啤酒以麦芽为主要原料,辅以酒花,接种啤酒酵母发酵而成,是世界上最古老的酒精饮料[1]。因其营养价值高、口感丰富,广受各国人民喜爱。自2003年起,中国成为世界上最大的啤酒生产国和消费国[2]。但国产啤酒大麦存在蛋白质和葡聚糖含量偏高,酶系活力较低等缺陷,其质量和数量都无法满足本国啤酒工业生产的需求,我国年需求啤酒大麦一半以上依赖进口,严重影响了我国啤酒企业的经济效益[3]。
大麦芽是酿造啤酒的主要原料。大麦经过润湿,细胞代谢加快,一些水解酶被激活或合成,有利于后续淀粉、蛋白等大分子物质的降解和利用[4]。但大麦发芽工序耗时耗能,且伴随着严重的水污染。不少研究者尝试直接用大麦作为原料辅以适当的外源酶制剂进行啤酒酿造。王秀丽等[5]研究了2种不同的复合酶制剂对100%大麦啤酒麦汁质量的影响,结果表明未经发芽的大麦在添加酶制剂糖化后也能得到合格的麦汁。朱明光等[6]选择诺维信公司麦诺得复合酶酿造出风味和营养都令人满意的大麦啤酒饮料。全大麦啤酒酿造避开了制麦过程中的水热消耗,消除了与麦芽生产相关的碳足迹,减少二氧化碳的排放,符合绿色生产理念[7],且由制麦导致的水分消耗和去除幼根的质量损失也不复存在,大大降低了企业的生产成本[8]。通过添加外源酶制剂辅助糖化,可弥补大麦酶系活力不足、原料浸出率低等缺陷。但由于缺乏麦壳形成疏松的过滤层,麦汁过滤环节会发生一定程度的阻塞,且相比麦芽啤酒,大麦啤酒的口感较为单薄,颜色、亮度、醇和酯的含量偏低[9]。针对这些不足,不少研究提出相应改善措施,譬如改变麦汁过滤方式以削弱阻塞、加入游离氨基氮调整啤酒的色泽与风味等[9-10]。总体而言,全大麦啤酒酿造仍是一种极具前景的绿色酿造方式,解决了啤酒大麦的品质制约问题,使啤酒生产更具可持续性[11]。
制麦处理会促使大麦中的淀粉、蛋白等生物大分子发生一定程度的降解,加速糖化过程[7]。而生大麦粉的细胞结构较为致密,在糖化前需做糊化处理才能更好的与糖化酶制剂作用。因此,采取一种行之有效的预糊化方式可有效提升全大麦啤酒的糖化效率、降低能源消耗、提高原料利用率。
加酶挤压作为一种绿色、污染小的连续化生产技术,在熟化淀粉基材料方面有着得天独厚的优势,物料在挤压腔内受到的高温剪切作用能够实现高料水比下酶与底物的良好作用。目前,加酶挤压技术在糊化谷物方面的应用早有报道。如啤酒辅料的熟化[12],高粱小曲酒[13]、黄酒[14]等发酵食品的生产。但尚未见加酶挤压大麦粉直接进行啤酒酿造的研究,加酶挤压后的大麦粉产品的属性也少见报道。
本文系统研究了加酶挤压大麦粉的理化性质,主要是加酶挤出物的水合特性、热性质以及在挤压腔内的降解和酶蚀情况,对比了2种常规的热处理方式(蒸汽蒸煮和高压蒸煮)对大麦粉改性的差异。期望为全大麦啤酒酿造提供一种新思路,促进国产啤酒大麦的进一步利用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大麦,江苏无锡春播秋收电子商务有限公司；啤酒复合酶,和氏壁生物技术有限公司；耐高温α-淀粉酶,上海麦克林生化科技有限公司；中性蛋白酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、β-葡聚糖酶、糖化酶,宁夏夏盛实业集团有限公司；柠檬酸、柠檬酸钠、NaOH、盐酸均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
FMHE36-24双螺杆挤压机,湖南富马科食品工程技术有限公司；L65高压灭菌锅,德国爱安姆科技有限公司；RQH-150智能人工气候培养箱,郑州生元仪器有限公司；5804R高速冷冻离心机,德国艾本德公司；25 mL密度瓶,上海申迪玻璃仪器有限公司；Waters 1525EF高效液相色谱,美国沃特世公司；恒温水浴锅,上海百典仪器设备有限公司；X-DSC7000差示扫描量热仪,日本精工电子纳米科技有限公司；RVA 4500快速黏度分析仪,澳大利亚波通公司；SU8100冷场发射扫描电子显微镜,日本株式会社日立高新技术；HNY恒温培养振荡器,天津市欧诺仪器仪表有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 预处理操作
大麦研磨后过80目筛,此为原大麦粉(raw barley,RAW),添加质量分数0.1%的耐高温α-淀粉酶,混合均匀置于4 ℃冰箱中平衡一夜。设置挤压温度为90 ℃,进料速度6.5 kg/h,螺杆转速150 r/min,水分含量45%,挤出物冷冻干燥即得加酶挤压样品(enzymatic extrusion sample,EES)。蒸汽蒸煮样品(steam cooking sample,SCS)：添加去离子水调节大麦粉的水分含量为45%,蒸汽蒸煮6 min后冷冻干燥。高压蒸煮样品(high-pressure cooking sample,HPS)：同样调节大麦粉水分含量至45%,设置灭菌时间3 min,温度为120 ℃,压力0.2 MPa,在灭菌锅温度为85 ℃时放入样品,程序结束后,在灭菌锅温度为85 ℃时取出样品,冷冻干燥。所有干燥样品均研磨至0.075 mm,于4 ℃冰箱中密封保存。
淀粉提取参照李静鹏[15]的方法,得到大麦淀粉(raw barley starch,RAWS)、加酶挤压淀粉样品(enzymatic extrusion starch sample,EESS)、蒸汽蒸煮淀粉样品(steam cooking starch sample,SCSS)、高压蒸煮淀粉样品(high-pressure cooking starch sample,HPSS),冷冻干燥后研磨至0.075 mm,于4 ℃冰箱中密封保存。
1.3.2 微糖化与发酵操作
微糖化：分别称取100 g左右的3种热改性大麦粉样品于1 L玻璃烧杯中,按料水比1∶3.5(g∶mL)加入45 ℃,pH 6.5的去离子水,200 r/min搅拌3 min使大麦粉均匀成糊。加入1%的中性蛋白酶45 ℃水浴反应15 min,随后升温至52 ℃,添加0.5 mol/L的柠檬酸溶液调节pH至5.0～5.5,加入0.25%的α-淀粉酶,0.05%的啤酒复合酶制剂,0.02%的β-葡聚糖酶反应1 h,反应20 min后加入0.05%的β-淀粉酶继续反应至结束；再次升温到62 ℃,添加0.5 mol/L的柠檬酸溶液调节pH至4.0～4.5,加入0.075%的糖化酶反应30 min；最后调节水温至78 ℃,碘检不变色则糖化结束。所有酶制剂添加量均按大麦干重计算,反应间隔15 min或每次加酶后打开搅拌机搅拌0.5 min。
麦汁过滤后添加酒花煮沸1 h。趁热过滤,迅速冷却除去部分冷凝物,加入啤酒酵母进行发酵,其中培养箱温度设置为16 ℃,通过监测双乙酰含量确定发酵温度,双乙酰含量降至0.1 mg/L时放入4 ℃冰箱贮存1 d,1 ℃保存留待检测分析。
1.3.3 吸水性指数和水溶性指数测定
吸水性指数(water absorption index,WAI)和水溶性指数(water solubility index,WSI)的测定参考XU等[16]的方法,并稍作修改。称取1 g左右的样品与12 mL,pH 3.5的柠檬酸缓冲溶液混合于50 mL离心管中以灭活耐高温α-淀粉酶。离心管置于30 ℃的水浴锅中反应30 min,7 500 r/min离心10 min。将上清液转移至质量恒定的铝盒,105 ℃下干燥4 h至质量恒定，记录离心管及底部沉淀总质量，同时将12 mL柠檬酸缓冲溶液干燥至质量恒定,WSI和WAI分别按公式(1)、(2)计算：
(1)
(2)
式中:m,样品质量,g;m1,铝盒质量,g;mt,105 ℃下干燥4 h后质量,g；mr,离心管及底部沉淀总质量,g；m2,50 mL离心管质量,g；mb,12 mL柠檬酸缓冲溶液干燥后质量,g。
1.3.4 堆积密度测定
堆积密度(bulk density,BD)可在一定程度反映物料的膨胀程度。参考XU等[16]的方法,称取约10 g样品放入50 mL量筒中,缓慢而均匀的加入二甲基硅油至50 mL刻度处,然后将二甲基硅油转移到另一个量筒中,记录体积,BD按公式(3)计算：
(3)
式中：ρBD,堆积密度,g/mL;m,样品质量,g;V,样品处理后体积,mL。
1.3.5 糊化度测定
采用酶法测定糊化度(gelatinization degree,GE),准确称取2份1 g左右的样品与50 mL去离子水于250 mL锥形瓶中混合均匀,将其中1份置于沸水中水浴20 min使其完全糊化,迅速冷却至室温,此为糊化组。另1组不做糊化处理为对照组。向2组锥形瓶中各添加5 mL 30 mg/mL的TaKa淀粉酶,于恒温培养振荡器中气浴振荡(37 ℃,100 r/min)2 h后加入2 mL 1 mol/L HCl溶液灭酶,再加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液中和。过滤得到的上清液测定其还原糖含量,GE可表示为对照组与糊化组的还原糖含量的比值,按公式(4)计算：
(4)
式中：ρg、ρc,糊化组、对照组的还原糖含量,mg/mL；mg、mc,糊化组、对照组的样品质量,g。
1.3.6 糊化焓测定
使用差示扫描量热仪(differential scanning calorimeter,DSC)测定样品的糊化焓(ΔH)[17],称取约2 mg样品于铝制坩埚中,加入2倍体积的去离子水,于4 ℃冰箱中平衡12 h,测试过程样品以10 ℃/min 的加热速率从20 ℃升到90 ℃,再以相同速率冷却至20 ℃。使用Muse Jobs软件计算糊化焓(ΔH)。
1.3.7 糊化特性测定
参照文献[18],使用快速黏度仪(rapid visco analyzer,RVA)测定样品的糊化特性。
1.3.8 扫描电镜
用干净的玻璃棒蘸取适量粉末样品置于导电胶上,用洗耳球吹扫未黏附的样品,将导电胶贴在样品台上,于真空条件下离子溅射喷金,在扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)下观察淀粉的颗粒形态,其中,加速电压3 kV,放大倍数为1 500倍。
1.3.9 分子质量分布
使用高效液相色谱测定不同热处理后大麦粉中淀粉分子质量分布。将提取出的淀粉溶于去离子水中,配制成10 mg/mL的溶液,于沸水浴中煮沸2 h使淀粉完全分散。使用Ultrahydrogel Linear色谱柱(7.8 mm×300 mm),流动相为 0.1 mol/L NaNO3溶液,流速 0.8 mL/min,柱温 40 ℃。所有样品均用0.45 μm的一次性针头滤器(水系)过滤。
1.3.10 麦汁中碳、氮源物质分析
麦汁中α-氨基氮含量的测定参照文献[19]。通过高效液相色谱分析麦汁中可发酵糖(以葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖总量为指标)的含量。使用Sugar-Pak1色谱柱(6.5 mm×300 mm),流速 0.4 mL/min,流动相为纯水；柱温 85 ℃。所有样品均用0.45 μm一次性针头滤器(水系)过滤。
1.3.11 成品啤酒酒精度测定
酒精度的测定参照文献[20]中的密度瓶法,利用20 ℃时酒精水溶液与同体积纯水的比重得到成品啤酒的酒精体积分数。
1.4 数据分析
数据采用平均值±标准偏差表示,采用 SPSS 16.0 软件进行统计分析,采用 Origin 8.6进行绘图处理。
2 结果与分析
2.1 不同热处理大麦粉的水合特性
表1汇总了不同热处理大麦粉的WAI、WSI、BD、GE和ΔH的值,由表1可知,热处理后大麦粉的WAI值普遍上升,说明热处理过程中淀粉颗粒被破坏,暴露更多的亲水基团,结合水的能力提升[21]。
表1 不同热处理大麦粉的WAI、WSI、BD、GE和ΔH的结果
Table 1 WAI,WSI,BD,GE and ΔH results of barley flour under different heat treatments
注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05),“-”表示数据未检出(下同)
样品水合特性WAI/%WSI/%BD/(g·mL-1)糊化特性GE/%ΔH/(J·g-1)RAW93.57±3.64d2.98±0.54c0.971±0.052bc21.66±3.18d5.18±0.41aEES125.38±1.61c57.10±3.45a1.301±0.051a97.33±2.01a-SCS252.00±2.83b2.69±0.89cd1.040±0.087b70.59±2.88c1.49±0.24bHPS298.43±4.77a8.72±1.03b0.956±0.027bc84.66±1.52b0.27±0.13c
WSI可作为原料分子损伤的指标,反映淀粉颗粒的水解情况,对发酵至关重要[22]。EES具有最大的WSI值(57.10%),表明淀粉经加酶挤压处理后降解程度最高,大量低聚糖和糊精溶出,水溶性增强。SCS的WSI小于原大麦粉,可能是由于缓冲溶液的质量损失。
BD可反映样品的膨胀或致密化程度,除了EES,SCS和HPS的堆积密度与RAW相比无显著性差异(P<0.05),EES获得最大的堆积密度,说明其降解效果最好。
2.2 不同热处理大麦粉的糊化特性
由表1可知,热处理后大麦粉的糊化度显著提升,其中EES的GE值达到97.33%,几乎完全糊化,3种热处理对糊化度的影响存在显著性差异(P<0.05),其大小排序为EES>HPS>SCS>RAW。
DSC是用来进行淀粉糊化、老化分析的常见技术手段,从DSC谱图中可得到糊化温度和糊化焓等参数。由图1可知,经热处理后,大麦粉的吸热峰面积减小,起始糊化温度前移。EES曲线无起伏,说明样品在热反应过程中没有发生热量变化,即加酶挤出物完全糊化。由表1可知,EES的糊化焓未检出,糊化焓大小排序为RAW>SCS >HPS>EES,即糊化程度为EES>HPS>SCS>RAW,与上述GE的结果趋势一致。
图1 不同热处理的大麦粉DSC热力学参数
Fig.1 DSC thermodynamic parameters of barley flour under different heat treatments
淀粉的糊化过程即淀粉在热水中发生不可逆的溶胀,结晶区被破坏,直观表现为淀粉糊的黏度增加。RVA通过精确的温度控制程序,模拟淀粉糊化的水热环境,通过检测糊化过程的黏度变化,对淀粉进行定性、定量分析[23]。图2是4种样品的RVA黏度曲线,热处理后大麦粉的峰值黏度均显著降低,尤其是加酶挤压和高压蒸煮处理样品,黏度变化几不可见,说明EES和HPS中淀粉糊化程度高,结晶区被完全破坏。
图2 不同热处理后大麦粉的RVA黏度曲线
Fig.2 RVA viscosity curves of barley flour under different heat treatments
2.3 不同热处理大麦粉的显微结构
不同热处理样品与原大麦粉的扫描电镜图片如图3所示,原大麦粉(图3-a)中存在2种类型的淀粉颗粒,颗粒较大的呈光滑圆饼状,颗粒较小的为球形,呈典型双峰粒度分布,颗粒之间无黏连,与文献报导一致[24]。加酶挤出物(图3-b)可以很明显观察到淀粉颗粒破碎,失去圆饼状的淀粉形态,部分碎块发生聚集,表面粗糙且形状不规则,这可能是由于挤压腔内的高温高剪切环境加剧了淀粉的崩解。聚集体表面出现明显孔洞和凹坑,可能是挤压过程中的酶水解导致[25],促进了可溶性物质的浸出,有利于后续糖化酶的接触作用。蒸汽蒸煮样品(图3-c)同样出现淀粉颗粒的聚集,但聚集体中仍有部分淀粉保持光滑表面,可能是在低水分蒸煮条件下,淀粉糊化不均匀所导致。高压蒸煮(图3-d)后淀粉颗粒同样呈聚集状,表面出现大而密集的凹坑,部分降解为细碎的淀粉块,相比于蒸汽蒸煮,淀粉颗粒破坏更严重,这是由于在密闭环境下的热蒸汽不受样品数量和大小限制,淀粉样品受热更加均匀[26]。
a-RAW;b-EES;c-SCS;d-HPS
图3 不同热处理后大麦粉的SEM图(×1500)
Fig.3 SEM micrographs of barley flour under different heat treatments
2.4 不同热处理大麦淀粉的降解情况
如图4所示,根据体积排阻原理,出峰时间越早则物质分子质量越大,峰面积越大表明该分子质量占比越大。原大麦淀粉出峰时间最早,且重均分子质量(weight-averaged molecular weight,Mw)较大(Mw≈2.5×106 g/mol)的淀粉分子所占比例最高,约74%。经热处理后,淀粉分子发生不同程度的降解,色谱峰出峰时间后移,大麦粉经蒸汽蒸煮处理后,淀粉分子质量仍呈双峰分布,但大分子淀粉占比降低；高压蒸煮样品出现多个色谱峰,且拖尾严重,分子质量分布在一个较宽的范围,小分子糖类(Mw<103 g/mol)约占25%；加酶挤压样品峰形变化最明显,近70%淀粉分子被降解为低聚糖和可溶性糊精,高剪切和酶水解的协同作用使淀粉在低水分下实现了高度糊化和液化,降解效果明显[27]。
图4 不同热处理后大麦淀粉的降解情况
Fig.4 The degradation of barley starch under different heat treatments
2.5 麦汁和成品啤酒的品质参数
对3种不同热处理的大麦粉进行微糖化实验,糖化麦汁中可发酵糖(以葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖总量为指标)和α-氨基氮含量以及成品啤酒的酒精度如表2所示。可发酵糖约占麦汁浸出物的80%,是酵母繁殖必须的营养物质,对成品啤酒的酒精度和风味特征都有很大影响[28]。调节麦汁糖度均为12°P的前提下,3种热处理方式得到的麦汁可发酵糖占总糖的比例分别为81.58%、52.23%、71.68%,加酶挤压获得最高的可发酵糖占比,其次是高压蒸煮以及蒸汽蒸煮。而普通麦汁的可发酵糖占比一般在70%左右,说明加酶挤压和高压蒸煮得到的啤酒麦汁符合发酵要求。
表2 不同热处理大麦粉所得麦汁和成品啤酒的参数
Table 2 Parameters of wort and finished beer of barley flour under different heat treatments
样品可发酵糖/(mg·mL-1)α-氨基氮/(mg·L-1)酒精度/%EES99.789±0.655a154.08±8.36b4.895±0.728aSCS62.682±0.716c150.66±8.17b2.625±0.403bHPS86.021±1.335b183.44±5.97a3.775±0.304ab
氨基氮是酵母生长繁育的重要营养物质，麦汁中α-氨基氮含量不能低于130 mg/mL，常浓发酵过程中为了实现麦汁的彻底发酵，氨基氮含量应不低于150 mg/mL[29]。由表2可知，三种热处理所得麦汁的α-氨基氮含量均能满足发酵要求，但高温高压处理对糖化阶段的氨基氮浸出更加有利。
EES得到的成品啤酒的酒精度满足12°P麦汁酿得的啤酒酒精度要求(≥4.1%),而SCS和HPS得到的成品啤酒发酵效果不佳,乙醇浓度较低,可能是与可发酵糖的含量和组成有关。
3 结论
本文研究了3种热处理方式(加酶挤压、蒸汽蒸煮、高压蒸煮)对大麦粉理化性质的影响,根据不同热处理后的产品属性特征,结合酿造过程参数,确定了其在全大麦啤酒酿造过程中的可能性。结果表明,加酶挤压对大麦粉的理化改性使其在糖化过程中更具优势。加酶挤压处理后,大麦粉的水合特性显著增强,WSI从2.98%升至57.10%,淀粉降解为黏度较低的低聚糖和糊精,大量可溶性物质浸出。较高的糊化度和多孔的表面结构使其更容易与糖化酶作用,所得麦汁的碳氮源物质丰富,利于酵母生长繁殖,成品啤酒的酒精度符合国标要求。但过滤阻塞以及口感淡薄的问题依然存在,如何优化糖化酶制剂的添加量和种类,选择合适的糖化程序仍然是全大麦啤酒酿造亟待解决的关键问题。但毫无疑问,加酶挤压预处理为全大麦啤酒的酿造提供一种新思路,挤压腔内的高效剪切协同酶水解作用能够在低水分下实现原料的糊化和液化,符合节能减排,绿色生产的要求,为全大麦啤酒的酿造奠定了基础。
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