呋喃西林(nitrofurazone，NFZ)是一种人工化学合成的广谱抗生素，具有抗菌谱广、不易产生抗药性且低成本的特点，广泛应用于水产养殖业[1]。氨基脲(semicarbazide，SEM)，被认为是抗生素呋喃西林药物的特征性代谢物[2]。NFZ原药及其代谢残留物存在致癌、致突变、致畸的风险。美国、欧盟、日本及中国先后规定禁止在畜禽和水产养殖中使用NFZ药物。NFZ原药在动物体内的半衰期短，代谢迅速，原药本身难以被检测，而SEM能与蛋白质紧密结合，形成稳定的残留物质，可在体内存在几个星期。因此，在水产品风险监测和监督抽查中，以残留物SEM的检测值来判断养殖中是否非法使用NFZ。我国对动物源性食品中SEM残留的限量要求为1.0 μg/kg[3]。
目前，NFZ代谢物一般采用毛细管色谱分析方法[4]、免疫层析法[5-6]、生物传感器法[7]、高效液相色谱法[8-9]和液质联用法[10-13]检测，这些检测方法多应用在可食部分[14]，虾壳中残留分析方法报道较少[15]。近些年来，甲壳类水产品抽检结果表明SEM超标现象较严重，导致水产品的质量备受质疑，也对水产养殖业造成负面影响。有研究表明甲壳类水产品中存在内源性SEM，且可能来源于甲壳。相关标准[10]显示SEM衍生的方式为恒温振荡，衍生时间16 h。微波技术已在样品提取、消解、有机合成和衍生等诸多领域得到了广泛应用。微波提取不仅具有低耗能、耗时短等优点，同时还具有高效率，易操作等优势，微波辅助提取技术已被广泛应用于衍生提取工艺中[16]。因此，本文将微波技术运用于辅助SEM衍生[17-18]，针对虾类肌肉和壳2个部位进行SEM检测方法的优化，以期实现快速衍生目的，提高样品检测效率。与恒温振荡方式对比，本方法衍生时间缩短，方法灵敏度高、重现性好，适用于甲壳类水产品中NFZ代谢物残留测定。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
SEM标准品及SEM内标(SEM·HCl -13C-15N2)，美国Sigma-Aldrich公司；乙腈(质谱纯)、2-硝基苯甲醛(色谱纯)，美国Thermo Fisher公司；实验用水为超纯水；盐酸、乙酸乙酯、正己烷、二甲基亚砜、磷酸氢二钾、氢氧化钠(均为分析纯)，广州化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
TQ-S-Micro超高效液相色谱串联质谱仪，美国Waters公司；MAS-Ⅱ常压微波辅助合成萃取仪，上海新仪器微波化学科技有限公司；TDZ5-WS离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；Sigma 3k30高速冷冻离心机，德国Sigma公司；IKA T50均质机，德国IKA公司；AS20500/BDT超声清洗机，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；Sartorius BS3223S电子分析天平，德国Sartorius公司；Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司；涡旋混合器，美国Henry Troemner公司。
1.3 仪器工作条件
1.3.1 液相色谱条件
进样量：5.0 μL，柱温：30 ℃，色谱柱：ACQUITY UPLC®BEH C18(50 mm×2.1 mm×1.7 μm)反相色谱柱，流速：0.30 mL/min。流动相：A相为体积分数为0.1%的甲酸水(色谱纯)溶液，B相为乙腈；梯度洗脱程序见表1。
表1 液相色谱梯度洗脱条件
Table 1 Program of gradient elution
时间/min流速/(mL·min-1)A/%B/%00.375253.00.370304.00.330704.50.375256.00.37525
1.3.2 SEM及内标质谱条件
离子源：电喷雾电离正离子(electrospray ionization positive ion，ESI+)模式扫描；检测方式：多反应监测(multiple-reaction monitoring，MRM)模式。离子源温度：150 ℃；毛细管电压：3.5 kV；脱溶剂气体温度：600 ℃；脱溶剂气体流量：1 000 L/h，锥孔气体流量：50 L/h。母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量如表2所示。
表2 NFZ代谢物及其内标的质谱条件
Table 2 NFZ metabolites and their internal target
mass spectrometry conditions
药物离子对(m/z)锥孔电压/V碰撞能量/eVSEM209.1>166.1∗, 209.4>192.124,249,10SEM-13C-15N2212.1>168.1249
注：*代表定量离子
1.4 样品采集
罗氏沼虾样品采自珠海养殖基地，用便携冰箱运回实验室，在广州华润万家超市、水产市场购买斑节对虾、南美白对虾、罗氏沼虾3种虾类样品，-20 ℃冷冻保存待测。检测分析前，将样品解冻至室温，将样品分为虾肉和去头虾壳。虾壳70 ℃温度条件下烘干24 h，再用粉碎机粉碎。
1.5 样品前处理
1.5.1 虾肉预处理
振荡预处理：参考农业部783号公告-1—2006，优化后使用。称取均质虾肉样品2 g于50 mL离心管中，加入0.2 mol/L盐酸5 mL，100 ng/mL内标工作液100 μL，0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液200 μL，涡旋混匀5 min，离心管置于37 ℃恒温水浴振荡器、200 r/min避光振荡16 h。
超声预处理：称取均质虾肉样品2 g于50 mL离心管中，加入0.2 mol/L盐酸5 mL，100 ng/mL内标工作液100 μL，0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液200 μL，涡旋混匀5 min，置于40 ℃超声波清洗机中超声。
微波预处理：称取均质虾肉样品2 g于50 mL离心管中，加入0.2 mol/L盐酸5 mL，100 ng/mL内标工作液100 μL，0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液200 μL，涡旋混匀5 min，置于400 W微波。
取出衍生化样品冷却至室温，4 000 r/min离心10 min，取上清液转入50 mL离心管，加入磷酸氢二钾溶液2.0～4.0 mL混匀，调节pH至7.0～7.5，加入5 mL乙酸乙酯，涡旋15 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液，重复乙酸乙酯提取操作1次，合并上清液于10 mL离心管，40 ℃水浴氮气吹干，残渣用1.5 mL乙腈-甲酸水溶液[V(乙腈)∶V(0.1%甲酸)=5∶95]，加入1.5 mL正己烷，涡旋8 min，12 000 r/min离心10 min，过0.22 μm滤膜，待测。
1.5.2 虾壳预处理
参考曹爱玲等[19]方法优化后使用。虾壳在70 ℃热风干燥箱烘适量时间，然后用粉碎机粉碎，称取烘干粉碎的虾壳2.00 g于50 mL离心管中，依次加入0.4 mol/L盐酸5 mL、100 ng/mL内标工作液100 μL、0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液200 μL，涡旋混匀5 min，最后置于37 ℃恒温水浴振荡器200 r/min避光振荡16 h，后面与1.5.1虾肉处理方法相同。
1.6 SEM标准曲线的绘制
100 μg/mL SEM标准储备溶液：称取5.0 mg SEM，用甲醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，于0～4 ℃避光存放。
SEM标准工作溶液：准确吸取适量SEM标准储备液，用乙腈稀释，配制浓度为10和100 ng/mL的标准工作溶液。
分别准确移取10 ng/mL SEM标准工作溶液100、200、500 μL,100 ng/mL SEM标准工作溶液100、200、500和1 000 μL于7个50 mL离心管中，按1.5步骤操作，按1.3条件检测。
1.7 数据处理
实验所得数据采用Origin和Microsoft Excel 2016处理。
2 结果与分析
2.1 液相色谱和质谱条件的优化
不同型号的仪器在液相色谱质谱最佳方法参数方面都会有所差别，本方法采用Waters TQ-S Micro液质联用，取1 mL 1 μg/mL的SEM标准工作液，和1 mL 1 μg/mL的SEM内标工作液，按照1.5的方法定容于2 mL样品瓶中。分别吸取300～500 μL样品于毛细管注射器，以流动注射的方式，在ESI+模式下，选定已知目标物的母离子，进行离子源参数优化；而后分别以二级质谱方式进行其子离子及碰撞能量优化。采用ACQUITY UPLC®BEH C18反相色谱柱对流动相洗脱条件进行优化。优化后的洗脱条件详见1.3.1。优化后的质谱方法详见1.3.2。该方法的总离子流图如图1所示。
图1 SEM及其内标总离子流图
Fig.1 SEM and its internal standard total ion flow diagram
如图1所示，优化后的方法样品SEM出峰时间在1.14 min，峰形良好，在受到虾壳、肌肉样品中其他基质的影响下，仍能准确地检测到SEM，具有较强的抗干扰性。在肌肉样品SEM含量很低的情况下，仍能保持良好峰形，表明方法灵敏度高。单个样品检测时长为6 min，在稳定检测SEM的同时，大大缩短了检测时间，适用于现代水产品安全质量的监测。
2.2 样品前处理中盐酸用量的优化
前处理方法主要利用在酸性环境下将SEM从蛋白质上解离后衍生，提取浓缩的原理。本研究将虾类分为肌肉、虾壳两部分，由于虾壳与肌肉组织成分不同，主要由几丁聚糖和CaCO3组成，其中CaCO3含量很高，在解离衍生的同时会消耗酸，使其无法维持在稳定的酸性环境下衍生，导致SEM无法衍生完全。上机检测结果会出现内标工作溶液相应不稳定或偏低现象，导致SEM含量偏低或未检出。经优化及对比实验，优化添加盐酸浓度及体积见表3。
表3 盐酸添加浓度和体积
Table 3 The added concentration and volume of
hydrochloric acid in the sample
组织样品体积/mL添加浓度/(mol·L-1)衍生后的pH50.22.57肌肉80.22.19100.21.9850.43.48虾壳80.42.36100.42.18
由表3可知，2 g肌肉、虾壳样品添加盐酸，肌肉经过16 h衍生后，pH均保持在2.57以下，说明其解离衍生反应在稳定的酸性条件下进行，保证了SEM充分衍生。虾壳在添加5 mL和肌肉相同浓度的盐酸后，pH在7以上，因此增加盐酸浓度进行实验，在加入5 mL 0.4 mol/L 盐酸时，肌肉样品的pH达到3.48。结果表明，2 g虾肉在加入5 mL 0.2 mol/L盐酸，2 g虾壳在加入5 mL 0.4 mol/L盐酸时，样品pH达到在稳定酸性条件下衍生的要求，此时盐酸用量，为最佳条件。
2.3 衍生方式的优化
本实验对比了水浴振荡、超声波辅助衍生和微波辅助衍生3种方式对衍生效果的影响，结果列于表4。由表4可以看出，这3种方法对衍生效果具有显著性差异。超声波高频率振荡，可加速样品分散，增大样品与溶剂的接触面积，提高传质速度，从而缩短衍生反应的时间。按照1.5方法进行超声操作，在常温下分别衍生30、60和90 min。结果表明，超声30 min时，衍生不完全；超声90 min，衍生物峰面积达到最大，但是弱于振荡12 h的效果。按照李剑等[20]的方法，设定微波提取温度为60 ℃，分别微波衍生10、20和30 min。结果表明，微波10 min时，衍生不完全；微波超过20 min，衍生物峰面积增加不显著，微波衍生30 min和振荡衍生16 h没有显著差异，均能满足痕量分析要求。
表4 微波辅助、超声波和恒温振荡衍生方法的对比(n=3)
表4 Comparison of the derivative methods of
microwave-assisted and constant temperature (n=3)
衍生方式衍生时间虾肉含量/(μg·kg-1)虾壳含量/(μg·kg-1)8 h0.62±0.0338.94±1.24水浴振荡12 h0.83±0.0442.12±1.4716 h0.94±0.0842.95±1.1930 min0.59±0.0231.02±0.93超声波60 min0.75±0.0633.91±1.6490 min0.89±0.0738.24±2.2710 min0.74±0.0531.56±1.45微波辅助20 min0.92±0.0841.27±2.3330 min0.95±0.0643.08±1.58
2.4 方法的适用性评价
2.4.1 方法的线性范围与检测限
按1.6中的方法配制标准工作液，经超高效液相色谱-质谱测定，以SEM浓度为横坐标，SEM峰面积与内标物峰面积比率为纵坐标，绘制标准工作曲线(图2)。
图2 SEM标准曲线图
Fig.2 SEM standard curve
结果表明，SEM浓度越高，响应越高，回归方程为y=0.200 6x+0.055 9，R2=0.999 7，SEM浓度在0.5～100 μg/L与其峰面积比值呈良好的线性关系。该方法的检出限为0.2 μg/kg，定量限为 0.5 μg/kg(S/N≥10)，可以对SEM进行准确的定性定量分析，满足现行限量标准下的检测要求。
2.4.2 方法的准确度和精密度
为考察优化后的方法对虾体中SEM测定结果的准确性和稳定性，选择虾肉和虾壳样品进行标准添加实验，进行加标回收率和精密度的测定。根据SEM在不同组织中本底含量，其添加水平为1.0～20.0 μg/kg，每个添加水平做3个平行样品，通过回收率和精密度评价方法的准确度、重复性和适用性，结果见表5。
由表5可知，虾肉和虾壳中SEM的平均回收率为91.4%～103.6%；精密度为3.06%～6.56%。以上研究结果表明，本方法的准确度、精密度和重现性均良好，能够满足虾肉和虾壳中SEM分析的要求。
表5 样品中SEM的加标回收率和精密度
Table 5 Standard recovery and precision of
SEM in samples
组织样品加标量/(μg·kg-1)检测值回收率/%相对标准偏差/%00.93//肌肉11.8794.55.8255.5091.46.561010.5696.33.12043.14//虾壳548.32103.65.651052.6194.76.202062.8798.63.06
2.5 实际样品测定
采用本方法对市场上采集的斑节对虾、南美白对虾和罗氏沼虾3种养殖虾类，每种虾类20份样品进行检测。结果显示，斑节对虾虾肉中SEM含量为未检出～0.76 μg/kg，南美白对虾虾肉中SEM含量为未检出～0.33 μg/kg，罗氏沼虾虾肉中SEM含量为0.71～2.72 μg/kg。斑节对虾虾壳中SEM含量为3.04～15.36 μg/kg，南美白对虾虾壳中SEM含量为2.42～10.27 μg/kg，罗氏沼虾虾壳中SEM含量为26.38～64.16 μg/kg。3种虾类样品的总离子流图如图3所示，虾类样品中SEM含量高低不同，均能呈现良好的峰形图，在样品基质中杂质的干扰下仍能准确检测出SEM，从峰形、响应值可以初步判断出样品SEM含量的高低。结果表明，斑节对虾、南美白对虾和罗氏沼虾虾肉中能够检出NFZ代谢物SEM，并且虾壳中SEM含量远高于虾肉，该方法灵敏度高，准确性强，适用于虾类样品中NFZ代谢物残留的实际监测。
a-斑节对虾虾壳；b-斑节对虾虾肉；c-南美白对虾虾壳；d-南美白对虾虾肉；e-罗氏沼虾虾壳；f-罗氏沼虾虾肉
图3 虾类样品的MRM图谱
Fig.3 MRM chromatograms in shrimp
3 结论
本研究在农业部783号公告-1—2006方法基础上，根据虾类不同部位进行样品前处理优化，建立了微波辅助衍生超高效液相色谱-串联质谱法测定NFZ代谢物的检测方法。在样品提取中，采用微波波辅助衍生方法代替传统的恒温振荡法，并在此基础上探讨了微波辅助衍生的时间，发现微波温度为60 ℃衍生时间为30 min时衍生效率达到最佳。盐酸在代谢物衍生过程中具有重要作用，添加0.4 mol/L盐酸5 mL，能够保障虾壳中NFZ代谢物完全衍生。SEM在0.5～100 μg/L 线性关系良好，相对回收率为91.4%～103.6%，相对标准偏差为3.06%～6.56%，检出限为0.2 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg。该方法检测时间短，简便、可靠，准确度和精密度符合残留分析要求，能满足市场上养殖虾类中NFZ药物的检测监控要求，为相关部门的监督检测提供新的方法参考。
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