肉制品营养丰富，是人类膳食，尤其是运动员日常膳食的重要组成部分。冷冻肉是企业生产肉制品的主要原料，但长期冻藏会导致肉质硬化、柔软性下降、持水力及加工性能降低等变化[1]，其根本原因是冷冻导致肌原纤维蛋白(myofibrillar protein，MP)的损伤变性[2]。肌原纤维蛋白是肌肉中含量最高的蛋白质，具有乳化性及凝胶性等多重功能特性，其中MP的凝胶特性在肉制品加工中决定着成品的质构和感官。现有研究主要聚焦于通过革新冷冻及解冻方法、添加抗冻剂等手段降低原料肉蛋白的反复冻融，如谭明堂等[3]研究发现经过流水解冻后的鱿鱼弹性好于空气解冻和静水解冻，肌纤维组织相对于超声波静水解冻和微波解冻更加紧密；刘欢等[4]研究发现在低温解冻下的鱼肉组织保持最好；张伊侬等[5]研究发现超声波处理会显著改善反复冻融鸡肉肌原纤维蛋白的功能特性，改善效果与超声波处理时间有关，适当的处理时间效果最佳；陈金玉等[6]的研究表明添加海藻糖和甘露醇可以有效降低冷冻诱导的蛋白变性。但现有策略存在成本高昂、技术不成熟等实际问题。因此，寻找合适的措施改善反复冻融蛋白的加工性能具有重要的理论与实际应用价值。
食盐和多聚磷酸盐经常被用来改善原料肉的加工性能、提高肉品品质，但其长期摄入不利于人体健康。“低盐、无磷”绿色健康肉制品加工技术是肉品行业的发展趋势。精氨酸(L-arginine，L-Arg)是蛋白质的基本组成成分，是婴幼儿生长发育必不可少的氨基酸，具有保护胃肠黏膜，提高机体免疫力等生理功效[7]。作为一种食品加工中允许添加使用的营养增补剂和调味剂，具有安全性高、来源广泛等特点。近年来精氨酸在肉蛋白结构与加工性能及肉制品品质调控方面的作用引起了肉品科学家的兴趣。ZHENG[8]发现L-Arg添加可以显著改善肉制品的感官品质并降低其蒸煮损失；WACHIRASIRI等[9]研究发现L-Arg可以显著降低虾在低温贮藏过程中冷冻导致的汁液损失；许鹏[10]研究发现L-Arg可以显著降低肉制品的过氧化值，羰基含量以及硫代巴比妥酸反应物值；QIN等[11]研究发现，添加L-Arg可以促进鸡盐溶蛋白形成结构致密、均匀的热诱导凝胶；TAKAI等[12]研究发现，L-Arg可以提高肌球蛋白的溶解度；马文慧等[13]研究发现氧化条件下L-Arg可以显著降低猪MP凝胶的强度和白度，但会明显提高凝胶得率。可见L-Arg具有调控肉蛋白加工性能的作用，然而目前关于L-Arg 对反复冻融肌原纤维蛋白结构及凝胶性能方面的研究尚未见报道。因此，本文系统探究不同浓度L-Arg(0.0、1.0、3.0、5.0和10.0 mmol/L)对反复冻融MP结构、流变学行为及热诱导凝胶性能的影响，通过综合分析明晰其内在机制，为改善反复冻融肉蛋白的加工性能提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
排酸24 h的猪外脊肉，购于当地大型超市，剔除可见脂肪、结缔组织后，垂直于肌纤维走向切块，真空包装后置于-18 ℃冰箱，3个月内用完。
L-Arg，上海源叶生物科技有限公司；氯化镁、磷酸氢二钠、硫酸铜、碘化钾、氯化钠、牛血清蛋白等化学试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
圆二色光谱仪，英国Applied Photophysics公司；Fluoro Max-4荧光分光光度计，日本Horiba公司；Mastersizer 2000激光粒度分析仪，英国Malvern Instruments有限公司；Haake-Mars 60 流变仪，德国Thermo Fisher Scientific公司；TA.Plus物性测试仪，英国Stable Micro System公司。
1.3 实验方法
1.3.1 反复冻融原料肉的制备
将真空包装的新鲜肉样置于-18 ℃冰箱中冷冻，3 d 后取出，室温下自来水流水解冻(中心温度达到0～2 ℃)，即为1次冷冻-解冻循环，重复上述步骤，选取3次冷冻-解冻循环肉样为研究对象。同时设置未参与冷冻-解冻循环的肉样作为对照。
1.3.2 肌原纤维蛋白的提取
将肉样解冻后切成小条称重，参照曹云刚[14]的方法提取肌原纤维蛋白。整个过程保持在0～4 ℃，所得蛋白膏置于碎冰中放入冰箱冷藏室保持，并在48 h内使用。以牛血清蛋白作为标准蛋白，采用双缩脲法测定蛋白浓度。
1.3.3 肌原纤维蛋白-精氨酸混合体系的制备
用25 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.2)将MP蛋白膏样品稀释为40 mg/mL，调节稀释液NaCl浓度为0.4 mol/L，根据计算结果分别加入不同体积的L-Arg溶液并轻轻搅匀，使得最终体系中蛋白浓度为30 mg/mL，L-Arg终浓度分别为0.0、1.0、3.0、5.0和10.0 mmol/L，所有样品于4 ℃下放置12 h。同时设置未反复冻融MP样品作为对照。
1.3.4 圆二色谱分析
使用磷酸盐缓冲液(25 mmol/L，含0.4 mol/L NaCl，pH 6.2；除非特殊说明本文中磷酸盐缓冲液均指此缓冲液)调整蛋白浓度为0.2 mg/mL，借助圆二色谱光谱仪分析蛋白二级结构含量，设置扫描速率为120 nm/min、扫描200～260 nm，累计扫描3次取其平均值，相同条件下对缓冲液进行扫描，以确定各样品基线水平，通过差减除去基线信号值，使用CDNN软件计算蛋白二级结构含量。
1.3.5 内源性色氨酸荧光分析
使用上述磷酸盐缓冲液将MP样品稀释为0.4 mg/mL，测定蛋白内源性荧光，设置激发波长为283 nm，发射光谱为290～400 nm。
1.3.6 粒度分析
使用Mastersizer 2000型激光粒度分析仪在25 ℃下采用静态光散射法测量MP样品的粒径。用磷酸盐缓冲液将样品稀释至质量浓度为2 mg/mL，去除测量背景后，将MP稀释液分散于蒸馏水中，直到达到要求的遮光效果(10%～13%)，以防止多重散射的发生。重复测定3次取其平均值，获得蛋白粒径大小。
1.3.7 溶解度测定
使用磷酸盐缓冲液将MP样品稀释至质量浓度为2 mg/mL，在4 oC、5 000×g条件下离心15 min，双缩脲法测定上清液的蛋白浓度，溶解度计算如公式(1)所示：
蛋白溶解度
(1)
1.3.8 流变学性能的测定
使用Haake-Mars 60型流变仪通过振荡温度连续扫描，分析不同处理MP样品在热诱导凝胶化过程中的流变行为。流变仪使用前调零，将离心(4 ℃，1 000×g，1 min) 脱气后的样品均匀涂布于平板上，使P 35型转子下压至距离平板1 mm后，轻轻擦去平板周围溢出的样品，滴一圈硅油进行密封，以1 ℃/min 的升温速率从20 ℃ 加热至75 ℃。设置振荡频率为0.1 Hz、最大应变为2%。记录凝胶化过程中样品的储能模量(G′)和黏弹比(tanδ)[13]。
1.3.9 MP热诱导凝胶的制备
将不同处理MP样品(30 mg/mL)脱气后，准确称取5 g于玻璃瓶中，封口后，置于水浴锅中，从 20 ℃ 加热至75 ℃，升温速率约为1 ℃/min，将热诱导凝胶充分冷却后放入4 ℃冰箱过夜[15]。
1.3.10 蒸煮损失的测定
参照马文慧等[13]描述的方法进行测定。蒸煮损失率C计算如公式(2)所示：
(2)
1.3.11 MP凝胶强度的测定
使用TA-XT Plus物性分析仪测定不同处理MP样品的凝胶强度。测定参数：探头型号P/75；测前、测中和测后速率均为2 mm/s；下压百分比30%；触发力10 g。
1.3.12 MP凝胶白度的测定
将CM-5分光测色计经自检及零点、白板校正后，对样品白度进行测定，计算如公式(3)所示：
(3)
1.4 统计分析
使用Statistix 9.0分析软件的通用线性模型程序进行方差分析，采用LSD模式比较多组数据进行显著性分析，P值设置为0.05。
2 结果与分析
2.1 不同浓度L-Arg对反复冻融MP二级结构的影响
不同处理MP的二级结构如表1所示，与未经反复冻融MP(对照)相比，经反复冻融MP的α-螺旋含量明显下降，同时β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构含量显著上升，这是由于反复冻融导致肌球蛋白尾部的α-超螺旋结构逐渐解旋而部分转化为β-折叠和无规则卷曲结构[15]。添加L-Arg显著改变了反复冻融MP的二级结构：添加1.0，3.0，5.0和10.0 mmol/L的L-Arg处理使反复冻融MP的α-螺旋含量分别提高了8.7%、9.89%、10.11%和9.02%，同时β-折叠、β-转角和无规则卷曲结构含量均有所下降，但不同浓度L-Arg处理组之间无明显差异。总的来看，添加L-Arg 处理后反复冻融MP二级结构的组成可恢复至接近于对照组。
表1 不同浓度L-Arg对MP二级结构的影响
Table 1 Effect of different concentrations of L-Arg on
the secondary structure of MP
精氨酸浓度/(mmol·L-1)α-螺旋β-折叠β-转角无规则卷曲对照62.99%6.67%11.54%18.71%0.054.78%9.15%13.41%22.66%1.063.48%6.47%11.54%18.41%3.064.67%6.00%10.83%18.50%5.064.89%6.11%11.05%17.95%10.063.80%6.33%11.28%18.60%
2.2 不同浓度L-Arg对反复冻融MP三级结构的影响
内源荧光光谱是检测色氨酸残基微环境及蛋白质分子三级结构变化的重要技术手段[16]。如图1所示，未经反复冻融的MP，显示出较强的荧光强度，在最大发射波长处的荧光强度约为45.8×104 cps，经反复冻融的MP荧光强度显著降低，这可能是由于反复冻融破坏了MP原有的空间结构，引起蛋白结构展开，导致原本位于蛋白质疏水性内核中的色氨酸残基暴露于极性环境中，促使内源荧光强度下降[17]。L-Arg 处理对于反复冻融MP荧光强度的影响具有明显的浓度依赖性：当L-Arg的浓度在1.0～3.0 mmol/L时，随着L-Arg的浓度增加蛋白荧光强度逐步降低；与之类似，冷利萍[18]研究也发现金线鱼MP的内源性荧光强度会由于外源性L-Arg添加而显著下降。当L-Arg浓度为5.0 mmol/L时，荧光强度反而增强，并接近于对照组MP的荧光强度；当L-Arg浓度为10.0 mmol/L时，L-Arg添加对反复冻融MP的荧光强度无显著影响。不同浓度L-Arg对反复冻融MP荧光强度的影响可能是以下2个因素共同作用的结果：一方面可能是由于L-Arg处理使MP分子空间结构发生了改变(如表1所示)[19]，使得色氨酸残基所处的微环境发生变化；另一方面可能是由于L-Arg中多个亲水基团(—COOH和—NH2)的存在使得色氨酸残基的微环境发生变化，导致荧光强度进一步发生变化。
图1 不同浓度L-Arg对MP三级结构的影响
Fig.1 Effect of different concentrations of L-Arg on the
tertiary structure of MP
2.3 不同浓度L-Arg对反复冻融MP粒度的影响
粒径可用来反映可溶性蛋白的粒度分布和聚集情况，不同处理对MP平均粒径的影响如图2所示。反复冻融导致MP的D(3,2)和D(4,3)都有所增加，这是由于反复冻融导致蛋白结构展开、蛋白分子间相互作用增强，引起蛋白交联聚集，表现为平均粒径增大[20]。整体来看，L-Arg处理降低了反复冻融MP的平均粒径。当L-Arg的浓度在1.0～10.0 mmol/L时，D(3,2)整体呈略微下降趋势；而D(4,3)随浓度增加有所增大。GAO等[21]研究发现添加L-Arg可以使鳙鱼热诱导肌球蛋白的粒径下降，这可能是由于L-Arg与蛋白相互作用抑制了肌球蛋白聚集成丝的能力。与本研究结果不同，马文慧等[13]发现在氧化条件下L-Arg处理导致MP粒径增大，这可能是由于L-Arg的存在促进了蛋白的结构展开，加剧了氧化诱导的蛋白聚集。综上所述，L-Arg对肉蛋白粒径的影响可能与蛋白本身及氧化或冷冻处理等多种实验因素有关。
图2 不同浓度L-Arg对MP粒度的影响
Fig.2 Effect of different concentrations of L-Arg on the
particle size of MP
2.4 不同浓度L-Arg对反复冻融MP溶解度的影响
反复冻融条件下添加不同浓度L-Arg对MP溶解度的影响如图3所示。与未经反复冻融的MP相比，反复冻融导致MP的溶解度下降了31.9%(P<0.05)。这可能是由于冷冻产生的冰晶破坏了蛋白质的空间结构，使蛋白变性聚集[22]。L-Arg处理显著提高了反复冻融MP的溶解度，且随着L-Arg浓度增大蛋白溶解度逐步提高。L-Arg对于MP的增溶作用可能与其诱导的蛋白结构及粒径变化有关。与本研究结果类似，LI等[23]也发现L-Arg能够显著提高猪肌球蛋白的溶解度，认为这是由于L-Arg可以与肌球蛋白分子中的某些氨基酸残基发生相互作用，并抑制了肌球蛋白分子间的聚集。
图3 不同浓度L-Arg对MP溶解度的影响
Fig.3 Effect of different concentrations of L-Arg on the
solubility of MP
2.5 不同浓度L-Arg对反复冻融MP流变学性能的影响
储能模量(G′)和损耗模量(G″)是流变学持性中的2个重要参数，分别表示材料的弹性和黏性。如图4-a所示，对照组MP的G′在加热过程中经历了3个流变学转变过程，第1个过程(20～56 ℃)肌球蛋白头部变性聚合形成结构较为疏松的凝胶[24-25]；随后(56～63 ℃)肌球蛋白尾部超螺旋结构逐渐解旋破坏了肌球蛋白头部前期形成的疏松网络结构，最后(63～75 ℃)肌球蛋白分子充分交联聚集，形成了稳固的、不可逆的凝胶网络结构[26]。反复冻融MP的G′值在整个热诱导成胶过程中均低于未经反复冻融MP，说明反复冻融在一定程度上破坏了MP的胶凝性能。与本研究结果相一致，LIAN等[27]也发现反复冻融使红鳕鱼MP的G′值减小。L-Arg处理进一步降低了反复冻融MP的G′值，且随着L-Arg浓度增大反复冻融MP的G′值逐渐降低，一方面可能是由于溶液中带正电的L-Arg与带负电的肌球蛋白结合，从而抑制了肌球蛋白间的聚集；另一方面由于L-Arg的存在抑制了加热过程中肌球蛋白结构的展开和交联，阻碍了凝胶网络的形成[28]。
tanδ表示蛋白凝胶体系的黏性与弹性间的转化关系，其比值越高说明体系黏性越强或弹性越低。由图4-b可以看出，未参与反复冻融MP的tanδ值从20～58 ℃持续上升，这说明在此阶段蛋白体系中黏性的增长速率较快，随后tanδ随温度的上升急剧下降，这说明在此阶段蛋白体系中弹性的增长速率较快，形成了稳定的、不可逆的凝胶网络结构。参与反复冻融MP的tanδ值低于未参与反复冻融MP，说明反复冻融导致MP体系的弹性增大。L-Arg处理升高了反复冻融MP的tanδ值，且随着L-Arg浓度的增加tanδ的值也逐渐变大，说明L-Arg处理显著改变了凝胶过程中MP体系的黏弹性，使蛋白体系更偏向于黏性。
图4 不同浓度L-Arg对MP流变学性能的影响
Fig.4 Effects of different concentrations of L-Arg on the
rheological properties of MP
2.6 不同浓度L-Arg对反复冻融MP凝胶蒸煮损失及白度的影响
不同浓度L-Arg对反复冻融MP凝胶蒸煮损失的影响如图5所示，与对照组相比，反复冻融处理并未导致MP热诱导凝胶的蒸煮损失显著降低。而任丽娜[29]研究发现白鲢鱼肉随冻融时间的增加，其蒸煮损失显著降低。不一致的结果可能与蛋白种类及其他实验条件有关。添加不同浓度L-Arg使反复冻融MP凝胶的蒸煮损失降低至8.415%、7.541%、6.307%和3.444%。与本研究结果一致，冷利萍[18]发现经L-Arg处理后金线鱼MP凝胶的蒸煮损失显著降低，认为这可能是由于L-Arg能够促使蛋白质结构发生展开、暴露出更多的活性基团，促进了三维凝胶网络结构的形成，而凝胶的网络结构可以使部分游离水截留并且束缚在凝胶网络的间隙中。
图5 不同浓度L-Arg对MP凝胶性能的影响
Fig.5 Effect of different concentrations of L-Arg on the
properties of MP gel
不同处理对MP凝胶白度也如图5所示。反复冻融使得凝胶白度略微有所下降，这可能与反复冻融导致的蛋白氧化变性有关[30]。L-Arg的添加，进一步降低了蛋白凝胶的白度，且随着L-Arg浓度的增加凝胶白度持续降低，这主要是L-Arg自身的颜色所致。
未参与反复冻融MP的凝胶强度为65.057，参与反复冻融MP的凝胶强度下降至62.075。加热前L-Arg 处理会促进热诱导MP凝胶强度进一步下降，且呈现出明显的浓度依赖性;当L-Arg浓度为10.0 mmol/L时，与反复冻融MP样品的凝胶强度相比，L-Arg处理的MP凝胶强度降低了约27.1%(P<0.05)。与本研究结果类似，GAO等[21]也发现Arg/His显著抑制了热诱导凝胶过程中肌球蛋白分子间的交联聚集，从而降低了鳙鱼肌球蛋白的凝胶强度。
3 结论
反复冻融导致肌原纤维蛋白结构展开、粒径增大、溶解度和凝胶性能显著下降。添加L-Arg处理可以调控反复冻融MP的结构和凝胶性能，表现为：L-Arg 添加可以显著改变反复冻融MP的空间结构，使得其二级结构的构成比例接近于未经反复冻融处理组，不同浓度L-Arg处理对MP二级结构的影响效果无显著差异；整体来看，L-Arg添加可以降低反复冻融MP的粒径、显著提高其溶解度，且溶解度提升效果与L-Arg浓度呈正相关；L-Arg处理显著抑制了热诱导成胶过程中MP分子间的交联聚集、导致G′及凝胶强度显著降低，且抑制效果与L-Arg浓度呈正相关；但L-Arg添加显著提高了凝胶得率。因此，单独使用L-Arg可以调控MP结构、提高其凝胶持水性，但无法改善其凝胶强度。后续的研究可以考虑L-Arg和其他物质(比如谷氨酰胺转氨酶)复配使用全面改善反复冻融MP的凝胶性能。
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