提取时间的变化
Fig.5 Effect of samples extraction in chip on inhibition rate of pesticide residues
2.6 加标回收率测定
表1列出了加标回收结果,回收率在95.0%～101.2%,相对标准偏差在2.1%～4.9%,表明该方法的准确度和重复性较好。
表1 加标检测结果
Table 1 Recoveries from spiked sample
加入量/(mL·L-1)检测值/(mL·L-1)回收率/%相对标准偏差/%0.020.01995.04.90.040.03997.52.10.080.081101.23.70.10.09898.04.0
2.7 方法对比
本研究提出的全集成离心式微流控农残检测芯片,相较传统速测方法,首次将样品前处理单元集成在芯片上,省去常规方法中的农残提取仪,简化了人工操作步骤,提高检测效率,在芯片上实现从样品提取至检测的自动化操作,检测结果的准确性满足大批量样品筛查需求。
3 结论与讨论
基于微流控技术和酶抑制法的原理,本工作研制了一种全集成离心式圆盘微流控农残检测芯片,将液体生化试剂集成于离心式农残速测芯片中,以氨基甲酸酯类农药克百威为对象,其检出限达到0.01 mg/L,符合现有国标速测仪检出限标准。该检测方法的优势在于：(1)芯片集成前处理单元,提高了检测效率；(2)无需样品前处理设备,降低了检测系统成本；(3)采用PE膜加工微型液囊,成本极低,适于大批量生产；(4)在微流控芯片中实现了从样品提取到检测的全自动流程,同时检测结果准确性满足国标需求。
[1] DUFFY D C,GILLIS H L,LIN J,et al.Microfabricated centrifugal microfluidic systems:Characterization and multiple enzymatic assays[J].Analytical Chemistry,1999,71(20):4 669-4 678.
[2] LAI S Y,WANG S N,LUO J,et al.Design of a compact disk-like microfluidic platform for enzyme-linked immunosorbent assay[J].Analytical Chemistry,2004,76(7):1 832-1 837.
[3] KIDO H,MICIC M,SMITH D,et al.A novel,compact disk-like centrifugal microfluidics system for cell lysis and sample homogenization[J].Colloids and Surfaces B:Biointerfaces,2007,58(1):44-51.
[4] MADOU M J,LEE L J,DAUNERT S,et al.Design and fabrication of CD-like microfluidic platforms for diagnostics:Microfluidic functions[J].Biomedical Microdevices,2001,3(3):245-254.
[5] HUANG Y,MATHER E L,BELL J L,et al.MEMS-based sample preparation for molecular diagnostics[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2002,372(1):49-65.
[6] XU J.Microfluidics “lab-on-a-chip” system for food chemical hazard detection//Food Chemical Hazard Detection[M].Chichester:John Wiley & Sons,Ltd,2014:263-289.
[7] WHITESIDES G M.The origins and the future of microfluidics[J].Nature,2006,442(7101):368-373.
[8] SACKMANN E K,FULTON A L,BEEBE D J.The present and future role of microfluidics in biomedical research[J].Nature,2014,507(7 491):181-189.
[9] HOFFMANN J,MARK D,LUTZ S,et al.Pre-storage of liquid reagents in glass ampoules for DNA extraction on a fully integrated lab-on-a-chip cartridge[J].Lab on a Chip,2010,10(11):1 480-1 484.
[10] VAN OORDT T,BARB Y,SMETANA J,et al.Miniature stick-packaging-an industrial technology for pre-storage and release of reagents in lab-on-a-chip systems[J].Lab on a Chip,2013,13(15):2 888-2 892.
[11] 吕建华, 安红周,郭天松.农药残留对我国食品安全的影响及相应对策[J].食品科技,2006,31(11):16-20.
LV J H,AN H Z,GUO T S.Effects of pesticide residues on food safety and corresponding countermeasures in China[J].Food Science and Technology,2006,31(11):16-20.
[12] 伍小红, 李建科,惠伟.农药残留对食品安全的影响及对策[J].食品与发酵工业,2005,31(6):80-84.
WU X H,LI J K,HUI W.The effect of pesticide residues on food safety and resolve strategies[J].Food and Fermentation Industries,2005,31(6):80-84.
[13] 王亮, 潘琇,徐婉莉,等.食品农药残留快速检测技术研究进展[J].食品科技,2005,30(10):74-77.
WANG L,PAN X,XU W L,et al.Development of rapid detection research for pesticide remains in food[J].Food Science and Technology,2005,30(10):74-77.
[14] 王多加, 胡祥娜,周向阳,等.蔬菜农药残留快速检测技术胆碱酯酶速测卡法[J].食品科学,2003,24(6):109-113.
WANG D J,HU X N,ZHOU X Y,et al.A rapid testing method of pesticides residue in vegetables—the method of cholinesterase fast testing card[J].Food Science,2003,24(6):109-113.
[15] 叶嘉明, 邵佳美,杨平,等.用于农残快速检测的离心式微流控芯片研制[J].食品科学,2017,38(12):292-297.
YE J M,SHAO J M,YANG P,et al.Fabrication and application of centrifugal microfludic chip for rapid detection of pesticide residues[J].Food Science,2017,38(12):292-297.
[16] 苑宝龙, 王晓东,杨平,等.用于农药残留现场快速检测的微流控芯片研制[J].食品科学,2016,37(2):198-203.
YUAN B L,WANG X D,YANG P,et al.Fabrication and analytical application of microfludic chip for rapid on-site detection of pesticide residues[J].Food Science,2016,37(2):198-203.
[17] 魏福祥, 王振川,王金梅.乙酰胆碱酯酶生物传感器法测定蔬菜水果中有机磷农药残留[J].食品科学,2007,28(2):229-231.
WEI F X,WANG Z C,WANG J M.Determination of organophosphorus pesticide residues by an acetylcholinesterase biosensor in vegetables and fruits[J].Food Science,2007,28(2):229-231.
[18] 杜美红, 孙永军,汪雨,等.酶抑制-比色法在农药残留快速检测中的研究进展[J].食品科学,2010,31(17):462-466.
DU M H,SUN Y J,WANG Y,et al.Advances in the application of enzyme inhibition/colorimetric assay to the rapid detection of pesticide residues[J].Food Science,2010,31(17):462-466.