干酪中蛋白质含量为25%～35%(质量分数)，且以酪蛋白为主(约占总蛋白含量的80%)，酪蛋白根据结构主要分为4种：αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，比例为4∶1∶4∶1[1]。肽是蛋白质降解过程中暂存的中间产物，在干酪成熟期间蛋白质受到发酵剂乳酸菌自溶以及氨肽酶活性变化的影响，产生具有功能活性的小分子多肽[2]。乳源活性肽主要源自αs1-酪蛋白，其次为β-酪蛋白和αs2-酪蛋白，少部分来自κ-酪蛋白，一般由2～20个氨基酸发生缩合反应形成肽链，且分子质量<6 kDa[3]，按肽片段所含氨基酸个数可将其分为小肽(<7种氨基酸)、中等肽(7～25种氨基酸)和大肽(>25种氨基酸)。肽通常作为营养来源对机体健康产生积极影响，在调节人体心血管系统、神经系统、消化系统以及免疫系统等方面生理功效显著[4]。肽的结构特征，如肽链长度、氨基酸组成、肽的物化特征(如氨基酸残基的疏水性、分子电荷和侧链)等都会影响其生物活性功能。但目前关于干酪源生物活性肽构效关系的研究仍然较少，且按照传统方法筛选和表征干酪中蛋白质降解肽功能活性的时间较长。一些生物信息学网址、肽数据库和蛋白质结构功能分析软件等的使用极大缩短了肽功能活性预测和表征的周期。药效团模型、分子对接等生物信息学技术是针对大规模小分子进行虚拟筛选的重要途径，分子动力学模拟工具能够动态描述分子的运动状况，为分子水平解释肽与受体蛋白相互作用提供理论参考。因此本文整理了以往文献中关于干酪源生物活性肽功能活性与其所对应结构特征之间的构效关系，并就生物信息学技术在肽领域的应用做了阐述，以期为干酪源生物活性肽的筛选、功能活性预测、表征和深度开发利用提供理论依据。
1 干酪源多肽的产生
干酪是需要经过发酵成熟的乳制品，在干酪发酵成熟过程中蛋白质发生降解，干酪pH、盐含量、成熟条件、发酵剂等均影响蛋白质降解[5]。蛋白质降解可分为两步：(1)凝乳酶以及原乳中蛋白酶(纤溶酶和组织蛋白酶)降解乳中的αs-酪蛋白、β-酪蛋白，产生水不溶性大肽和水溶性肽[6]；(2)大肽和中等肽受细胞外、细胞包膜相关蛋白酶和发酵剂、附属发酵剂蛋白酶降解形成小肽，细胞包膜裂解后释放肽酶，肽酶促使小肽的降解和游离氨基酸的生成[7](图1)。不同蛋白酶(不同切割位点)作用于不同类型的酪蛋白(不同水解方式)会产生多条不同氨基酸序列的肽段，肽的功能活性与肽的一级结构(肽链长短、氨基酸序列和组成、二硫键位置和数目)密切相关，因此不同干酪中蛋白质降解产生的生物活性肽具有丰富的种类和功能，尤其在促进人体健康、维持生理功能等方面具有重要作用[8]。
图1 酪蛋白的降解途径
Fig.1 The degradation pathway of casein
2 干酪源肽的功能活性及其结构特征
许多研究表明，活性肽段在蛋白质氨基酸序列中以无活性状态存在，但可通过酶解或微生物发酵等方式被释放出来，发挥生物活性功能[9]。干酪蛋白质来源、蛋白质预处理方式(例如超声和脉冲电场处理等)、肽酶的类型和水解条件等因素均会改变蛋白质水解产物的结构、功效以及所产生肽的类型[10]，表1为部分干酪水溶性提取物(water-soluble extracts, WSE)的功能活性及其所对应特征肽段的氨基酸序列。
表1 部分干酪水溶性提取物的功能活性
Table 1 Functional activity of some cheese
water-soluble extracts
干酪类型分析样品功能活性肽段序列参考文献布里干酪(Brie)WSEACE抑制活性VPP、IPP、RYLGY等[11]切达干酪(Cheddar)WSEACE抑制活性VPP、IPP、LHLPLP、RYLGY、AYFYPEL等[11][12][13][14]抗氧化活性抗菌活性高达干酪(Gouda)WSEACE抑制活性VPP、IPP[11]抗菌活性[14]埃门塔尔干酪(Emmental)WSEACE抑制活性VPP、IPP[11]莫扎里拉干酪(Mozzarella)WSE抗菌活性[14]菲达干酪(Feta)WSE抗氧化活性[15]洛克福干酪(Roquefort-type)羊乳干酪(Pecorino-type)
注：ACE为血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme)
2.1 ACE抑制活性与结构之间的关系
ACE含有维持活性的Zn2+和Cl-，是肾素-血管紧张素和激肽-激肽释放酶2个体系的关键性酶[16]。ACE抑制肽一方面是指抑制ACE将血管紧张素Ⅰ向血管紧张素Ⅱ(可使血压升高)转换，另一方面是指抑制ACE对舒缓激肽的破坏作用，从而达到降血压目的[17]。2000—2016年，人们相继在Gouda干酪[18]、双歧杆菌发酵制得的低脂肪Festivo干酪[19]、生牛乳制作的white-brined干酪[20]、市售的Cheddar干酪[21]和墨西哥Cotija干酪[22]中发现了降血压肽。SAITO等[18]在检测的众多干酪(8-mo-aged 24-mo-aged Gouda, Emmental, Blue, Camembert, Edam, Havarti)中发现8个月龄的Gouda干酪肽段显示出对收缩压的最强抑制作用(-24.7 mm Hg)和对血管紧张素I转化酶的强烈抑制活性(75.7%)。RYHANEN等[19]也观察到同样的现象，Festivo干酪中肽的ACE抑制活性随着干酪成熟时间和蛋白水解程度的变化而变化。STEPHANIE等[12]对3种澳大利亚市售Cheddar干酪的肽提取物进行研究以后发现不同分子质量肽组分的IC50存在差异，与分子质量>10 kDa和分子质量>5 kDa的组分相比较，分子质量<5 kDa的肽组分具有更高的ACE抑制率。就肽的氨基酸链长短而言，ACE抑制肽一般含有2～12个氨基酸残基[23]。大多数研究表明降血压肽具有典型的N端和C端氨基酸残基(例如N端含有甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸，C端含有脯氨酸、酪氨酸和色氨酸)，这种结构有助于肽和ACE结合，而亮氨酸可以提高ACE抑制效果，从而起到更好的降压作用[24]。此外，肽的疏水性也会对其ACE抑制活性产生重要影响，如果肽的亲水性过高，则会使得ACE抑制肽无法接近ACE活性部位，从而导致其活性较弱或无活性。SOLEYMANZADEH等[25]鉴定出具有ACE抑制作用的肽MYDYPQR(MR7)，研究发现该肽含有4个疏水性氨基酸、2个极性氨基酸和1个带电氨基酸，肽的疏水性达57.14%，显示出适度的疏水性，由于肽与ACE活性位点的结合与疏水性氨基酸有着本质关系，造成MR7具有高的ACE抑制活性(0.002 3～0.027 g/L)。但ACE抑制肽的抑制能力显然不能单纯用肽链长短、肽的分子质量大小和氨基酸组成等来解释，ACE抑制肽的一级结构不同，其空间构象也会有差别，这会影响肽与ACE活性位点的结合，进而影响其ACE抑制能力，因此ACE抑制肽的立体构象与其抑制能力的关系有待进一步研究。
2.2 抗氧化活性与结构之间的关系
抗氧化肽一般由5～16个氨基酸残基组成，研究发现食源性抗氧化肽具有减缓人体衰老、降低人体癌症患病率的功能，同时具有安全性强、水溶性好、致敏性低等优点[26]。肽的抗氧化性主要与其组成、结构和疏水性有关，王波[27]利用Caco-2细胞模型研究了肽组分的分子质量大小、电荷性、疏水性对肽在小肠上皮细胞吸收转运以及生物利用度的影响，发现当肽组分分子质量<1kDa、带有负电荷且是弱疏水性时，其吸收率和抗氧化性保留率值高，而且生物利用度显著。相关研究已经表明在意大利Stracchino软质干酪[28]、新鲜山羊乳干酪[29]和Cheddar干酪[12-13]中发现了具有抗氧化作用的生物活性肽，Stracchino软质干酪经胃肠系统消化后，六肽(例如EAMAPK和AVPYPQ)含量高，抗氧化活性强，水牛乳和普通牛乳Cheddar干酪中提取的多肽均对结肠癌细胞产生的自由基具有抑制作用。大部分抗氧化肽在N端包含疏水性氨基酸如缬氨酸或亮氨酸，并且序列中含有脯氨酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等氨基酸[30]，有研究者认为疏水性氨基酸的数量也会影响肽的功能活性，比如MENDIS等[31]研究发现当抗氧化肽中含有2个苯丙氨酸和其残基时，该肽具有更高的抗氧化活性；同时还有研究表明，当抗氧化肽中含有芳香族氨基酸、酸性氨基酸以及碱性氨基酸时，抗氧化肽的活性会相应增强[32]，比如在带有芳香族氨基酸色氨酸的环状抗氧化肽中，由于色氨酸具有提供活性氢供体的能力，所以该抗氧化肽的活性较大[33]。此外，肽的分子质量大小也是影响肽抗氧化活性的重要因素之一，TIMON等[34]的研究指出不同凝乳酶干酪中分子质量<3 kDa的多肽都具有抗氧化作用，且主要源自αs1-酪蛋白。影响干酪源抗氧化肽抗氧化活性强弱的因素是多样的，干酪中的抗氧化肽除了经人体消化产生外，主要源自干酪成熟过程中的蛋白质降解。分离、鉴定干酪中的抗氧化肽，探索干酪源抗氧化肽的形成机理和构效关系，对开发抗氧化肽含量高和抗氧化活性强的干酪产品具有积极作用。
2.3 抗菌活性与结构之间的关系
抗菌肽是由生物体产生的一种小分子阳离子型活性肽，来源广泛，而且相对分子质量较小，具有生物活性功能的多肽长度大多集中在21～30氨基酸[35]。自1974年HILL等[36]用凝乳酶水解牛乳αs1-酪蛋白得到了第一个抗菌肽(Isracidine)以来，众多学者相继用胰蛋白酶酶解牛乳酪蛋白得到抗菌肽Casocidin-I和Trip等，用胃蛋白酶酶解牛乳酪蛋白得到抗菌肽(Cp1)(对应于αs1-酪蛋白99～109位残基)和抗菌肽(Cp2)(对应于αs2-酪蛋白183～207位残基)。BARZYK等[37]、SEDAGHATI等[38]研究发现肽的疏水性对抗菌活性有影响，抗菌肽的N末端富含亲水性氨基酸残基，如赖氨酸、精氨酸等，C末端富含疏水性氨基酸残基，如丙氨酸、甘氨酸，且通常被酰胺化，这是抗菌肽具有抗菌活性的关键因素之一[26]。此外，抗菌肽结构的稳定性受肽链长度的影响，从而抑菌活性也受到肽链长度的影响。PHAMBU等[39]通过傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)、扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)、热重分析(thermogravimetric analysis, TGA)及差示扫描量热法(differential scanning calorimetry, DSC)研究表明理想的肽链长度(含有6个氨基酸残基的肽)可以增加分子内氢键作用，从而保持肽链的稳定性，进而与阴离子的脂质更好结合，发挥更强的抑菌作用。THÉOLIER等[14]研究了加拿大5种市售干酪(Mozzarella, Gouda, Swiss, old Cheddar，medium Cheddar)脱盐纯化的水溶性提取物后发现，只有Mozzarella和Gouda干酪的水溶性提取物对Listeria ivanovii HPB28和大肠杆菌MC4100有明显的抗菌作用。FONTENELE等[40]研究了Coalho干酪酪蛋白衍生肽的生物活性后发现，β-酪蛋白肽(193～209)具有免疫调节、抗微生物和降压活性，β-酪蛋白(58～72)，β-酪蛋白(193～202)，αs1-酪蛋白(85～91)，αs1-酪蛋白(1～9)以及αs2-酪蛋白(189～197)是具有降压活性的肽片段，αs1-酪蛋白(1～23)是一种具有免疫调节活性和抗菌活性的肽片段，这些结果被确定为巴西干酪的权威性标志。FIALHO等[41]借助MALDI-TOF/TOF、MASCOT Daemon与UniProt数据库结合对3种市售Minas干酪中提取的可溶性肽进行测序和鉴定，发现起源于αs1-酪蛋白的肽序列PKHPIKHQ、RPKHPIKHQG、RPKHPIKHQGLPQ和RPKHPIKHQGLPQE是属于Isracidine的片段，另外发现了2种β-酪蛋白衍生的新抗菌肽序列HQPHQPLPPT和MHQPHQPLPPT，但它们的生物学活性仍然未知。抗菌肽的抗菌活性很大程度取决于肽的结构特征(尤其是二级结构)，目前对不同酪蛋白来源干酪抗菌肽抗菌活性的研究比较多，但局限于一级结构且其构效关系并不十分清楚，结构生物学和生物信息学的发展为干酪源抗菌肽立体构象和抗菌活性关系的研究提供了技术支持。
3 生物信息学技术在肽领域的应用
肽的化学结构信息与其生物活性密切相关，多肽的氨基酸组成和序列信息对其生物活性具有重要影响[42]。随着生物活性肽构效关系的深入研究，许多乳源蛋白质的一级结构和活性肽氨基酸序列得到阐明，但随机选择肽段研究其生物学活性和分子机制又具有盲目性。基于影响肽功能活性的结构特征和理化因素，可以借助一些生物信息学网址提供的软件和药效团模型等对大量肽片段进行虚拟筛选，利用分子对接和分子动力学模拟等生物信息学技术研究活性肽与受体蛋白之间相互作用的动态变化功过程和分子机制。表2为蛋白质降解肽理化分析时常用的生物信息学网址。
表2 肽功能活性研究时常用的在线生物信息学工具
Table 2 Online bioinformatics tools commonly used in peptide functional activity research
类别名称网址功能蛋白质数据库NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov提供蛋白质氨基酸序列PDBhttps://www.rcsb.org提供蛋白质三维结构活性肽数据库BIOPEPhttp://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep肽段氨基酸序列比对(目前最全面的生物活性肽数据库)[43]肽特性计算器Peptide Calculatorhttps://pepcalc.com计算肽的理论分子量、等电点和净电荷[25]ExPASy ProtParamhttps://web.expasy.org/protparam/计算肽的不稳定性指数[25]PEPTIDE 2.0https://www.peptide2.com计算肽的疏水性氨基酸比例[25]HeliQuesthttps://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ComputParams.py计算肽的疏水性指数和疏水力矩[44]PeptideRankerhttp://bioware.ucd.ie/～compass/biowareweb/预测肽的潜在生物学活性[45]Innovagenhttp://www.innovagen.com/proteomics-tools预测肽的溶解度[45]SOPMAhttps://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html预测肽的二级结构[46]admetSARhttp://lmmd.ecust.edu.cn/admetsar1/predict/?smiles=RPKHPIK&action=A计算肽的ADMET性质(包括人体肠道吸收能力、血脑屏障穿透能力、急性口服毒性等)[45]
Discovery Studio(DS)，集成了蛋白质表征、同源建模、分子力学计算和分子动力学模拟、基于结构药物设计、基于小分子的药物设计(定量构效关系、药效团模型等)等模块，主要用于蛋白质结构功能研究和药物设计，是一款较好的蛋白结构分析软件[47]。SOLEYMANZADEH等[25]用在线工具(Peptide Calculator、ExPASy ProtParam和PEPTIDE 2.0)对从骆驼乳中鉴定出的肽段MR7进行理化分析，然后用DS软件中的分子对接程序研究了MR7与ACE之间的相互作用，结果表明MR7的C末端精氨酸对MR7与ACE的相互作用有实质性影响，精氨酸与ACE活性位点的氨基酸残基形成氢键，导致ACE的四面体几何结构发生畸变，ACE失活。于志鹏等[45]借助在线数据库，以鸡蛋蛋白为原料，进行虚拟酶解，对活性肽分子质量、生物活性、水溶性及其吸收、分配、代谢、排泄和毒性等(ADMET)性质进行预测，并结合分子对接筛选出与ACE稳定结合的3 种ACE抑制肽。MIRZAEI等[48]将从马克思克鲁维酵母蛋白水解液中鉴定出的2种新肽VLSTSFPPK(VL9)和LPESVHLDK(LL9)与ACE进行分子对接，研究结果表明VL9的ACE抑制活性是由于与ACE的S2(His513，His353，Glu281)和
口袋相互作用而引起的，LL9可以完全嵌入ACE的S1(Thr345)和S2(Tyr520，Lys511，Gln281)口袋中。吕自力等[49]利用抗菌肽数据库和生物信息学分析工具，基于抗菌肽结构和功能的关系，设计了LFcin B衍生肽LFcin B-W4, 10，验证试验结果表明抗菌肽LFcin B-W4, 10对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌活性，诱导表达96 h时其抑菌圈直径最大。生物信息学技术在综合分析肽理化性质和空间结构的前提下，探究肽氨基酸残基改变对其功能活性的影响，为获得高活性衍生肽奠定了基础。
4 总结和展望
综上研究表明，干酪源生物活性肽的功能活性与肽段的分子质量大小、肽链长短、氨基酸序列及组成和疏水性等结构特征密切相关。近年来乳源生物活性肽在理论研究上表现突出，新序列的干酪源多肽不断被发现，但由于种种原因并未真正应用到实际产品的生产加工过程中，且大部分活性肽的功能活性研究仍然局限于一级结构和体外模型，体内研究相对较少。因此，采用红外光谱、核磁共振氢谱及圆二色谱等多种相关技术鉴定干酪源活性肽的二级结构，对构效关系进行更深入的体外研究，借助蛋白数据库、肽数据库和分子对接软件等生物信息学方法和技术，从分子水平揭示不同生物活性功能肽段与受体蛋白之间相互作用的分子机制，将理论模拟与实验过程有机结合，进一步探究干酪源生物活性肽的酶切位点和作用机理，通过动物实验提高干酪源生物活性肽在机体内的靶向性和稳定性，这对确保其成功的作为功效因子开发制备功能食品，以此来改善人体健康具有重要意义。
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