肠道菌群是人体肠道中微生物的总称，人体肠道内微生物种类有1 000多种，是人体细胞的10倍左右[1]。近年来，高通量测序技术的出现以及生物信息学分析工具的发展，促进了对肠道菌群的研究，其中16S rRNA高通量测序以及宏基因组学已经被广泛地应用于肠道微生物多样性研究[2]。正常情况下，肠道菌群处于动态平衡状态，在促进食物消化，维持肠道健康，调节免疫等方面发挥着重要作用[3]。肠道菌群失调会引起腹泻、便秘等多种胃肠道疾病[4]。大量研究表明，肠道菌群紊乱与人体的各种慢性疾病如糖尿病、高血压、肥胖、抑郁症、动脉粥样硬化[5-8]等有着密切的联系。
近年来，使用各种益生元调节肠道菌群生长代谢的研究日益增多。然而，目前研究的益生元大多是不容易消化的低聚糖类，多肽作为益生元改善肠道菌群的潜力尚未得到充分的研究[9]。多肽是由2个至数百个氨基酸通过肽键连接而成的一种分子聚合物，具有特殊的生物活性[10]，多肽类物质一直是功能性食品领域的研究热点。牦牛骨是牦牛肉加工的主要副产品，富含蛋白质和矿物质等多种营养物质[11]。牦牛骨中含有丰富的胶原蛋白，其酶解产物具有很多潜在的生物活性[12]。GAO等[13]研究表明，牦牛骨胶原蛋白肽水解物对BALB/c小鼠具有良好的免疫调节作用，可防止因衰老或抑制剂引起的免疫抑制反应。目前，牦牛骨胶原蛋白肽对肠道菌群作用的研究还未见报道。
本文选用了1种酶解法制备的牦牛骨胶原蛋白肽粉，通过体外模拟胃肠消化及小鼠粪便菌群的厌氧发酵，探究牦牛骨胶原蛋白肽对肠道菌群的调节作用。发酵过程中检测pH，乳酸，短链脂肪酸含量的变化，并利用16S rRNA高通量测序的方法分析消化后的牦牛骨胶原蛋白肽对小鼠粪便菌群组成的影响，本研究可为牦牛骨胶原蛋白肽作为功能性食品的开发提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牦牛骨胶原蛋白肽粉，安徽国肽生物科技有限公司；胃蛋白酶、胰液，美国Sigma公司；胰蛋白胨、酵母提取物，英国OXOID公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
高速冷冻离心机，美国Thermo Fisher Scientific公司；UV-3200型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；EX224ZH/AD电子天平，奥豪斯仪器(常州)有限公司；Five Easy Plus pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；MLS-3750型全自动高压蒸汽灭菌锅，日本SANYO公司；HH-2数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；气相色谱仪，日本岛津公司。
1.3 实验方法
1.3.1 体外模拟胃肠消化
模拟胃肠道消化参照YU等[14]的方法并稍作修改。
(1)模拟胃消化：配制30 g/L牦牛骨胶原蛋白肽溶解液。使用1 mol/L 的HCl调节溶液pH至2.0，加入适量胃蛋白酶(酶∶底物=1∶50)，37 ℃水浴摇床，100 r/min振荡1 h，模拟胃消化。
(2)模拟肠消化：将模拟胃消化后的溶液使用1 mol/L的NaOH调pH至5.0，使胃蛋白酶失活。加入适量胰液(酶∶底物=1∶25)和牛胆盐(牛胆盐∶底物=1∶35)，搅拌均匀后，用1 mol/L的NaOH调节pH至7.0～8.0，容器上方充氮气，盖紧瓶塞后放入37 ℃水浴锅中，100 r/min振荡反应2 h，模拟肠道消化，最后沸水加热10 min结束酶反应，放入-80 ℃冷冻4 h后放入真空冷冻干燥仪中冷冻干燥[15]。
1.3.2 体外模拟发酵
(1)发酵培养基的配制[16]：胰蛋白胨2 g、酵母浸粉2 g、NaCl 0.1 g、K2HPO4 0.04 g、KH2PO4 0.04 g、MgSO4·7H2O 0.01 g、CaCl2 0.01 g、NaHCO3 2 g、吐温80 2 mL、半胱氨酸盐酸盐0.5 g、牛胆酸盐0.5 g、氯化血红素0.02 g、维生素K1 10 μL、刃天青0.001 g、乳果糖10 g、蒸馏水1 L。溶液配好后调pH 至7.0，经高压蒸汽灭菌(121 ℃，20 min，其中乳果糖和牦牛骨胶原蛋白肽分别单独灭菌)后转移到厌氧工作站除氧24 h。
(2)粪便采集：于发酵实验当天早上采集10周龄小鼠粪便，要求所有小鼠肠胃健康，近半年来没有食用过抗生素。在厌氧工作站中用磷酸盐缓冲液(pH=6.8)按 1∶10(g∶mL)稀释混匀[17]。
(3)发酵过程：向每个培养基中加入粪便稀释液，接种量为1%。将消化后的牦牛骨胶原蛋白肽，分别按不同的添加剂量，设置为3种实验组，分别为低剂量组：5 g/L；中剂量组：10 g/L；高剂量组：20 g/L。同时以不添加消化后的牦牛骨胶原蛋白肽的发酵作为空白对照组，每组做3个平行，在37 ℃厌氧条件下发酵24 h，分别在0、6、12、24 h进行取样，检测发酵过程中的pH及各种含量变化。
1.3.3 发酵过程中乳酸含量的测定
采用分光光度计法测定乳酸含量。
配制10 g/L的标准乳酸溶液，并将其用超纯水依次稀释为5、2.5、1.25、0.625 g/L的质量浓度梯度，100 μL乳酸溶液加入4 mL 0.2% FeCl3·6H2O溶液，振荡摇匀10 s，静置反应15 min，在390 nm处测定吸光度，以乳酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线。将发酵后的样品利用超纯水分别稀释1倍后摇匀，测定条件同上。利用标准曲线计算样品中的乳酸含量。
1.3.4 气相色谱测定发酵液中短链脂肪酸的含量
(1)气相色谱条件[18]：色谱柱：DB-FFAP毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气：以纯氮气作为载气，流速1 mL/min，分流比 5∶1；进样量：1 μL；入口温度：200 ℃；离子焰温度：250 ℃；升温进程：采用程序升温1 min升至80 ℃，以10 ℃/min的升温速率递增至200 ℃。
(2)标准曲线的制作：分别配制一定浓度的乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸标准溶液，将6种标准溶液混合均匀后，梯度稀释，按照上述条件进行气相色谱检测。以标准样品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
乙酸回归曲线：y=597 189x-9 049.3(R2=0.99)
丙酸回归曲线：y=937 155x-987.31(R2=0.99)
异丁酸回归曲线：y=1E+06x+8 326.3(R2=0.99)
正丁酸回归曲线：y=1E+06x+9 139.4(R2=0.99)
异戊酸回归曲线：y=1E+06x+14 201(R2=0.99)
正戊酸回归曲线：y=1E+06x+3 498.9(R2=0.99)
(3)样品前处理：取200 μL发酵液，加20 μL 50% H2SO4 酸化10 min，再加1 mL乙醚振荡混匀，提取脂肪酸。后于13 000×g离心15 min，取上层乙醚相，加无水Na2SO4干燥，静置15 min，13 000×g离心5 min取上层乙醚相，色谱条件同上，检测样品中短链脂肪酸的含量[19-20]。
1.3.5 16S rRNA对发酵后粪便菌群组成的分析
1.3.5.1 DNA提取和16S rRNA测序
将待测样品送中国华大基因股份有限公司(中国武汉)进行DNA提取和16S rRNA基因测序。使用E.Z.N.A.细菌DNA试剂盒从粪便样本中提取DNA[21]。设计扩增引物，以稀释后的基因组DNA 为模板，扩增16S rRNA基因V3和V4区。文库先由Agilent Technologies 2100 bioanalyzer进行质检，然后按照Illumina的标准流程在Illumina HiSeq 2500平台上测序，产生2×250 bp的配对端序列[22]。
1.3.5.2 生物信息学分析
测序结束后，序列按相似度聚类为分类单元(operational taxonomic units，OTU)相似性达到97%，每个OTU可认为是代表1个物种[23-24]。利用Greengene数据库将分类信息对应到OTUs代表序列中[25]。alpha多样性以观测物种Chao 1、Shannon和Simpson指数表示。beta多样性是通过主坐标分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)计算得到。根据细菌的相对丰度，统计分析不同组粪便微生物群在多种分类水平上组成的显著差异。利用KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 数据库和PICRUSt软件预测粪便微生物菌群的功能[26]。
1.4 数据处理
所有样品进行3次平行测定，采用 SPSS 25.0 软件进行显著性分析。数据均采用平均值±标准差表示，P<0.05表示显著差异，P<0.01表示极显著差异，并用Origin 8.0软件作图。
2 结果与分析
2.1 发酵过程中pH的变化
空白组和3组实验组在发酵过程中，各取样时间段检测的pH变化情况如图1所示。与空白对照组相比，3种实验组的发酵液pH变化速率明显提高，在0～6 h期间发酵液pH值出现急剧下降。说明3种不同剂量牦牛骨胶原蛋白肽的添加，均可以调节粪便微生物的快速生长，加快底物乳果糖的消耗，使之产生乳酸，促使发酵液pH的快速降低。12 h后发酵液中pH变化减小，发酵逐渐停止，因此，在24 h时终止发酵过程。
图1 发酵过程中pH的变化
Fig.1 The change of pH during fermentation
2.2 发酵过程中乳酸含量的变化
分别在发酵0、6、12、24 h不同的时间段进行取样，检测各组样品的乳酸含量，结果如图2所示。结果表明，与空白对照组相比，3组实验组在发酵过程中乳酸含量都有显著的提高(P<0.05)。说明消化后的牦牛骨胶原蛋白肽可以被肠道菌群很好的利用，能促进肠道微生物的生长代谢，提高乳酸的产量。其中，高剂量组与空白对照组相比差异性最显著，说明高剂量牦牛骨胶原蛋白肽的添加，对于促进肠道菌群发酵产生乳酸的效果较好。
图2 发酵过程中乳酸含量
Fig.2 The concentration of lactic acid during fermentation
注：*表示P<0.05，**表示P<0.01(下同)
2.3 发酵液中短链脂肪酸含量分析
发酵24 h后，将样品通过气相色谱对主要的短链脂肪酸(乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸、正戊酸)进行分析。结果如表1所示，添加不同剂量牦牛骨胶原蛋白肽的实验组，产生的短链脂肪酸含量显著高于(P<0.01)空白对照组。其中，发酵24 h后高剂量组产生的短链脂肪酸的含量最高。
表1 短链脂肪酸含量 单位：g/L
Table 1 The concentration of SCFA
组别乙酸丙酸异丁酸正丁酸异戊酸正戊酸空白对照组1.107±0.012c0.135±0.003c0.027±0.000b0.175±0.00b0.033±0.003b0.063±0.001b低剂量组 1.600±0.184b0.123±0.013c0.027±0.000b0.162±0.009c0.037±0.000b0.069±0.003a中剂量组 1.796±0.105b0.186±0.012b0.028±0.001a0.178±0.004b0.039±0.000ab0.066±0.001ab高剂量组 2.066±0.061a0.248±0.018a0.029±0.000a0.190±0.008a0.041±0.003a0.065±0.002b
注：数据均以平均值±标准差表示，同列数据标有不同字母表示差异显著(P<0.01)
2.4 发酵过程中肠道菌群组成的变化
2.4.1 粪便微生物多样性分析
物种多样性分析如图3所示， Chao 1指数反映的是样品中物种的丰富度,由图3-a可知，与空白对照组相比，3组实验组的小鼠粪便微生物物种丰度降低了。Shannon和Simpson指数反映了群落的alpha物种多样性[27]，如图3-b、图3-c所示，与空白对照组相比，3种实验组的alpha多样性都有明显的降低(P<0.05)，结合肠道菌群组成分析原因，可能是体外模拟发酵环境下，添加牦牛骨胶原蛋白肽对肠道菌群中特定的菌种生长产生了较大的促进作用。图3-d显示了粪便微生物的beta多样性，与空白对照组相比，3组实验组间的多样性发生了明显的改变，上述结果表明，添加不同剂量的牦牛骨胶原蛋白肽改变了小鼠肠道菌群的多样性。
2.4.2 粪便微生物组成分析
粪便微生物在门水平上的组成分析如图4所示，门水平上的微生物群主要由放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)三大类组成，占总细菌的(78±5.4)%，其次是变形菌门(Proteobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。与空白对照组相比，低浓度和中浓度实验组放线菌门的相对丰度显著增加(P<0.01)，说明这2种浓度的牦牛骨胶原蛋白肽能够促进肠道放线菌门的生长。此外，3组实验组拟杆菌门和疣微菌门的相对丰度显著低于空白对照组(P<0.05)，而厚壁菌门，变形菌门的相对丰度与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。
a-Chao 1指数；b-Shannon指数；c-Simpson指数；d-PCoA
图3 小鼠粪便微生物的物种多样性
Fig.3 The species diversity of mice fecal microbiota
图4 小鼠粪便菌群在门水平上的组成
Fig.4 The composition of mice fecal microbiota at the
phylum level
微生物组成在科水平上进行分析，结果如图5所示,小鼠的粪便微生物主要由双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)，紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)和乳杆菌科(Lactobacillaceae)组成。与空白组相比，低浓度和中浓度实验组双歧杆菌科的相对丰度显著增加(P<0.01)，高浓度实验组乳杆菌科的相对丰度显著高于空白组(P<0.05),说明牦牛骨胶原蛋白肽对于双歧杆菌科和乳杆菌科这2种有益菌的生长有一定的促进作用。此外，紫单胞菌科和疣微菌科的丰度明显低于空白对照组(P<0.05)，而紫单胞菌科和疣微菌科分别属于拟杆菌门和疣微菌门，其在科水平上的变化趋势与上述门水平上的相一致。
图5 小鼠粪便菌群在科水平上的组成
Fig.5 The composition of mice fecal microbiota at the
family level
图6-a是粪便微生物在属水平上的组成情况，主要由双歧杆菌属(Bifidobacterium)，埃希氏菌属(Escherichia)，艾克曼菌属(Akkermansia)，巴恩斯氏菌属(Barnesiella)和乳酸杆菌属(Lactobacillus)组成。其中双歧杆菌属的含量最高，其在不同组间的丰度变化情况如图6-b所示，低浓度和中浓度实验组双歧杆菌的相对丰度显著高于对照组(P<0.01)，而双歧杆菌属于双歧杆菌科，放线菌门，其在属水平上的变化与科和门水平上的变化一致。
2.4.3 粪便微生物功能预测
对空白组与实验组在KEGG代谢途径第2水平上的功能差异进行对比分析，结果如图7所示。图7-a和图7-b分别显示了空白组与低浓度组和中浓度组的对比情况，结果显示2组不同浓度实验组的复制和修复功能、氨基酸代谢以及脂质代谢都明显高于空白组。图7-c显示了空白组与高浓度组的对比情况，其中膜运输，碳水化合物代谢以及其他氨基酸代谢功能明显高于空白组。上述结果表明，添加牦牛骨胶原蛋白肽后，小鼠肠道菌群的一些代谢功能有一定的提高。
a-小鼠粪便菌群在属水平上的组成；b-双歧杆菌相对丰度
图6 小鼠粪便菌群在属水平上的组成以及双歧杆菌相对丰度
Fig.6 The composition of mice fecal microbiota at the
genus level and the relative abundance of Bifidobacterium
A-空白对照组；B-低浓度组；C-中浓度组；D-高浓度组
a-空白组与低浓度组；b-空白组与中浓度组；c-空白组与高浓度组
图7 小鼠粪便菌群功能预测
Fig.7 The predicted functions of mice fecal microbiota
3 结论
添加不同剂量模拟消化后的牦牛骨胶原蛋白肽进行小鼠粪便菌群厌氧发酵，结果发现小鼠肠道菌群的多样性和组成发生了明显的变化，其中双歧杆菌和乳酸菌这2种益生菌的含量显著增加，说明牦牛骨胶原蛋白肽可能会促进肠道中有益菌的增殖，具有改善肠道功能和维护肠道微生态平衡的潜力。同时，通过对小鼠粪便菌群功能预测分析可知，牦牛骨胶原蛋白肽可能会改变肠道菌群的代谢功能。牦牛骨胶原蛋白肽对于肠道菌群的调节作用需要后续进行体内动物实验进一步确认。
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