肾脏疾病的发病与不良的饮食习惯密切相关，尤其是某些高蛋白食品的过量摄入，给肾脏的滤过功能造成了沉重的负担[1]。但是对于健身爱好者和一些大病初愈的人群而言，为了达到增长肌肉和体力恢复的效果，高蛋白饮食必不可少。但是过量的补充蛋白质可能会增加机体罹患疾病的风险。因此，是否存在营养价值高且对机体肾功能损伤程度小的蛋白产品还值得我们进一步去发现。
火麻仁是桑科植物大麻的种子，又称汉麻、线麻，是我国历史悠久的药用和食用物质[2]。火麻仁中营养物质含量丰富，蛋白质含量高达35.9%，不含抗营养因子[3]，易消化且含有理想的必需氨基酸成分，因此火麻仁蛋白是一种优质的植物蛋白来源[4]。对火麻仁蛋白进行氨基酸组成分析发现，精氨酸和谷氨酰胺含量丰富，其中精氨酸含量高达12%[5]，此外还含有很高的支链氨基酸[6]。火麻仁蛋白的特殊氨基酸组成赋予了它特殊的生理功能。研究表明，火麻仁蛋白具有抗疲劳[7]、提高运动员的营养指标[8]、增强免疫力[9]、抗氧化等生理功能。而火麻仁肽是以火麻仁蛋白为原料，通过酶解制备的生物活性肽，相比于蛋白质而言，生物活性肽的吸收能耗低、不易饱和，且转运过程中无竞争性和抑制性[10]，因此其营养价值相比于蛋白质明显提高。
因此，本文以火麻仁蛋白和火麻仁肽为研究原料，以正常小鼠和环磷酰胺诱导的免疫力低下小鼠为实验对象，探究高剂量摄入火麻仁蛋白和火麻仁肽对正常小鼠和免疫力低下小鼠肾功能的影响。以期为将来相关食品和保健品的开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
健康雄性6～8周雄性小鼠[许可证：SCXK(京)2016-0006]，北京维通利华实验动物技术有限公司；环磷酰胺，江苏盛迪医药有限公司；火麻仁蛋白和火麻仁肽，实验室自制；总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-PX)测定试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒、肌酐(creatinine,CRE)检测试剂盒、尿酸(uric acid,UA)检测测试盒、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)检测试剂盒，南京建成生物技术有限公司；小鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)、免疫球蛋白 M(immunoglobulin M，IgM)酶联免疫检测试剂盒，北京百智生物科技有限公司。
Spectra MR多功能酶标仪，美国Dynex公司；721型紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；动物麻醉机，北京众实迪创科技发展有限责任公司。
1.2 实验方法
1.2.1 火麻仁蛋白和火麻仁肽的制备工艺
火麻仁蛋白和火麻仁肽的制备工艺如下：
火麻仁籽→80～100 ℃冷榨→超临界萃取→火麻仁粕→粉碎、过筛→碱溶酸沉→火麻仁蛋白；
火麻仁蛋白→1∶10调浆→调温度至55 ℃、调pH=5→1.5%酸性蛋白酶，30 min→1%中性蛋白酶、1%木瓜蛋白酶，3.5 h→灭酶→吸附、过滤、浓缩→冷冻干燥→火麻仁肽
1.2.2 火麻仁蛋白和火麻仁肽的基础理化性质测定
参考GB 5009对水分[11]、灰分[12]、脂肪[13]、蛋白[14]含量进行测定；采用氨基酸分析仪测定火麻仁肽中游离氨基酸含量；采用凝胶色谱法测定火麻仁肽的分子质量分布[15]。
1.2.3 动物饲养分组与模型建立
36只健康雄性昆明小鼠，体重(40±2) g，饲养于20 ℃、通风良好的环境中。适应性喂养1周后，将小鼠随机分为空白组(CM)、免疫力低下组(MG)、正常小鼠灌胃高剂量火麻仁蛋白组(CM+Prot)、正常小鼠灌胃高剂量火麻仁肽组(CM+Pept)、免疫力低下小鼠灌胃高剂量火麻仁蛋白组(MG+Prot)、免疫力低下小鼠灌胃火麻仁肽组(MG+Pept)，一共6个组，每组6只，蛋白和肽均按照10 g/kg体重(每日蛋白摄入量相当于运动员的摄入水平)的剂量进行灌胃，每天上午9～10时进行灌胃，持续30 d，空白组和免疫力低下组用等量的生理盐水代替，每周进行体重记录。在灌胃的第27天开始，连续3 d按照60 mg/kg的剂量对小鼠进行腹腔注射环磷酰胺诱导小鼠产生免疫力低下，正常小鼠除外。最后1次灌胃后，小鼠断食不断水12 h后，处死小鼠。
1.2.4 脏器指数测定
小鼠处死后，解剖取其脾脏和肾脏，称其质量，按照公式(1)计算脏器指数：脏器指数
(1)
式中：m1，脏器质量，mg；m2，小鼠体重，g。
1.2.5 小鼠血清UA、CRE和BUN含量的测定
小鼠麻醉后，眼角采血，分离血清，按照试剂盒的要求检测血清中UA、CRE和BUN的含量。
1.2.6 小鼠血清中IgG和IgM含量的测定
按照试剂盒要求用酶联免疫吸附测定法检测血清中IgG和IgM含量。
1.2.7 小鼠肾脏抗氧化能力的测定
小鼠处死后，解剖取其肾脏，于冰上进行匀浆，3 500 r/min离心10 min，测定上清液中SOD和GSH-PX活力以及MDA含量。
1.2.8 小鼠肾脏HE染色
小鼠处死后，解剖取其肾脏，切小块置于组织固定液中，充分固定后，对其进行修剪和脱水，经浸蜡、包埋、切片、展片、烤片、脱蜡、至水后，用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)进行染色，染色后进行脱水、透明和封片处理，最后用光学显微镜对肾组织病理学变化进行观察，并使用显微镜数码相机进行拍照。
1.3 数据分析
所有数据用X±SD表示，使用Origin 94进行统计学分析并作图。单因素方差分析进行组间比较，t检验进行两两比较，P<0.05表示具有显著差异性，P<0.01表示具有极显著差异性。
2 结果与分析
2.1 火麻仁蛋白和火麻仁肽的基础理化性质
表1为火麻仁蛋白和火麻仁肽的基础理化性质，火麻仁蛋白中蛋白质含量为79.54%，灰分含量为10.52%，可见，本实验室所制备的火麻仁蛋白中杂质含量较少，蛋白质含量丰富。通过酶解法制备的火麻仁肽中蛋白质含量高达82.84%，游离氨基酸含量为7.404%，肽含量为75.44%。通过凝胶色谱法对火麻仁肽的相对分子质量分布进行分析，结果如表2所示，火麻仁肽的分子质量分布主要在150～1 000 u，重均分子量为503.7 u，在这个范围内的肽主要是由2～6个氨基酸组成的小肽组成。
表1 火麻仁蛋白和火麻仁肽的基础理化性质 单位：%
Table 1 Basic physicochemical properties of hemp seed
protein and hemp seed peptide
项目水分灰分酸溶蛋白脂肪游离氨基酸肽含量火麻仁蛋白5.33010.5279.540.450 0--火麻仁肽 3.2700.096 0082.84-7.40375.44
注：-表示未检测
表2 火麻仁肽的分子质量分布
Table 2 Molecular weight distribution of hemp seed peptide
相对分子质量分布/u分布面积百分比/%10 000以上0.026 705 000～10 0000.127 13 000～5 0000.448 32 000～3 0000.984 41 000～2 0007.012150～1 00086.34150以下5.070重均分子量503.7
2.2 火麻仁蛋白和火麻仁肽对小鼠体重和脏器指数的影响
图1为小鼠体重变化，随着灌胃时间的增加，小鼠体重逐渐上升。环磷酰胺会引起小鼠体重的下降，火麻仁蛋白和火麻仁肽能够在一定程度上防止体重的降低。表3为小鼠脾脏指数和肾脏指数的变化，可以看出高剂量的火麻仁蛋白和火麻仁肽对正常小鼠脾脏指数和肾脏指数无显著的影响。环磷酰胺诱导后的小鼠，脾脏指数显著降低(P<0.05)，肾脏指数显著升高(P<0.05)，高剂量摄入火麻仁蛋白和火麻仁肽对环磷酰胺诱导后的小鼠的脾脏指数无显著影响，但是能显著降低小鼠的肾脏指数。
图1 小鼠体重变化(n=6)
Fig.1 The weight change of mice (n=6)
表3 火麻仁蛋白和火麻仁肽对小鼠脏器指数的影响(n=6)
Table 3 Effects of hemp seed protein and hemp seed peptide on
viscera index in mice (n=6)
组别脾脏指数肾脏指数CM2.171±0.155 0a14.22±0.504 0bCM+Prot1.981±0.108 0ab13.56±0.598 0bCM+Pept2.175±0.780 0a14.52±0.393 0abMG1.476±0.700 0b17.15±0.276 0aMG+Prot1.560±0.156 0b13.55±0.941 0bMG+Pept1.509±0.091 00b14.03±0.609 0b
注：不同小写字母之间代表具有显著差异(P<0.05)
2.3 火麻仁蛋白和火麻仁肽对小鼠血清UA、CRE和BUN含量的影响
图2为小鼠血清中UA、CRE和BUN含量的变化。正常小鼠血清中UA、CRE和BUN含量与空白组相比没有发生显著的变化。与空白组小鼠相比，小鼠受到环磷酰胺的诱导后，血清中UA、CRE以及BUN含量显著升高(P<0.05)，表明肾功能发生损伤，高剂量的火麻仁蛋白并不会增加免疫力低下小鼠的肾负担，而且高剂量的火麻仁蛋白和火麻仁肽均显著降低免疫力低下小鼠血清中UA、CRE和BUN的含量(P<0.05)，且与空白组无显著差异。相比于火麻仁蛋白，火麻仁肽所呈现的效果更强。
a-血清UA含量；b-血清CRE含量；c-血清BUN含量
图2 小鼠血清UA、CRE和BUN含量变化(n=6)
Fig.2 Changes of UA, CRE and BUN in serum of mice (n=6)
注：不同小写字母之间代表具有显著差异(P<0.05)(下同)
2.4 火麻仁蛋白和火麻仁肽对小鼠血清IgG和IgM含量的影响
图3为小鼠血清中IgG和IgM含量的变化。从结果中可以看出，小鼠经环磷酰胺诱导后，血清中IgG和IgM含量显著降低(P<0.05)，说明环磷酰胺导致小鼠免疫力降低。对于正常小鼠，高剂量摄入火麻仁蛋白或火麻仁肽对小鼠血清中IgG和IgM含量无显著的影响。对免疫力低下的小鼠而言，高剂量的火麻仁蛋白和火麻仁肽使得小鼠血清中IgG含量分别增加2.032、2.03 mg/mL。因此高剂量摄入火麻仁蛋白或火麻仁肽对正常小鼠和免疫力低下小鼠的免疫系统功能均不会产生负担。
2.5 火麻仁蛋白和火麻仁肽对小鼠肾脏SOD和GSH-PX活力、MDA含量的影响
如图4所示，小鼠经环磷酰胺诱导后，肾脏中SOD和GSH-PX活力显著下降(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)。对于正常小鼠而言，火麻仁蛋白和火麻仁肽均能在一定程度上提高小鼠肾脏的抗氧化酶SOD和GSH-PX的活力，且灌胃火麻仁肽的小鼠抗氧化酶活力更强，但是对于MDA含量来说，火麻仁蛋白效果更好。对于免疫力低下的小鼠而言，高剂量的火麻仁肽能够显著提高小鼠肾脏中抗氧化酶SOD和GSH-PX活力(P<0.05)，且使得小鼠肾脏中MDA含量显著降低(P<0.05)，火麻仁蛋白也具有较强的抗氧化作用，但是效果弱于火麻仁肽。
a-血清IgG含量；b-血清IgM含量
图3 小鼠血清中IgG和IgM含量的变化(n=6)
Fig.3 Changes of IgG and IgM in serum of mice (n=6)
2.6 火麻仁蛋白和火麻仁肽对小鼠肾脏组织病理学形态影响
为了能更直观的探究火麻仁蛋白和火麻仁肽对小鼠肾功能的影响，对小鼠肾脏进行了HE染色，观察其病理学变化，结果如图5所示，空白组小鼠肾组织结构正常，肾小管排列整齐，肾小球大小和形状正常，无炎性细胞浸润。经环磷酰胺诱导后的小鼠肾脏中细胞核数量明显增多，炎性细胞浸润明显，肾小球体积增大，肾小囊囊腔扩张，肾间质中局部出现纤维化，肾功能受到一定程度的损害。对于正常小鼠而言，连续30 d灌胃高剂量的火麻仁蛋白和火麻仁肽后小鼠的肾脏没有出现损伤现象，肾小球大小正常，无炎性细胞浸润现象。对于免疫力低下小鼠，经灌胃火麻仁蛋白和火麻仁肽后的小鼠肾脏损伤程度明显减轻，尤其是灌胃火麻仁肽的小鼠，细胞核数量明显减少，炎性细胞浸润现象减轻，肾小球体积减小，肾小囊囊腔扩张现象减轻，肾间质纤维化消失。由此可见，分别摄入高剂量的火麻仁蛋白和火麻仁肽均不会对小鼠肾脏造成损害，并具有一定程度的保护肾功能的作用。
a-小鼠肾SOD活力；b-小鼠肾GSH-PX活力；c-小鼠肾MDA含量
图4 小鼠肾脏SOD、GSH-PX活力和MDA含量的变化(n=6)
Fig.4 Changes of the SOD and GSH-PX activity and the content of MDA in kidney of mice (n=6)
图5 小鼠肾脏HE染色结果
Fig.5 Results of HE staining of mice kidney
3 结论与讨论
高蛋白饮食在健身爱好者、肥胖患者以及糖尿病患者中非常流行。研究表明，高蛋白饮食能够帮助肥胖者减轻体重[16]，也可以帮助Ⅱ型糖尿病患者控制血糖[17]，更能帮助运动人群增长肌肉[18]。大量进食蛋白质会增加肾小球过滤和肾血流量，从而增加肾代谢负担。但是不同来源的蛋白质对肾脏产生的影响不同，动物性蛋白对肾脏血流动力学的影响最为明显，其次是乳蛋白，最后是植物源蛋白[19]。
火麻仁蛋白中含有人体必需的8种氨基酸，氨基酸组成合理，效价均衡，被称为优质完全蛋白[20]。而火麻仁肽作为小分子生物活性肽，具有更强的生物活性。但是它们对机体肾功能的影响目前还不明确，因此，探究它们对肾功能的影响对进一步发掘其商业价值至关重要。
环磷酰胺是临床上常用的一种烷化抗肿瘤药，具有良好的抗肿瘤效果，但是常伴有免疫抑制、器官损伤，如肾脏、睾丸等损伤等副作用[21-22]。本实验结果显示，小鼠经环磷酰胺诱导后，小鼠脾脏指数、血清中IgG和IgM含量明显降低，说明小鼠免疫功能受到抑制。研究表明，肾损伤模型中的小鼠体内激素分泌紊乱，导致肾脏的损伤和肿大[23]。结果显示，环磷酰胺诱导后，小鼠肾脏指数增大，且HE染色结果显示，小鼠肾小球体积增大，肾小囊囊腔扩张，体现在生化指标上时，血清中UA、BUN和CRE含量显著上升，肾脏中抗氧化酶SOD和GSH-PX活力降低，MDA含量上升，因此，经环磷酰胺诱导后的小鼠免疫功能和肾功能均受到一定程度的损伤。
UA是体内嘌呤代谢的产物，血清中UN水平过高会导致尿酸盐离子在肾脏的堆积、肾促炎因子的释放以及增加氧化应激，从而引起肾损伤[24]。CRE是人体肌肉代谢的产物，BUN是蛋白质代谢的终产物，二者均是通过肾小球过滤排出体外[25]，二者在血液中的水平与肾功能水平具有密切联系。本实验结果显示，高剂量摄入火麻仁蛋白和火麻仁肽均不会引起小鼠血液中UA、CRE和BUN水平发生显著的变化，肾脏HE染色结果也显示出二者对肾小球结构没有明显的影响。对于免疫力低下的小鼠，相对于火麻仁蛋白，高剂量摄入火麻仁肽对减缓环磷酰胺引起的肾脏损害效果更为显著。这可能是因为相对于蛋白质，小肽具有更强的生理活性和营养价值，而且生物活性肽在机体中能够起到载体作用，帮助将所食用的营养物质更快速的转运到各种细胞、组织和器官[26]，从而增强了器官的生理机能。
氧化应激在各种肾病的发展中起着关键的作用，是导致慢性肾衰竭[27]、急性肾损伤等[28]的主要致病因素之一，因此降低机体的氧化应激状态，对预防肾病的发生具有重要意义。实验结果显示，分别摄入高剂量火麻仁蛋白和火麻仁肽对正常小鼠和免疫力低下小鼠的肾脏抗氧化能力均能起到增强作用，且相比于蛋白，肽的抗氧化能力更强。本实验所用的火麻仁肽重均分子量为503.7 u，主要由2～6个氨基酸组成的小肽组成，研究表明，小分子肽段与自由基反应时具有更小的空间位阻，因此表现出更强的抗氧化活性[29]。
综上所述，火麻仁蛋白和火麻仁肽是优质的蛋白来源，高剂量摄入既不会对正常机体的肾功能造成损害，也不会对免疫力低下机体的肾功能造成损害，而且二者具有一定的肾功能保护和抗氧化作用。
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