抗菌活性包装是近年来功能性包装的研究热点之一，其主要实现途径包括负载活性物质的微囊、复合膜、涂膜、静电纺丝等[1-4]。其中对活性物质的装载量及缓释性能是需要重点解决的问题。气凝胶作为一种新型功能材料，其优良的孔隙率与比表面积为其在食品、医药、生物科学、隔音隔热、吸附等领域提供了结构支持[5-8]。研究表明，气凝胶的三维孔洞结构可以装载活性物质并起到缓释的作用，有望解决上述包装关键问题[9-11]。
目前对于气凝胶的研究大多集中于硅类气凝胶，相对于这种无机类气凝胶，多糖/蛋白类气凝胶则表现出更好的生物相容性与生物可降解性[12]。DHARUNYA等[13]以姜黄素作为交联剂，交联胶原蛋白制备的气凝胶可以用于人工骨架。ANJA等[14]发明了一种可生物降解的有机气凝胶，可作为肠外给药的诊断剂和治疗剂。但总的来说，多糖/蛋白类气凝胶装载和缓释活性物质方面的研究仍较少。
在活性包装应用中，精油为抗菌剂之一有着较为广泛的应用。丁香精油的主要成分是丁香酚，除了具有较强的杀菌能力之外，对流感病毒也有一定的抑制作用，可入药，用于降血压，作为局部镇痛药用于龋齿等[15-16]。本研究选用丁香精油作为包装活性物质。
本研究的前期工作对普鲁兰多糖(pullulan，PUL)气凝胶的制备工艺进行了优化并探讨了其应用可行性[17]。亦有学者探讨了乳清分离蛋白(whey protein isolate，WPI)气凝胶的机械性能与应用性[18-20]。由于多糖类PUL气凝胶吸湿性高、受压易变形，而蛋白类WPI气凝胶质地则较脆，结构易崩塌，若将二者复合则可能改良性能。为此，本文在前期单因素实验基础上进行Plackett-Burman 设计，选出3个最显著因素：PUL添加量、pH与凝胶温度，并以此进行二次回归实验。采用 Box-Behnken 模型，设置3因素3水平，以气凝胶的丁香精油装载性能为响应值进行优化并对其吸湿性、抗压性能、热力学性能、微观结构及精油释放性能进行测试，旨在为活性包装研究提供一种新的途径，为多糖/蛋白类气凝胶在装载缓释领域的应用提供可行方案。
1 材料与方法
1.1 实验材料
乳清分离蛋白，美国ISOPURE公司；普鲁兰多糖(纯度>98%，Mw:342～710 000)，上海萨恩化学技术有限公司；丁香精油，吉安市中香天然植物有限公司；盐酸、氢氧化钠、氯化钠、溴化钾，国药集团上海化学试剂有限公司；去离子水，实验室提供。以上试剂除注明外均为分析纯。
1.2 仪器与设备
TA.XT Plus质构仪，英国SMS公司；S3400 N型扫描电子显微镜，Hitachi(日立)公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，河南省巩义市科瑞仪器有限公司；SCIENTZ-10 N型真空冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；Nicolet iZ10型傅立叶变换显微红外成像光谱仪，Thermo Scientific有限公司；LHS-500HC-II型恒温恒湿箱、YP202 N型电子天平、雷磁PHS-3C pH计，上海精密科学有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 WPI-PUL复合气凝胶的制备
用电子天平称取20 g WPI粉末置于洁净烧杯中，添加一定量PUL粉末，各加100 mL去离子水在25 ℃水浴条件下充分搅拌使之混合。肉眼不可见白色悬浮物后再继续搅拌5 min。混匀后密封，于4 ℃冰箱静置12 h,使其充分水合。后加入0.585 g NaCl，并用1 mol/L的HCl或NaOH溶液调节其溶液pH，于25 ℃恒温水浴搅拌30 min。将搅拌后分散均匀的悬浮液除去溶液上层泡沫后倒入2 mL离心管，一定温度条件下水浴加热30 min,使之充分形成WPI-PUL水凝胶，再置于-20 ℃冰箱冷冻12 h。将冷冻完全的样品置于真空冷冻干燥机进行干燥(规程：-45 ℃，15 Pa，2 d)，制得WPI-PUL复合气凝胶。制备完成的样品气凝胶测定其丁香精油装载率，并以此为响应值，采用 Design-Expert软件进行响应面实验设计和分析结果得出优化方案并验证。精油释放性能、抗压性能等性能测试均基于此最优方案进行。
1.3.2 精油装载
采用AHMADI等[18]的方法并作修改，将WPI-PUL复合气凝胶样品浸入丁香精油中，在30 ℃恒温密封条件下浸载3 h，充分吸附精油至气凝胶的孔道中。后取出置于敞开培养皿上，30 ℃恒温使其充分挥发至恒重。装载率按公式(1)计算：
(1)
式中：T代表装载率，%；m0代表未浸精油前气凝胶的初始质量，g；mt代表挥发至恒重的气凝胶质量，g。
1.3.3 精油释放
根据国标GB 31604.1—2015，以95%(体积分数，下同)乙醇溶液和蒸馏水作为食品模拟液。将载有精油的WPI-PUL复合气凝胶样品分别完全浸入50 mL 95%乙醇溶液和蒸馏水中，25 ℃水浴条件下密封磁力搅拌，每隔10 min取样3 mL溶液，并补充3 mL 对应溶剂。对取出液进行紫外分光光度检测，对照组为同等处理的未载油气凝胶样品浸泡液，通过标准曲线计算精油释放浓度[21]。释放率R按公式(2)计算：
(2)
式中：R代表释放率，%；Ci代表第i次取样时精油浓度，g/mL；m代表精油装载量，g。
1.3.4 吸湿率测定
采用SU等[22]的方法并作修改,将气凝胶置于相对湿度为83.6%，温度为30 ℃的恒温恒湿箱中，每隔一定时间称取一次气凝胶重量，直至气凝胶重量恒定。气凝胶吸湿率按公式(3)计算:
(3)
式中：H代表吸湿率，%；W代表吸湿一定时间后气凝胶的质量，g；W0代表未吸湿前气凝胶的初始质量，g。
1.3.5 抗压性能测试
将装载精油前后的WPI-PUL复合气凝胶切成高度为1 cm的圆柱状样品。参数设定如下，探头：36R平面探头；测前速度：1.0 mm/s；测定速度：0.1 mm/s；测后速度：1.0 mm/s；应变：75%。在获取的应力-应变曲线上，取应变范围8%～15%线性区域的斜率，记作气凝胶的压缩模量[18]。
1.3.6 扫描电镜分析
分别将装载前后的WPI-PUL复合气凝胶样品沿横切面切成1 mm厚的薄片，粘于导电胶上喷金120 s后，使用扫描电镜观察气凝胶表面的微观结构[23]。
1.3.7 傅里叶红外光谱分析
分别将各组样品碾碎后，与KBr混合。混合比例为1∶100(质量比)。再进行研磨，压片。傅里叶红外光谱的扫描范围为450～4 000 cm-1，分辨率为4 cm-1。
1.3.8 热重分析(thermogravimetric analysis,TG)
分别将各组样品(5～10 mg)置于Al2O3坩埚中，以20 mL/min流速的氮气作为保护气和吹扫气，以10 ℃/min的加热速率从30 ℃加热到600 ℃[24]。
1.3.9 数据统计与分析
文中数据均为3次平行实验平均值，采用SPSS 25软件进行数据处理与分析并用Orgin 2019软件绘图。
2 结果与分析
2.1 响应面设计与结果分析
采用 Box-Behnken 模型，以PUL添加量(A)、凝胶温度(B)与pH(C)为考察因素，设置3因素3水平，以气凝胶的丁香精油装载性能为响应值进行实验。实验设计及水平选择见表1,实验结果见表2。
表1 WPI-PUL复合气凝胶响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of WPI-PUL composite
aerogel response surface experiments
水平因素PUL添加量(A)/(mg·mL-1)pH(B)凝胶温度(C)/℃-1306.075 0457.080 1608.085
表2 Box-Behnken 实验设计及其结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken
实验编号ABC丁香精油装载率/%1-1-10250.1321-10250.373-110249.124110253.295-10-1249.08610-1249.817-101250.818101252.6190-1-1248.981001-1250.24110-11251.0412011253.5513000252.8314000252.9115000253.6516000252.7017000252.98
对表2数据进行多元回归拟合，得到方程如下：
Y=7.336 00-0.582 70A+5.231 80B+10.915 50C+0.013 100AB+0.017 833AC+0.062 500BC-5.914 44E-003A2-0.038 230B2-1.105 75C2
式中，Y为复合气凝胶的丁香精油预测装载率，%；A为PUL添加量，mg/mL；B，pH；C为凝胶温度，℃。
回归模型的方差分析结果见表3。极显著项有：A、B、C、AB、A2、B2、C2；不显著项有：AC、BC。模型的F=23.25，P=0.000 2<0.05，说明该模型显著；失拟项F=2.34，P=0.215>0.05，不显著，说明模型合理可用；R2=0.967 6表明线性关系明显，
总体证实响应面效果与试验拟合程度高，可对试验结果进行分析和预测。
表3 回归模型的方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型45.1895.0223.250.000 2∗∗A6.0216.0227.880.001 1∗∗B4.0314.0318.680.003 5∗∗C12.25112.2556.740.000 1∗∗AB3.8613.8617.880.003 9∗∗AC0.2910.291.330.287 4BC0.3910.391.810.220 5A27.4617.4634.530.000 6∗∗B23.8513.8517.810.003 9∗∗C25.1515.1523.840.001 8∗∗残差1.5170.22∗∗失拟项0.9630.322.340.215不显著净误差0.5540.14总和 46.6916R2=0.967 6;R2Adj=0.926 0
注:**表示影响极显著(P<0.01)
3种显著影响因素(PUL添加量、pH、凝胶温度)的响应面和等高线如图1所示。响应面皆呈开口向下的凸面，说明存在响应最大值[25]。响应面的陡缓程度和等高线的形状反应了因素交互作用的强弱。响应面走势陡表明影响显著，反之则说明影响不明显。等高线近椭圆则表明两因素之间交互作用显著；近圆则说明交互作用不显著[26]。结果表明,PUL添加量(A)和pH(B)交互作用对响应面值的影响显著，PUL添加量(A)和凝胶温度(C)、pH(B)和凝胶温度(C)交互作用对响应值的影响不显著。
a-pH、PUL添加量；b-凝胶温度、PUL添加量；c-凝胶温度、pH
图1 PUL添加量、pH、凝胶温度交互作用对丁香精油
装载率的响应面曲线及等高线
Fig.1 Response surface curves and contour lines of clove
essential oil loading rate by interaction of PUL addition,
pH and gel temperature
根据Design-Expert软件分析，得到丁香精油最大装载率的理论最佳条件为：PUL添加量为55.86 mg/mL, pH值7.87，凝胶温度83.85 ℃。该条件下预计得到的复合气凝胶丁香精油装载率为254.113%。考虑到实际操作，取PUL添加量55 mg/mL, pH值7.9，凝胶温度84 ℃，实际丁香精油装载率为254.23%，与预测值非常接近，说明拟合结果可以真实地反映各因素对复合气凝胶丁香精油装载率的影响，具有实际应用价值。
2.2 精油释放性能分析
图2为装载丁香精油的WPI-PUL复合气凝胶在蒸馏水及95%乙醇中的动态释放曲线，曲线的斜率均随时间递减，表明其释放速率随浸渍时间的延长而放缓，前10 min表现出最大释放速率。在水体系中140 min 后释放速率放缓，并在360 min后趋于平衡，释放率为48.94%；95%乙醇体系中，180 min后释放速率放缓，并在420 min后趋于平衡，释放率为65.59%。记平衡数值为总释放率，平衡数值对应时间越大，则说明复合气凝胶的缓释性能最好，从中可以看出在95%乙醇体系中装载丁香精油的复合气凝胶缓释性能更好。2种体系释放总体趋势相似，但总释放量均有所增大，这是由于丁香精油在乙醇中具有更大的溶解度。拟合各释放曲线得到的模拟方程如表4所示。
图2 复合气凝胶精油释放曲线
Fig.2 Essential oil release curve of composite aerogels
表4 气凝胶精油释放率的非线性模拟方程
Table 4 Simulation equation of aerogel essential
oil release curve
模拟液拟合方程(t≠0)相关系数R2蒸馏水r=6.456E-6t3-0.004t2+0.647t+9.3390.95195%乙醇r=8.106E-6t3-0.005t2+0.850t+11.3590.961
注：r：释放率，%；t：时间，min
2.3 吸湿性能分析
气凝胶产品本身含水量很低，因为在冷冻干燥过程中大部分的水分已被除去。由于气凝胶本身的多孔洞结构具有一定的吸水性，而吸水之后的气凝胶不易保存，更容易腐败变质，对于装载活性药物的适用性也大大降低[20]。图3为复合气凝胶的吸湿率随时间的变化曲线，曲线的斜率即为吸湿速率。复合气凝胶在前6 h表现出较大的吸湿速率，随后吸湿速率放缓，并于24 h后达到动态平衡，最终平衡吸湿率为11.41%。
图3 复合气凝胶吸湿率曲线
Fig.3 Moisture absorption curve of composite aerogels
2.4 抗压性能分析
图4反映了抗压测试过程中复合气凝胶在匀速形变过程中应力的变化情况。未装载精油的气凝胶样品曲线前18%区域(以横坐标应变衡量，下同)近似为一条直线，取8%～15%区域的斜率记作复合气凝胶的压缩模量衡量其抗压性能，其值越大说明抗压性能越好，未装载精油的气凝胶压缩模量为21.745 MPa，具有良好的抗压性能。压缩形变45%～50%后应力大幅减小，这是因为压缩过程中气凝胶部分结构坍塌导致应力变小。压缩形变50%后应力显著增大，这可能是因为气凝胶孔道接近完全压缩，结构难以改变所致。装载丁香精油后复合气凝胶的压缩模量有所下降，这可能是由于干燥除去复合气凝胶表面多余精油时，其结构产生轻微崩塌，但其抗压性能(11.247 MPa)仍能满足正常应用需求。
图4 气凝胶装载精油前后的应变-应力曲线
Fig.4 Strain-stress curves of aerogels before and after
loading essential oils
2.5 扫描电镜分析
复合气凝胶装载丁香精油前后的微观结构如图5所示。
a-未装载丁香精油；b-装载丁香精油
图5 气凝胶装载精油前后的微观结构
Fig.5 Microstructure of aerogels before and after
loading essential oils
图5-a为复合气凝胶未装载丁香精油的微观结构图。孔道分布较为均一，孔径分布纳米级到微米级，反映出在响应面优化条件下制备的复合气凝胶仍有较好的开孔情况。图5-b为复合气凝胶装载丁香精油的微观结构图，可以看出，精油被均匀地吸附入凝胶孔道中，孔道结构依然存在并未被精油破坏。实验发现，吸附并不仅仅存在于气凝胶表面，复合气凝胶中心部分仍有较多精油被吸附。孔径越小，吸附作用越好，这与毛细管吸附作用类似。
2.6 傅里叶红外分析
图6为复合气凝胶及其装载丁香精油前后的傅里叶红外波谱。1 025 cm-1处附近为PUL中醚键的伸缩振动，而1 657 cm-1处附近则是WPI的特征峰，为C—N 的伸缩振动。相对于空白组，装载丁香精油组在1 605 cm-1、1 516 cm-1、1 458 cm-1处出现了3个吸收峰，这为丁香酚苯环的特征峰，3 015 cm-1处为苯环上C—H的伸缩振动。添加了丁香精油后对复合气凝胶的红外光谱总体影响不大，主要因为WPI、PUL与丁香酚有相似的官能团。空白组3 293 cm-1处出现一较宽吸收峰，为分子间O—H的伸缩振动，装载精油后该峰强度均有所变化，并发生了不同程度的偏移，说明体系有新的氢键形成，反映出精油吸附到复合气凝胶孔道后，主要是通过分子间氢键与之结合。
图6 气凝胶装载精油前后的傅里叶红外分析
Fig.6 Fourier transform infrared spectroscopy analysis of
aerogels before and after loading essential oils
2.7 热重分析
图7为复合气凝胶装载丁香精油前后的TG曲线(30～600 ℃温度范围)。空白组第一段显著热失重出现在30～110 ℃，主要原因是气凝胶吸附的空气中水分的逸出。空白组曲线在这一阶段的差异反映了高浓度PUL的气凝胶具有更强的吸湿性；110～290 ℃的热重变化则是由于PUL的部分分解和水分的进一步散失造成的；290～350 ℃则产生了WPI与PUL的大规模裂解，期间复合气凝胶质量损失约为70%。温度高于350 ℃之后，质量损失速度减缓，这部分损失是剩余残渣碳化使得氮氧元素丢失造成的。装载丁香精油的复合气凝胶第一段明显热失重则是在120～180 ℃，质量损失高达71%，这阶段主要是丁香精油的挥发所致。
图7 气凝胶装载精油前后的TG曲线
Fig.7 TG curves of aerogels before and after
loading essential oils
3 结论
PUL添加量、pH、凝胶温度、凝胶时间、交联剂添加量、冷冻干燥时间等均对WPI-PUL复合气凝胶的性能有着一定影响。前期通过在单因素实验基础上进行Plackett-Burman 设计，选出3个最显著因素：PUL添加量、pH与凝胶温度。通过Box-Behnken 模型以气凝胶的丁香精油装载性能为响应值进行优化并验证得到最优制备条件为：PUL添加量55 mg/mL, pH值7.9，凝胶温度84 ℃。最优条件下制得复合气凝胶样品对丁香精油有着良好的装载性能及缓释性能，最大装载率为254.23%。在水体系中，释放360 min 后达到最大释放率，为48.94%，释放方程：r=6.456E-6t3-0.004t2+0.647t+9.339；在95%(体积分数)乙醇体系中，释放420 min后达到最大释放率，为65.59%，释放方程：r=8.106E-6t3-0.005t2+0.850t+11.359(95%乙醇)。平衡吸湿率为11.41%，相比纯WPI或PUL气凝胶均有所降低，更适于活性物质的装载与贮藏。装载丁香精油前压缩模量21.745 MPa，有着较好的抗压性能，装载后仍有11.247 MPa，可满足正常应用需求。
综合来看，选用PUL添加量55 mg/mL, pH值7.9，凝胶温度84 ℃制备的WPI-PUL复合气凝胶可以得到有着良好的机械强度、丁香精油装载率和缓释性能以及低吸湿率的气凝胶产品，适用于活性包装载体、食品微胶囊及生物医药载体的开发与应用，同时可为气凝胶的制备提供了指导意义。
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