白酒又名烧酒,以曲类、酵母等为糖化发酵剂,利用粮谷类经过蒸煮、糖化发酵、蒸馏、贮存、勾调而成。2019 年,白酒销售量达1 714.7万kL[1]。白酒中2%的微量成分形成了风格迥异的酱、浓、清等12种香型。因此,对于不同香型、产区、企业生产白酒的关键风味物质及其生成途径研究成为大家关注的热点。
截至2017 年,研究人员已在白酒中成功检测出挥发性化合物1 874 种[2],这些微量成分种类繁多,含量分布范围广。白酒中的高含量化合物通常对白酒特征香气贡献突出,如酯、醇、酸类等。酒体中的酯类物质是香气的主体成分,对酒体的果香或花香起决定性作用；醇类如乙醇、丙醇、丁醇在白酒中含量很高,是白酒醇香的来源；酸类物质在酒体中表现为酸味,适量的有机酸能够掩盖白酒中的苦涩味,改善白酒风味[3]。某些低含量化合物同样会对酒体香气有贡献,如含硫、含氮以及呋喃类化合物等,它们虽然在白酒中的含量并不高,但阈值低,香气活力值高,对白酒的整体风味同样有着重要的贡献。2017 年,NIU等[4]应用液液萃取法结合气相色谱火焰光度检测器(gas chromatography-flame photometric detector,GC-FPD)对清香型白酒进行分析,结果表明虽然二甲基三硫醚和3-巯基己基乙酸酯含量低,但是香气活性值高,对清香型白酒有重要贡献。在后续研究中,有研究者发现,在老化过程中,随着白酒中微量成分的改变,白酒风格会发生显著的变化,同样证明了2%的微量组分对酒体香气的突出贡献[5]。
为了保证对上述微量成分的准确检出,自20世纪60 年代起,分析方法稳步发展。分析方法由操作简单、检出限高发展为专一性好、省时、环保。目前虽已有部分文献对白酒中风味物质的分析方法进行总结,但只是概述了常见的前处理方法。本文对近年来应用于白酒领域的前处理方法进行梳理,详细归纳出各自的特点及应用情况；此外,介绍了新的前处理方法的发展趋势,以期为进一步提升白酒品质提出建议。
1 白酒分析中常见的前处理方法
1.1 直接进样法
直接进样法是一种将不经过处理的微量酒样直接注入进样器的方法,适合对白酒中的高含量化合物,如酸、醇、酯类等骨架成分定性及定量分析[6-8]。该方法操作简单且可保留酒样中的所有成分,具有真实性高、重现性好等优势,但不适合于含量相对较低的微量组分分析。由于酒样未经除水处理,在仪器分析时酒样中的水会在进样口处受热气化膨胀,同时与待测物竞争色谱柱上的烷氧基,形成活性位点,进而缩短色谱柱的使用寿命。
直接进样法常与气相色谱火焰离子化检测器(gas chromatography-flame ionization detector,GC-FID)联用对白酒中的高含量骨架成分进行分析[8-9]。为了扩大直接进样法的检测范围,研究人员将直接进样法与更高精密度的气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、超高效液相色谱-串联质谱(ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)联用对白酒中的风味物质进行分析。已有文献表明,直接进样法与GC-MS联用适合对白酒中相对含量较低的醇类、酯类、酸类和部分烷烃、醛类、酮类分析[10]。2020年,YAN等[11]应用直接进样法结合UPLC-MS/MS实现了对27 种酱香、浓香、清香型白酒中的吡嗪类化合物的分析,检出限低至6.0×10-7 g/L。直接进样法与不同仪器联用的检测结果见表1。
表1 应用直接进样法测定白酒中风味物质的种类、检出限、定量限及回收率
Table 1 Types,detection limits,quantitative limits and recoveries of aroma compounds in Baijiu using the direct injection method
酒样种类检测仪器检出限/(g·L-1)定量限/(g·L-1)回收率/%分析物老五甑酒GC-O-MS、GC-FID///1-丙醇、异丁醇、丁醇等醇类,乙酸丙酯、苯甲基乙酯、醋酸苯乙酯等酯类[5]72 种白酒GC-MS2.5×10-55.0×10-5/乙酸丙酯[6]米香,浓香,清香型白酒FID1.0×10-3～2.5×10-2/82.2～103.8乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯和甲醇、正丙醇、β-苯乙醇[8]扳倒井芝麻香型白酒GC-O-MS1.0×10-8～2.5×10-71.0×10-7～2.5×10-6/二甲基二硫醚、二甲基三硫醚等含硫化合物[7]各种香型白酒共38 种GC-FID<1.0×10-3<1.0×10-378.2～102.6醇、醛、酮、酯类共62 种气味活性物质[9]酱香浓香清香型酒共27 种UPLC-MS/MS6.0×10-7～1.2×10-61.8×10-6～4.1×10-683.2～102.65 种吡嗪类化合物[11]
1.2 液萃取法
1.2.1 液液萃取法(liquid-liquid extraction,LLE)
液液萃取法是一种利用待测物与基质在溶剂中溶解度不同去除基质而保留待测组分的前处理方法。与直接进样法相比,LLE克服了直接进样法缩短色谱柱使用寿命的不足,具有易于操作、检出种类多、回收率高的优点,是目前最常用的样品前处理方法之一。但是,该方法仍存在样品用量过大、耗时长的缺点,并且低沸点化合物在浓缩过程中易损失。
2006 年,FAN等[12]首次应用调pH液液萃取法结合气相色谱-嗅闻(gas chromatography-olfactometry,GC-O)和GC-MS对五粮液和剑南春酒样中的挥发性香气化合物进行分析,鉴定出5 种吡嗪类化合物。2007 年,进一步应用LLE-GC-MS对茅台酒中的吡嗪类化合物进行检测,共鉴定出27 种吡嗪类化合物[13]。随着液液萃取法的发展,诸多研究人员发现萃取溶剂的种类影响萃取结果。通过对萃取溶剂的类型进行优化,可实现待测酒样中不同极性化合物的高效检出。目前萃取剂种类多样,其中二氯甲烷因具有广谱的溶解能力,以及相对较低的毒性和反应惰性,成为常用萃取剂[14]。而为了对白酒中的强极性化合物进行分析,2017 年,NIU等[4]应用LLE结合GC-O和GC-FPD对5 种清香型白酒进行分析,萃取溶剂采用极性强的2-辛醇,结果成功提取出80 种香气化合物。在实际检测中,由于白酒微量成分的复杂性,很难仅使用一种萃取剂同时萃取多种待测物,通过应用多种萃取剂进行酒样的多次萃取能有效提高待测化合物的萃取效率[15]。
1.2.2 液液微萃取法(liquid-liquid microextraction,LLME)
LLME是一种微型化的液液萃取法,样品在分散剂的作用下迅速从水相转移至萃取剂。与传统液液萃取法相比,LLME在加快萃取平衡速率、提高萃取效率的同时,减少了因萃取时间过长而导致低沸点化合物的损失。
LLME常用于对白酒中的脂肪酸类化合物分析[16-17]。2015 年,FAN等应用LLME-GC-MS,建立了白酒中脂肪酸类物质的快速检测方法。结果表明,白酒中脂肪酸类化合物的回收率可达85%以上,检出限在1.9×10-4～2.9×10-3 g/L[16]。2020 年,WANG等对该方法进行改进,同样应用LLME-GC-MS对茅台酒中的酚类、脂肪酸类化合物进行分析,成功定量出8 种化合物,检出限在7.0×10-10～8.7×10-4 g/L,定量限为2.3×10-9～1.7×10-3 g/L[17]。
为了提高LLME的萃取效率,研究人员一直在进行改进。2014 年,LIAN等[18]采用表面活性剂/涡旋辅助液液微萃取(vortex-assisted liquid-liquid microextraction,VSLLME)处理酒样,以己酸作为萃取剂,成功分离并检测出5 种邻苯二甲酸酯(phthalic acid esters,PAEs)。2018 年,DONG等[19]应用VSLLME-GC-MS首次实现对浓香型白酒中3-甲基吲哚的鉴定。液液萃取法测定白酒中风味物质的应用如表2所示。
表2 应用液液萃取法测定白酒中风味物质的种类、检出限及回收率
Table 2 Types,detection limits and recoveries of aroma compounds in Baijiu using the liquid-liquid extraction method
酒样前处理方式酒样种类检测仪器萃取液检出限/(g·L-1)回收率/%待测组分液液萃取法10 种白酒GC-MS乙醚<2.0×10-783.2～119.127 种吡嗪类化合物[13]酱香型白酒HPLC二氯甲烷2.5×10-6～5.1×10-583.8～101.6苯酚、愈创木酚、对-甲酚、间-甲酚、邻-甲酚、4-甲基愈创木酚、4-乙烯基苯酚、4-乙基苯酚、4-乙烯基愈创木酚、4-乙基愈创木酚[14]5 种清香型白酒GC-FPD、GC-O、GC-MS2-辛醇//二甲基三硫醚和3-巯基乙酸酯[4]牛栏山清香型白酒GC-MS正己烷、乙醚、戊烷∶乙醚(1∶1,体积比)//乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯等酯类,己酮、壬酮、癸醛等醛酮类,正己醇、异戊醇等醇类[15]五粮液,剑南春GC-MS、GC-O三氯一氟甲烷//2,5-二甲基-3-乙基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、3,5-二甲基-2-戊基吡嗪[12]景芝芝麻香型白酒GC-MS/O、GC-FID二氯甲烷1.5×10-4～2.6×10-384.0～93.0乙酸、异戊酸、丙酸、苯甲酸、庚酸、苯乙酸、辛酸、己酸、丁酸、苯丙酸[21]国井芝麻香型白酒GC×GC-TOF-MS二氯甲烷3.0×10-7～4.0×10-3/丁酸乙酯、异戊醇、己酸、3-苯丙酸乙酯、苯乙醇、香兰素、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯、己酸乙酯、3-甲硫基丙醛和二甲基三硫醚[22]液液微萃取豉香型白酒GC-MS、GC-O乙醚1.9×10-4～2.9×10-380.0～92.0乙酸、庚酸、丙酸、丁酸、己酸、辛酸、异丁酸、3-甲级丁酸[16]酱香型白酒GC-MS乙醚1.0×10-5～2.0×10-380.0～120.0酯类、醇类、酸类、糠醛、2-庚酮[20]表面活性剂/涡旋辅助液液微萃取浓香型白酒GC-MS四氯甲烷5.6×10-8～5.7×10-887.9～116.6油酸乙酯、3-甲基吲哚[19]茅台酒GC-MS二氯甲烷7.0×10-10～8.7×10-4/戊酸、丁酸、异戊酸、正己酸、异己酸、葫芦巴内酯、对甲酚、辛酸[17]未知白酒HPLC己酸1.1×10-6～2.3×10-689.0～93.0邻苯二甲酸酯类[18]
1.3 固相萃取法(solid-phase extraction,SPE)
SPE是一种利用白酒中风味物质在固定相与流动相分配平衡不同而分离的前处理方法。相比液液萃取法,SPE具有萃取液用量少,重复性好的优点。已有文献报道应用该方法实现了对酒中挥发性酚类、内酯类和酚酸类物质的检测[23]。然而,该方法成本高,过程相对复杂,对固定相材料要求高(固定相材料与待测物的极性相近,否则,萃取效果会因为分析物未在固定相上保留而受影响)。
目前常用的固定相材料为C18,当酒样流过固定相时,待测物与C18碳链因疏水作用而被吸附,然后经洗脱液冲洗分离待测物[24]。随着固相萃取技术的发展,研究人员开发了不同类型的固定相[23,25],其中HLB固定相(改性的苯乙烯二乙烯基苯共聚物)因对极性、非极性化合物均有很好的保留效果,而被广泛应用。
磁性固相萃取过程如图1 所示[26]。磁性吸附剂是该技术的重点,吸附剂主要包括使吸附剂具备磁性的磁源以及用来吸附待测分析物的涂层。目前,该方法已经广泛应用于环境领域,并且开始在白酒领域应用。2020 年,DONG等[27]应用磁性固相萃取结合HPLC-MS/MS实现对浓香型白酒中的吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)和吲哚-3-丙酸(indolyl-3-propionic acid,IPA)的高效、快速检测。为了保证对上述2种吲哚类衍生物的准确检出,该研究者合成了一种新型磁性聚丙烯胺改性氧化石墨烯作为萃取吸附剂。结果表明,该方法对IAA和IPA的萃取效率高,回收率可达71.5%～110.5%。该方法具有样品和试剂消耗低、灵敏度高、精密度好且耗时短的优点。
图1 磁性固相萃取法流程图
Fig.1 The flowchart of the magnetic solid-phase extraction
1.4 固相微萃取法(solid-phase microextraction,SPME)
固相微萃取法是一种在SPE基础上发展的集富集、分离、检测为一体的前处理方法。它利用具有吸附萃取功能的萃取头,在样品与萃取头之间建立萃取平衡从而实现分离、富集的目的。具体萃取过程如图2 所示。SPME具有检出种类多[10],即时现场采样,萃取时间和解吸时间短的优点。但是作为现阶段先进的前处理手段,SPME存在萃取头价格昂贵的缺点。
表3 应用固相萃取法测定白酒中风味物质的种类、检出限及回收率
Table 3 Types,detection limits and recoveries of aroma compounds in Baijiu by using the solid-phase extraction method
酒样种类检测仪器固相萃取柱洗脱液检出限/(g·L-1)回收率/%检测组分古井贡浓香型白酒GC-MSC18甲醇/80.5～106.4土臭素、2-甲基异冰片[24]古井贡浓香型白酒GC-MSC18二氯甲烷/112.9～143.5土臭素、2-甲基异冰片[24]五粮液LC-QTOFHLB甲醇1.0×10-6～5.0×10-688.7～99.710 种酚酸及酚酸酯类化合物[23]清香型,酱香型,浓香型白酒GC-MSBond Elut-ENV二氯甲烷2.0×10-7～4.3×10-6/γ-内酯类[28]葡萄酒HPLCMIPV(甲醇)∶V(乙酸)=9∶12.0×10-7～4.0×10-668.7～96.06 种香豆素[25]浓香型白酒HPLCGO@PAA@Fe3O40.5%酸性丙酮1.6×10-7～2.3×10-771.5～110.5吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丙酸[27]
图2 固相微萃取法的流程图
Fig.2 The flowchart of the solid-phase microextraction
1.4.1 固相微萃取(solid-phase microextraction,HS-SPME)
HS-SPME和浸入式固相微萃取(direct immersion-solid phase microextraction,DI-SPME),其中,顶空固相微萃取在白酒风味分析中被广泛应用。HS-SPME将萃取头置于酒样上空进行吸附,避免了复杂的基质和难挥发化合物对结果的干扰。缺点是白酒中大量的乙醇容易挥发,会影响低沸点气味化合物的检测。
影响SPME萃取效率的因素包括萃取时间、温度、pH以及萃取头的极性,萃取头的极性影响萃取化合物的种类,PDMS萃取头对非极性化合物萃取效果较好[29]。PA萃取头适合萃取极性强的化合物[30]。中极性的DVB/CAR/PDMS萃取头对相对分子质量在40～275的化合物都有很好的吸附效果,已有文献报道应用DVB/CAR/PDMS萃取头实现了对辛酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯等白酒中含量高的香气化合物[31]和挥发性含硫化合物[32]、呋喃类[33]、醛酮类、羰基化合物[16]的提取。
1.4.2 固相微萃取方法的改进
SPME的缺点是萃取量不足。为了提高萃取效率,一种基于SPME的SPME ARROW设备受到人们的注意。相比SPME,SPME ARROW在相对较宽的不锈钢棒上涂有更厚的萃取相涂层,因此它具有更大的表面积,吸附速度更快。箭头设计保护吸附材料,寿命更长。传统SPME使用的涂层SPME ARROW也可使用[34]。在对白酒中的风味物质进行分析时,相比固相萃取法SPME ARROW灵敏度更高,适合对低含量的挥发性香气化合物的分析。固相微萃取法与不同的仪器联用检测结果见表4。
表4 应用固相微萃取法测定白酒中风味物质的种类、检出限、定量限及回收率
Table4 Types,detection limits,quantitative limits and recoveries of aroma compounds in Baijiu by using the solid-phase microextraction method
酒样前处理方式酒样种类检测仪器萃取纤维类型检出限/(g·L-1)定量限/(g·L-1)回收率/%检测组分顶空固相微萃取小米黄酒GC-MSPA///丁二酸二乙酯、十二酸、壬酸、庚酸、四氢糠醇、苯基乙醇、十五烷、1-甲基萘、3-甲硫基丙醇[30]小米黄酒GC-MSPDMS///十二烷、十八烷、十三烷、十四烷、2,4-二叔丁基苯酚[30]老白干GC×GC/TOF-MSDVB/CAR/PDMS/5.0×10-9～5.4×10-685.0～119.0(除十一酸乙酯外)辛酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯等52 种成分[31]茅台酱香型白酒GC-FPDDVB/CAR/PDMS2.0×10-8～2.6×10-51.0×10-7～8.6×10-580.0～120.0甲硫醇、乙硫醇、硫代乙酸甲酯等13 种含硫化合物[32]酱香型白酒GC×GC/TOF-MSDVB/CAR/PDMS1.7×10-8～7.8×10-85.6×10-8～3.0×10-781.9～113.53-苯基噻吩、甲基糠基二硫、2-甲基-5-(甲硫基)呋喃等19 种挥发性含硫化合物[33]SPME ARROW汾酒GC-MSDVB/CAR/PDMS1.0×10-11～1.7×10-57.0×10-11～1.6×10-5/酯类、醇类、脂肪酸等82 种化合物[34]
1.5 其他方法
搅拌棒吸附萃取法(stir bar sorptive extraction,SBSE)是在SPME方法的基础上演化而来的。它是一种将表面具有吸附剂的磁力搅拌棒置于酒样中吸附待测组分,然后进行解吸分离的前处理方法。与SPME相比,SBSE固定相体积大,具有萃取容量大,萃取剂用量少,经济环保的优点。目前,非极性PDMS在SBSE中广泛应用[35]。然而,截止至今,该方法可用的涂层种类少、价格昂贵,因此应用受限。
溶剂辅助风味蒸发(solvent assisted flavor evaporation,SAFE)是一种从复杂的白酒基质中温和地提取挥发组分的方法。由于在萃取过程中,萃取体系温度保持在室温,因此该方法有力地保护了热敏性的组分,能够完整地呈现白酒中自然的香气。2016 年,宫俐莉等分别应用HS-SPME和SAFE结合GC-MS对古井贡酒酒醅中的挥发性化合物进行分析,结果表明SAFE更适合萃取醇类和脂肪酸类[36]。然而,该方法最大的缺点在于对人员操作要求高,并且整套系统价格昂贵,萃取时间过长,限制了其在白酒前处理中的应用。
同时蒸馏萃取法通过将样品和萃取溶剂同时加热至沸,挥发性组分首先被蒸馏出来,然后样品蒸汽和溶剂蒸汽在冷凝器中冷凝完成萃取。该方法具有中高沸点成分萃取回收率较高,萃取液中没有难挥发性成分,不会污染色谱柱的优点。但由于长时间沸腾蒸馏,样品原有组分可能会发生变化,产生新的化合物。同时蒸馏萃取法是否适合对白酒的分析检测还有待考究[37-38]。
此外,超临界二氧化碳萃取法、吹扫捕集法、分子蒸馏法在白酒风味分析中也有一定的应用。XU等[39]应用超临界二氧化碳萃取法实现酒糟中酯类和酸类化合物的高效、准确检出。胡国栋等[40]应用吹扫捕集法结合GC-MS从白酒中定性了74 种化合物。江思瑶等应用分子蒸馏结合HPLC实现了对白酒中乳酸的提取分析[41]。
2 前处理新技术
现有的白酒前处理方法仍存在众多的局限性,人们迫切需要开发一种快速、准确、成本低,满足企业日常检测需要的萃取技术。目前前处理新技术的开发主要集中在对现有前处理方法如固相微萃取、固相萃取和液液萃取法进行改进。
磁性固相微萃取是在SPME的基础上将磁性纳米粒子与SPME装置结合的新型萃取方法。与SPME相比,磁性纳米粒子没有固定在固相微萃取装置的针尖上,而是在萃取过程中分散在溶液体系中,充分吸附待测物,最后利用SPME装置在针尖富集磁性材料和待测物,这种萃取形式提高了萃取的效率。2018 年,YU等应用磁性固相微萃取结合表面增强拉曼散射(surface enhanced raman scattering,SERS)实现了对保健酒中枸橼酸西地那非快速、高效的检测,为了提高检测的准确性,该研究者成功制备了Fe3O4@SiO2@Ag@NH2纳米粒子作为吸附剂,萃取过程如图3 所示。该方法检出限可达1.0×10-8 mol/L,整个过程仅需10 min。具有萃取效率高,检测时间短的优势[42]。
图3 磁性固相微萃取法的流程图
Fig.3 The flowchart of the magnetic solid-phase microextraction
2019 年,DIAZ在液液萃取的基础上,探索了一种以乙酸乙酯作为萃取剂的盐析液液萃取法,可在微量水平上测定龙舌兰酒中的酚类,醛类和内酯类。该方法回收率在92.1%～116.0%,检出限在1.8×10-6～1.4×10-5 g/L。相比固相萃取法该方法具有回收率高,分离萃取效率高的优势[43]。
2020 年,MARTINA等[44]应用固相萃取对红葡萄酒中的白藜芦醇进行分析,采用聚偏二氟乙烯纳米纤维对聚己内酯进行修饰,合成一种新型nPVDF/μPCL(poly(vinylidene difluoride)nanofibers on polycaprolactone microfibrous scaffold)固定相。在具体实验中,50.0 μL葡萄酒样品经0.22 μm聚四氟乙烯过滤器过滤后直接注入SPE系统,分别应用C18 和nPVDF/μPCL为固定相,以乙腈为流动相进行萃取。相比其他传统材料,白藜芦醇在nPVDF/μPCL上的保留率较高,且有较好的峰型。虽然nPVDF/μPCL提取效率与商用C18吸附剂相似,但样品净化潜力更好,相同的萃取效果所需要的洗脱液更少。
3 总结与展望
根据白酒中待测物的性质与含量选择适合的前处理方法可提高成分分析的效率及准确度。现阶段,虽然在白酒风味研究领域有众多的前处理方法可供研究人员选择,但是LLE、SPE、SPME等已经成熟的前处理方法依然存在问题,其他如SBSE、SAFE、SDE等方法,由于存在价格昂贵、操作复杂、分析成分单一等缺点,以致短期内难以取代常用的前处理方法。因此,在白酒风味分析领域,前处理方法仍有很大的发展空间。
白酒风味研究领域前处理方法的发展包括两个发展方向。一方面,开发新的白酒风味分析前处理方法或将其他领域前处理方法引入到白酒风味分析领域中。白酒前处理方法从最早的直接进样法过渡到液液萃取法到后来的固相萃取法、固相微萃取法、搅拌棒吸附萃取法等,前处理方法的发展使得白酒成分分析变得多样化、全面化、精确化。未来改进并推广在白酒风味分析领域应用相对较少的SAFE、超临界二氧化碳萃取、分子蒸馏等方法或可成为发展方向之一,例如降低SAFE和超临界萃取设备的生产成本和操作难度,或利用夹带剂增加超临界二氧化碳萃取法萃取风味物质的种类。另一方面,在现有白酒风味分析的基础上,利用现代技术对已经成熟应用的前处理方法进行改进,在保留原有优势的基础上,改善这些方法的不足。例如本文提到的磁性固相萃取、分子印迹固相萃取、磁性固相微萃取等方法,是将新技术应用于成熟的前处理方法中。相比原方法,改进后的方法具有萃取效率高,萃取难度低等优点。改善白酒风味物质前处理方法对白酒风味化学研究的完善有其必要性和重要意义。
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