随着经济生活水平的改善，人们对啤酒的口味有了更高的追求，与传统的熟啤酒相比，工坊啤酒具有独特的口感，特别是比利时风格的啤酒，其有着口感清新、麦芽香浓厚、酵母酯香突出等特点[1]，越来越受到人们的青睐。啤酒在运输、贮藏及销售过程中，其口感和新鲜程度会发生变化，从而导致啤酒品质的劣变，直至货架期终点。啤酒的货架期与生产工艺、运输流通、贮藏销售环境等相关，直接影响食品生产企业的产品品质、品牌信誉，以及消费者的健康、消费偏好与接受程度。因此，有必要对啤酒的货架期进行系统评估与预测。
温度是影响食品品质变化速率的主要因素，且不受包装材料的关联，一般来说，食品贮藏温度越高，货架寿命就越短。基于品质衰变原理的货架期加速试验[2](accelerated shelf-life testing, ASLT)是一种预测食品货架期的有效方法，通过提高食品的贮藏温度，在短时间内加速食品劣变过程来预测食品的货架期，它是一种基于温度与食品货架寿命的预测模型。关于熟啤酒的货架期研究已有较多文献，主要集中在货架期的稳定性、风味变化和工艺改进等[3-6]。目前对比利时工坊啤酒的研究还较少，对工坊啤酒贮藏品质变化、货架期预测的研究也鲜有报道。由于未经杀菌，比利时工坊啤酒的货架期一般只有3～8 d，针对该啤酒货架期极短的缺点，研究一种在有效杀菌前提下，能保持啤酒独特风味，同时延长产品货架期的方法对啤酒生产企业尤为重要。热杀菌在一定程度上会导致食品质量下降，如色泽、口味变化、香气损失、营养成分破坏等。超高压技术作为一种新兴的冷杀菌技术，它是将食品物料密封于弹性包装材料中，以水或其他流体介质作为传压媒介，在100～1 000 MPa压力下作用一段时间，以达到杀菌目的的一种非热加工技术，既能有效杀灭细菌，又能最大程度保持食品品质[7-9]。因此，利用超高压技术处理啤酒有巨大的商业价值。
本文以比利时艾尔琥珀工坊原浆啤酒为原料，从微生物稳定性、非生物稳定性和风味稳定性三方面对原浆啤酒、超高压杀菌啤酒和模拟巴氏杀菌啤酒3种产品的品质进行了对比与评估，并采用ASLT中的模型对啤酒的货架期进行预测。
1 材料与方法
1.1 实验材料与试剂
原浆啤酒，深圳市绿航星际太空科技研究院；食品级聚酯聚乙烯(polyethylene terephthalate and polyethylene，PET+PE)复合材质塑料袋、食品级PET瓶，喜之龙包装有限公司。
酚酞试剂、氢氧化钠、氯化钠，广州化学试剂厂；平板计数琼脂、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤、煌绿乳糖胆盐肉汤、孟加拉红琼脂、MRS琼脂，广东环凯微生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
LHS恒温恒湿培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计，上海添时科学仪器有限公司；800 MPa双容器食品超高压装置，包头文天科技有限责任公司；真空包装机，广州瑞宝包装机械有限公司；HH-2数显恒温水浴锅，常州澳华公司；双乙酰蒸馏器，东宏玻璃仪器厂；泡持杯、酸碱两用滴定管，郑州科教玻璃仪器商城；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品的准备
(1)原浆啤酒：直接采用深圳市太空科技南方研究院生产的啤酒原浆，作为试验的空白对照。(原麦汁浓度：10.8 °P)
(2)模拟巴氏杀菌处理啤酒：以原浆啤酒为原料，62 ℃条件下恒温水浴加热30 min。
(3)超高压处理啤酒：经前期单因素试验，啤酒在300 MPa，15 min超高压处理具有较好的风味品质，所以采用常温下(25 ℃)300 MPa，15 min进行试验。关于超高压参数影响研究将在另文中阐述。以原浆啤酒为原料，选择约450 mL的透明PET瓶，洗净倒置晾干后紫外灯照射杀菌30 min，灌装后封盖，为防止加压过程中瓶身破裂导致超高压介质渗透污染，将灌好后的啤酒置于PET+PE袋中抽真空后热封包装，并在袋中加20 mL水，防止瓶子在加压过程中变形，最后放入超高压加压腔中。实验时，设定好压力及时间参数，传压介质为水。本实验不考虑升压、泄压过程中样品温度的变化，假定处理过程中温度恒定不变。
所有试验样品均1次制作完成，原浆啤酒、巴氏样品灌装方式均同超高压样品。试验样品制备完成后立即进行感官评价，同时取样检测样品中理化及微生物指标。
1.3.2 微生物测定方法
菌落总数测定参照GB 4789.2—2016，采用倒平板法；大肠菌群测定参照GB 4789.3—2016，采用MPN计数法；酵母菌测定参照GB 4789.15—2016，采用倒平板法；乳酸菌测定参照GB 4789.35—2016，采用倒平板法。每次处理取3瓶样品测定，各稀释梯度重复3次，取平均值，其中样品中的微生物是自然存在着的。
1.3.3 理化指标测定方法
色度、浊度、泡持性、总酸、双乙酰的测定参照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》。
1.3.4 感官评定方法
根据表1感官评分标准，选择6名专业人员分别从酒体外观、泡沫、气味、滋味进行打分，再对各项指标加权处理，最后得到综合评分，其中，外观、泡沫、气味、滋味的占比分别为30%、20%、25%、25%。
表1 啤酒感官评分标准
Table 1 The standard of beer sensory evaluation
项目8～10分4～7分0～3分外观酒体呈现琥珀色泽,无分层,酒体均匀、浑浊,无沉淀酒体呈现较深的琥珀色,无分层,酒体较均匀、浑浊,有少量沉淀酒体颜色偏暗,酒体出现不均匀,上清下浑、沉淀较多泡沫大量泡沫,洁白细腻,挂杯持久(≥340 s)泡沫量较多,较洁白细腻,挂杯较持久(≥300 s)泡沫量少,颜色不洁白或泡沫粗糙,挂杯不持久气味酒花香突出,麦芽香明显,风味协调令人愉快酒花香较突出,麦芽香较明显,风味较协调出现明显令人不愉快气味,如纸板味滋味纯正清爽、柔和协调、杀口力强较纯正爽口,较柔和,杀口力较强不柔和,杀口力弱,有令人不愉快的杂异味
1.3.5 货架期预测方法
ASLT是一种快速有效预测食品货架期的方法，本试验采用Q10模型进行预测。在ASLT中用Q10来表示温度对反应的敏感程度，罐藏食品Q10取值在1.1～4，试验温度在20～40 ℃。为了准确判断食品的货架期，通常会选择2个以上的试验温度，每个试验温度条件下样品的检测时间间隔也需要确定，满足公式(1)[10]：
(1)
式中：f1为较高试验温度T1时每次测样的时间间隔；f2为较低试验温度T2时每次测样的时间间隔，ΔT为T1与T2的温度差。
Q10是指温度相差10 ℃时2个任意温度下货架期的比例，其关系满足公式(2)：
(2)
对于温度差不为10 ℃时采用公式(3)：
Qs(T1)=Qs(T2)×Q10ΔT/10
(3)
式中：Qs(T1)为温度T1下食品的货架期，Qs(T2)为温度T2下食品的货架期，ΔT为T1与T2的温度差。
由ASLT原理确定本次货架期试验的3个温度分别为4、27、37 ℃，其中4 ℃为对照试验温度，27 ℃和37 ℃为加速货架期试验温度。将制备好的样品分别放置于4、27、37 ℃的恒温箱中避光保存，37 ℃条件下的样品每1 d测定1次，参考文献[10]Q10值取为2，则27 ℃条件下的样品每2 d测1次，4 ℃条件下的样品为对照，每4 d测1次。样品总测试时间设计为28 d，每个温度均设置3个平行样，试验结束后对结果进行汇总，实验结果取平均值。
1.3.6 数据统计与分析
数据统计分析、画图均使用Microcal Origin 9.0软件。
2 结果与分析
2.1 微生物稳定性分析结果
2.1.1 贮藏期试验前啤酒微生物检测结果
由表2可知，原浆啤酒中菌落总数、大肠菌群数量均超过了国标中对应的检测限(菌落总数≤50 CFU/mL，大肠菌群≤3 MPN/mL)。国标中虽未对酵母菌、乳酸菌数量作出规定，但富含过多的酵母容易使酒液微生物系统不稳定且更易产生酵母自溶[11]，过量乳酸菌存在也会导致啤酒感官品质下降，进而影响产品货架期，因此，有必要对原浆啤酒进行杀菌处理。
表2 贮藏前啤酒微生物检测结果
Table 2 The microbe test results before beer storage
啤酒样品菌落总数/(CFU·mL-1)大肠菌群/(MPN·mL-1)酵母菌/(CFU·mL-1)乳酸菌/(CFU·mL-1)原浆啤酒 450156×104960超高压样品22-8-巴氏样品 24---
注：“-”表示未检出(下同)
2.1.2 贮藏期试验后啤酒微生物检测结果
截至ASLT结束，由于未经杀菌处理，3个贮藏温度下的啤酒原浆各微生物数目均有所增长(表3)。但4 ℃下菌落总数、酵母菌、乳酸菌增长较27、37 ℃慢，与贮藏前相差不大，说明低温可在一定程度上抑制生啤中微生物生长，酵母菌数目呈现下降趋势，原因可能是试验贮藏温度不适合酵母菌生长代谢，导致死亡。巴氏样品菌落总数均符合国标中菌落总数限量，大肠菌群、酵母菌、乳酸菌均未检出，与模拟巴氏杀菌当天结果相似。分析原因可能是因为杀菌较彻底，加上啤酒本身有一定的抑菌能力[12-13]。因为在啤酒中有酒花的存在，而酒花中某些苦味物质如苦味酸能够在一定程度上抑制微生物的生长，如在啤酒发酵中绝大部分乳酸菌等微生物在加入了酒花的麦汁中很难存活[14]。
表3 贮藏后啤酒微生物检测结果
Table 3 The microbe test results after beer storage
贮藏温度/℃菌落总数/(CFU·mL-1)大肠菌群/(MPN·mL-1)酵母菌/(CFU·mL-1)乳酸菌/(CFU·mL-1)原浆4580156.0×104980啤酒271.2×103232.9×1041.2×103373.2×103388.5×1032.8×103超高压424-8-样品2730-4-3732---巴氏430---样品2732---3736---
超高压样品的检测结果也相似。3个温度下样品均未检测出乳酸菌、大肠菌群，说明超高压杀菌能有效致死啤酒中的微生物。
2.2 非生物稳定性分析结果
2.2.1 贮藏期试验前啤酒样品理化结果
啤酒的非生物稳定性决定了啤酒的感官品质，良好的非生物稳定性能增强消费者的购买意愿。对在啤酒销售中最易影响消费者的理化指标进行检测，结果如表4所示。不同的杀菌方式是造成啤酒样品初始理化结果不一样的原因。超高压样品理化结果与原浆都较为接近，而巴氏样品差异较大。本试验样品属于浓色艾尔啤酒[15]，故以GB 4927参照作为检测限量标准。
表4 啤酒理化检测结果
Table 4 The physical and chemical test results of beer
啤酒样品色度/EBC浊度/EBC泡持性/s原浆啤酒 17.6017.29369超高压样品17.4617.03363巴氏样品 23.4417.73348
2.2.2 贮藏期试验后啤酒样品理化结果
2.2.2.1 色度分析结果
啤酒的色度不仅与原辅料中色素含量相关，而且与生产工艺也有很大关系。美拉德反应在麦芽干燥、糖化、发酵甚至成品贮存过程都一直在发生，其产物类黑精呈棕色[16-17]。麦汁煮沸过程中发生的焦糖化反应及多酚物质的氧化缩合也会使啤酒色泽变深[18-19]。不同温度下贮存的啤酒色泽变化如图1所示，3种啤酒的色度随着贮藏时间的延长都有所加深，而且在前4 d内显著增加。相同贮藏时间下，37 ℃啤酒样品色度较27 ℃和4 ℃增加得更多，这可能是由于在温度的影响下，加速了啤酒中美拉德反应的进行及多酚的氧化，产生了色深物质，武千均等[20]也研究发现，啤酒的色度会随着贮存温度及瓶中氧含量的升高而加深，且温度的影响要远大于瓶内氧的含量。JASKULA-GOIRIS等[21]对从比利时运送到日本的一批商业比尔森啤酒跟踪发现，运输过程中仅使用纸板箱运送的啤酒比使用冷藏容器运送的啤酒在目的地检测时色泽明显更深。在28 d贮藏时间内，4 ℃下的3种啤酒色度增加得最少，37 ℃下的啤酒色度增加得最多。贮藏温度是影响啤酒色度的重要因素，为了保持良好的色泽外观，应尽量采用低温的方式贮存。
a-4 ℃贮藏；b-27 ℃贮藏;c-37 ℃贮藏
图1 啤酒贮藏期间色度变化
Fig.1 Variation in the colority of beer during storage
2.2.2.2 浊度分析结果
比利时艾尔琥珀工坊啤酒因含有丰富的酵母所以浊度较高。图2为不同温度下贮藏的3种啤酒浊度的变化情况。如图2所示，在28 d贮藏结束后，3种啤酒的浊度随着贮藏时间延长均迅速下降(P<0.05)。4 ℃下的原浆与超高压啤酒的浊度在第8天左右急剧下降，巴氏啤酒中这一现象则出现在第12天，在浊度迅速下降之前3种啤酒浊度变化都不明显，可能是冷浑浊的原因；随着贮藏温度的升高，同一时间内的啤酒浊度越低，且发现3种啤酒浊度迅速下降的时间点都有所提前，且较高温度下的巴氏样品要早于其他样品。造成差异的原因可能是装瓶前巴氏样品由于热处理导致啤酒中酵母自溶影响了酒液胶体稳定性，进而影响了啤酒的浊度。
a-4 ℃贮藏；b-27 ℃贮藏；c-37 ℃贮藏
图2 啤酒贮藏期间浊度变化
Fig.2 Variation in the turbidity of beer during storage
2.2.2.3 泡持性分析结果
3种啤酒在装瓶前的初始泡持性都较好，由图3可知，在整个贮藏过程中，不同温度下的啤酒泡持性逐渐下降，4 ℃下样品较27、37 ℃下样品下降幅度小，试验结束后3种样品泡持性较装瓶前均下降(P<0.05)。现有研究表明，啤酒的泡持性下降与酸性蛋白酶A有关[22]，而酸性蛋白酶A是否是导致试验中超高压与巴氏样品泡持性下降的原因，还有待研究。
2.3 风味稳定性分析结果
2.3.1 贮藏期试验前啤酒样品风味物质
杀菌处理当天，超高压样品总酸与双乙酰含量相比原浆差别不大(表5)，均低于巴氏样品，可能是因为热处理影响了啤酒中酵母的代谢，导致总酸与双乙酰含量增加。
a-4 ℃贮藏；b-27 ℃贮藏；c-37 ℃贮藏
图3 啤酒贮藏期间泡持性变化
Fig.3 Variation in the foam stability of beer during storage
表5 啤酒风味检测结果
Table 5 The flavor test results of beer
啤酒样品总酸/[mL·(100mL)-1]双乙酰/(mg·L-1)原浆啤酒 1.90.038超高压样品1.90.046巴氏样品 2.20.108
2.3.2 贮藏期试验后啤酒样品风味物质
2.3.2.1 总酸分析结果
啤酒中的酸类物质是其主要风味构成成分之一，口感纯正、清爽的啤酒，其总酸含量总是保持在一个适宜的范围，总酸过高或过低都会影响啤酒的品质。由图4可知，不同温度下贮藏的啤酒总酸含量均随着时间的延长而升高(P<0.05)，且巴氏样品的初始总酸值总是大于超高压样品和原浆啤酒。就杀菌方式而言，同一贮藏时间内，相同贮藏温度下的超高压样品总酸含量均低于巴氏样品(P<0.05)，也低于原浆啤酒。就贮藏温度来说，不同温度的样品总酸含量差别较大(P<0.05)，在贮藏时间相同的情况下，温度越高，总酸含量也越高。
4 ℃下的啤酒样品在试验结束后总酸含量相比装瓶时仅略有上升，且均远低于国标限量(≤2.6 mL/100mL)，说明低温贮藏有利于减缓总酸的产生。导致高温下原浆中总酸快速上升的原因可能是原浆未经灭菌，有害微生物以酒液为培养基进行生长代谢并产生各种酸类物质，超高压样品与巴氏样品由于杀菌较彻底，总酸上升较原浆慢。
a-4 ℃贮藏；b-27 ℃贮藏；c-37 ℃贮藏
图4 啤酒贮藏期间总酸变化
Fig.4 Variation in the total acid of beer during storage
2.3.2.2 双乙酰分析结果
双乙酰是酵母代谢的副产物，是啤酒企业重要的品质监测指标，也是判断啤酒成熟与否的重要标志之一，是导致啤酒产生类似“饭馊味”的物质。国标中双乙酰的限量为0.1～0.15 mg/L。由图5可知，所有样品在试验结束后双乙酰含量相比装瓶时都有所升高，且温度对双乙酰影响显著(P<0.05)。样品中双乙酰在升高到一定值后均趋于稳定，高温样品双乙酰在开始贮藏后是急剧上升，而4 ℃样品是缓慢上升，说明高温会加速啤酒中双乙酰的生成。
试验结束后，超高压样品双乙酰均低于巴氏样品和原浆。说明超高压能有效减少双乙酰的生成。相比巴氏处理，超高压处理温度变化较小，样品中的双乙酰含量更接近原浆。高温贮藏的原浆在试验结束时双乙酰含量明显大于其他样品，可能是由于未经杀菌的原浆中相对适宜的温度促进了啤酒中有害微生物的生长代谢，影响了酵母的代谢反应。或者是温度加速了酵母自溶，导致了双乙酰升高。黄蕴怡等[23]在不同参数对酵母自溶的影响中发现，24 h后16 ℃下酵母的死亡率约是12 ℃下的4倍，过多的酵母自溶会促使双乙酰升高。从双乙酰的形成途径可知，α-乙酰乳酸在适宜的温度下可被分解为双乙酰，当啤酒中的糖类物质被消耗到一定程度或α-乙酰乳酸与双乙酰达到一定平衡时，双乙酰不再继续增加，所以双乙酰趋于稳定[24]。
a-4 ℃贮藏；b-27 ℃贮藏；c-37 ℃贮藏
图5 啤酒贮藏期间双乙酰变化
Fig.5 Variation in the diacetyl of beer during storage
2.4 感官评分结果
参考非生物稳定性与风味稳定性结果对啤酒样品进行感官评价，从图6感官评分的变化可以看出，随着贮藏时间的延长，原浆啤酒、超高压样品和巴氏样品的感官评分都在下降，特别是37 ℃下的样品，感官评分下降得非常快，4 ℃条件下的样品相对其他温度样品感官品质变化得最缓慢，所以低温贮藏有利于减缓比利时艾尔啤酒品质的劣变。由于原浆啤酒未杀菌，即使在4 ℃低温条件下，感官评分也在迅速下降，超高压较巴氏杀菌处理过的啤酒在口感风味上更接近啤酒原浆。因此，超高压处理更有利于比利时艾尔啤酒感官品质的保持。
a-啤酒原浆；b-模拟巴氏杀菌；c-超高压处理啤酒
图6 啤酒贮藏期间感官评分变化
Fig.6 Variation in the sensory evaluation of beer during storage
2.5 货架期预测结果
在前期感官评价试验中对结果统计发现，感官评分<5分时，啤酒被认为不被消费者接受，因此将感官评分5分作为消费者最低接受度标准，<5分时认为产品达到货架期终点，不被接受，以感官评分达到7分时计算实际的值。
对结果进行统计分析，计算公式参考1.3.5。由表6结果可知，超高压处理啤酒样品货架期显著高于巴氏杀菌啤酒样品，与常见市售比利时工坊啤酒冷藏下1周左右的货架期相比，超高压处理啤酒有巨大的优势，试验过程中实际计算的Q10值为2.25和2，处于1.1～4，说明货架期预测试验设计是合理的。
表6 货架期预测结果
Table 6 The results of shelf life prediction
项目超高压处理啤酒巴氏杀菌啤酒感官评分5分37 ℃第6天37 ℃第2天感官评分7分37 ℃时第4天;27 ℃时第9天37 ℃第1天;27 ℃第2天试验值22实际值2.252货架期预测结果4 ℃下87 d;商业贮藏20 ℃下24 d4 ℃下20 d;商业贮藏20 ℃下7 d
3 小结
研究结果表明，超高压杀菌结合较低温度下贮藏能很好地减缓啤酒品质的劣变，能较好地控制啤酒中双乙酰、总酸含量的升高，保持较好的色泽、浑浊度与泡持性。经超高压处理后的啤酒不仅有效地杀灭了有害微生物，还保证了啤酒的品质，冷藏条件下的货架期可达3个月左右。相较而言，巴氏杀菌处理啤酒冷藏条件下货架寿命只有20 d，常规市售比利时工坊啤酒冷藏下货架期只有1周左右，超高压处理后的啤酒货架期对比提升显著，同时超高压处理啤酒较巴氏杀菌啤酒在口感与风味上更接近啤酒原浆。因此，利用超高压技术处理啤酒具有巨大的商业价值。
超高压杀菌在一定范围内可致死部分微生物，但对于芽孢菌等作用较弱[25]，使得该技术存在一定的局限性，如何提高超高压的杀菌效果具有重要意义。辐照技术、电场技术、超高压技术等已被研究证明了其对于芽孢菌等的致死作用[26-27]，这些杀菌加工理论与技术已经比较成熟，但是对其中某两者或三者结合，对食品加工的研究及新产品的开发工作都还才开始，成果较少。所以，多种栅栏冷杀菌工艺相结合的灭菌机理与工艺研究还有大量工作要开展，具有较大的研究价值。
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