蔓越橘属于杜鹃花科、越橘属(Vaccinium spp.)多年生落叶或常绿灌木，在全世界广泛分布[1]。越橘中含有丰富的花色苷，其含量在目前已测蔬菜与水果中较高。BARON等[2]从蔓越橘中提取了花色苷并进行分离鉴定，结果表明越橘花色苷中主要包括15种花色苷，是由矢车菊素、飞燕草素、芍药色素、牵牛花色素和锦葵色素分别与葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖通过糖苷键结合形成的。花色苷在酸性条件下形成稳定的红色烊阳离子，并在碱的存在下部分转变为醌类结构并呈现蓝色[3-4]。这种特性使它们可以用于制备有颜色指示的智能食品包装材料，用以监测肉类食品的腐败变质[5-7]。
花色苷在贮藏和加工过程中容易降解和褪色，极大地影响了其在智能包装中的应用。除了pH、光、氧[8]等外部因素外，花色苷的结构对其稳定性也有很大的影响。有研究表明花色苷中2-苯基苯并吡喃阳离子结构中羟基的增加通常会导致其稳定性的降低，而甲基化程度的增加有利于提高花色苷的稳定性[9]。游离羟基的糖基化也增强了花青素的稳定性，这是由于糖链可以像缎带一样在2-苯基苯并吡喃骨架表面堆积，这种堆积可以防止花色苷因水合平衡的转换而褪色，从而保持其颜色稳定性[10]。部分天然花色苷常被酰化修饰，常见的酰基基团有芳香酸(如阿魏酸、芥子酸、没食子酸等)和脂肪酸(如丙二酸、乙酸、苹果酸、琥珀酸、草酸)[11]。有研究表明，在同种情况下，酰基化的花色苷比非酰基化的花色苷稳定性更好[10,12-13]，这是因为酰基的位阻效应使花色苷更不容易受到水攻击和阻碍，抑制甲醇假碱和查尔酮结构的形成。YANG等[14]利用月桂酸对黑豆花色苷进行酰化改性，结果表明改性花色苷的热稳定性显著提高了。本课题组在前期通过固相反应法将马来酸酐接枝到花色苷分子上，其褪色率显著降低[15]，但其稳定性仍不理想。
本研究采用酶催化方法将3,4-二羟基苯甲酸及没食子酸接枝到越橘花色苷分子上以提高其稳定性，为越橘花色苷的进一步研究和开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
越橘(蔓越橘，Vacinium macrocarpon)花色苷粗提物，西安圣青生物有限公司；脂肪酶(Novozymes 435，≥5 000 U/g，重组酶，在黑曲霉中表达)、3,4-二羟基苯甲酸、没食子酸，上海阿拉丁试剂有限公司；油酸、β-胡萝卜素、DPPH，上海麦克林试剂有限公司；四氢呋喃、无水乙醇、吐温-80、柠檬酸、盐酸、磷酸氢二钾，西陇化工股份有限公司。本文所用试剂，如无特别说明，均为分析纯。
1.2 仪器设备
MultiSkan Go全波长酶标仪、NICOLET IS 10傅里叶红外光谱仪，美国赛默飞世尔有限公司；旋转蒸发仪，上海力辰仪器科技有限公司；T9紫外-可见分光光度仪，北京普析通用仪器有限责任公司。
1.3 实验方法
1.3.1 酰化花色苷的制备
将10 g越橘花色苷粗提物溶于300 mL无水乙醇，随后用微孔膜过滤去除花色苷中的蛋白质、多糖、果胶等；然后在50 ℃下旋转蒸发以去除滤液中的无水乙醇；最后，通过冷冻干燥进一步去除溶剂，所得样品即为越橘花色苷，记作Na-An。
将4 g越橘花色苷溶于100 mL去离子水并加入1 g Novozymes 435脂肪酶混合均匀；将15 mmol的3,4-二羟基苯甲酸溶于100 mL四氢呋喃；然后将上述2种液体混合，并将其置于50 ℃下磁力搅拌24 h进行酶催化反应；反应完成后，通过微孔滤膜过滤去除混合液中的脂肪酶；随后，在50 ℃下旋转蒸发以去除混合液中的四氢呋喃，再通过冷冻干燥去除水分；接着，将所得固体样品分散于100 mL四氢呋喃中，搅拌10 min后通过微孔滤膜过滤，取滤渣，重复3次以洗去固体样品中的未反应的酚酸；最后，通过冷冻干燥去除滤渣中剩余的四氢呋喃，收集样品即为3,4-二羟基苯甲酸修饰的越橘花色苷，记作Dh-An。
用同样方法制备没食子酸修饰的越橘花色苷，记作Ga-An。
1.3.2 酰化度测定
采用电位滴定法测定花色苷的酰化度(acylation degree，AD)[16-17]。将0.2 g的花色苷(或酰化花色苷)溶解于20 mL 0.1 mol/L NaOH溶液中，在40 ℃下搅拌2 h使花色苷水解并皂化；随后，用0.01 mol/L的HCl溶液滴定至pH值为9.0。按照公式(1)、公式(2)计算酰化花色苷的酸值(acid value，AV)和AD：
(1)
AD/%=M×(AV1-AV0)×100
(2)
式中：C0为皂化使所用NaOH溶液浓度(0.1 mol/L)；V0为皂化使所用NaOH溶液体积(20 mL)；C1为滴定使所用NaOH溶液浓度(0.01 mol/L)；V1为滴定使所用NaOH溶液体积；m为所用花色苷质量；M为接枝基团的相对分子质量;AV1为酰化花色苷的酸值；AV0为原始花色苷的酸值。
1.3.3 总花青素含量测定
通过pH差示法测定花色苷中的总花青素含量(total anthocyanin content，TAC)，具体参照李晓娇等[18]方法。分别用pH 1.0(0.5 mol/L柠檬酸/盐酸)和pH 4.5(0.5 mol/L柠檬酸/磷酸氢二钾)的缓冲液将2份10 mL花色苷溶液(5 g/L)稀释至250 mL；在黑暗中放置1 h后，用酶标仪分别测定2种溶液在513和700 nm处的吸光度。花色苷的TAC值计算如公式(3)和公式(4)所示：
(3)
A=(A513 nm-A700 nm) pH1.0-(A513nm-A700nm) pH4.5
(4)
式中：A表示吸光度；MW为矢车菊苏-3-O-葡萄糖的相对分子质量，为449.2 g/moL；ε为摩尔消光系数，为26 900 L/(mol·cm)；DF为稀释因子；L为光程。
1.3.4 DPPH自由基清除率测定
用无水乙醇稀释0.25 mmol/L DPPH乙醇溶液至其在513 nm处吸光度约为0.8；向4 mL的DPPH溶液中加入0.05 mL花色苷溶液，在黑暗中静置30 min后，测定其在513 nm处的吸光度；参照样品不加花色苷溶液，以50 μL无水乙醇替代；通过公式(5)计算花色苷的DPPH自由基清除率：
DPPH自由基清除率
(5)
式中：A0为参照样在513 nm处的吸光度，A1为样品在513 nm处的吸光度。
1.3.5 β-胡萝卜素漂白抑制率测定
参照YANG等[19]，将10 mL β-胡萝卜素氯仿溶液(1 mg/mL)、400 mL亚油酸和4 mL吐温-80在梨形瓶中充分混合后，在40 ℃旋转蒸发除去氯仿。随后，在梨形瓶中加入100 mL蒸馏水，将混合后的液体均匀混合成乳化液；然后取10 mL乳化液并稀释至100 mL，制得乳化稀释液；将0.1 mL的花色苷溶液加入到4.9 mL的乳化稀释液中，混合均匀后测定其在470 nm处相应的吸光度；然后将样品置于50 ℃恒温水浴2 h，并测定其在470 nm处吸光度。参照样中不加花色苷溶液，用体积分数为70%的乙醇溶液代替。通过公式(6)计算β-胡萝卜素漂白法的抑制率：
抑制率
(6)
式中：
为花色苷样品加入到β-胡萝卜素乳化稀释液后在470 nm处的吸光度，
为该样品加热2 h 后在470 nm处的吸光度，
和
是参照样的相应吸光度。
1.3.6 稳定性测定
取10 mL花色苷溶液，将其置于25 ℃环境下贮存，每12 h测量1次花色苷溶液在513 nm处的吸光度，根据公式(7)计算花色苷溶液的褪色率：
褪色率
(7)
式中：A0为花色苷溶液的初始吸光度(513 nm处)，A1为贮存一定时间后花色苷溶液在513 nm处的吸光度。
1.3.7 结构表征
通过NICOLET IS 10傅里叶变换红外光谱仪(Fourier transform infrared spectrometer，FTIR)表征花色苷的官能团，波数范围为4 000～400 cm-1，分辨率为16 cm-1；采用在T9紫外可见分光光度计(UV-visible spectroscopy，UV-Vis)测定其在200～800 nm处的吸光度。
2 结果与分析
2.1 UV-Vis分析
采用UV-Vis研究了3,4-二羟基苯甲酸及没食子酸改性对越橘花色苷分子结构的影响，结果如图1所示。越橘花色苷在～279 nm和～523 nm处有2个特征吸收峰，是由花色苷的吡喃环上的电子跃迁造成的。早在1958年，HARBORNE等[20-22]已经开始报道UV-Vis光谱学在花青素结构鉴定中的应用。研究结果表明，花色苷UV-Vis谱图上300～350 nm处的肩峰是由酰基造成的，且其在该处的吸光度与可见光区最大吸收强度的比值表示花色苷酰化程度。由图1可以看出，与天然越橘花色苷相比，改性花色苷在～312 nm处出现了明显的肩峰，表明3,4-二羟基苯甲酸和没食子酸都通过酰化反应接枝到花色苷分子上，而不是与花色苷物理共混。
a-紫外光区；b-可见光区
图1 越橘花色苷及改性花色苷的UV-Vis图谱
Fig.1 UV-Vis spectra of native and acylated anthocyanins
2.2 FTIR分析
通过FTIR表征了越橘花色苷在酰化前后的分子基团变化。如图2-a所示，在～3 383 cm-1的吸收峰是由果胶、酚酸分子上的—OH和H2O及氢键的伸缩振动造成的；～2 922 cm-1处的峰是由—CH3、—CH2 及苯环上的C—H键伸缩振动造成的。在图2-b中，～1 614 cm-1处的吸收峰是由C—O的伸缩振动所引起的。另外，Na-An在～1 726 cm-1处有1个弱峰，是C
O的伸缩振动造成的，这表明天然越橘花色苷分子上存在少量酰化基团。酰化反应后，该吸收峰强度明显增强，并红移至1 693 cm-1处，这可能是由于3,4-二羟基苯甲酸及没食子酸与花色苷分子发生酰化反应造成的。一般来说，如果酚酸分子上的—COOH与花色苷分子上的酚羟基(ArOH)发生酰化反应形成酯基(ArOOC)。该基团的吸收峰会因为电子诱导效应而发生蓝移。由此可以推断，该酰化反应是由3,4-二羟基苯甲酸及没食子酸的—COOH与花色苷分子上糖基的—OH发生酯化反应造成的。
a-4 000～400 cm-1；b-2 000～1 000 cm-1
图2 越橘花色苷及改性花色苷的红外光谱图谱
Fig.2 FTIR spectra of native and acylated anthocyanins
2.3 酰化度和花青素含量分析
通过电位滴定法测定了越橘花色苷酰化反应后的酰化度。如图3-a所示，3,4-二羟基苯甲酸及没食子酸修饰花色苷的酰化度分别为4.65%(Dh-An)和4.53%(Ga-An)。如图3-b所示，天然越橘花色苷中的花青素含量为373.3 mg/g，酰化改性后，Dh-An 中花青素含量为167.9 mg/g，Ga-An中花青素含量为154.8 mg/g。这可能是由于以下几个方面造成，一方面，外来基团接枝到花色苷分子上，导致单位质量的花色苷中的花青素含量降低。另一方面，花青素含量是通过pH差示法测定的，其依据是花色苷的发色团结构转变是环境pH的函数，而起干扰作用的褐色降解物颜色不随pH值的变化而变化。在酰化反应过程中，可能会有部分花色苷发生降解并形成褐色降解物从而造成TAC降低。
a-酰化度；b-花青素含量
图3 越橘花色苷及改性花色苷的酰化度和花青素含量
Fig.3 AD and TAC of native and acylated anthocyanins
注：不同大写字母代表差异显著(P<0.05)；
不同小写字母代表差异极显著(P<0.01)(下同)
2.4 抗氧化活性分析
图4反映了越橘花色苷在酰化反应前后DPPH自由基清除率和β-胡萝卜素漂白抑制率的变化。如图4-a所示，天然越橘花色苷的DPPH自由基清除率为73.5%，接枝酚酸后，该值分别上升至85.6%(Dh-An)和91.6%(Ga-An)。这是由于花色苷分子为DPPH自由基提供电子从而使其褪色，花色苷分子上的酚羟基是良好的电子供体，可以有效清除DPPH自由基。酚酸分子上也有酚羟基，同样是良好的抗氧化剂，当其接枝到花色苷分子上后极显著(P<0.01)提高了越橘花色苷的抗氧化活性。另外，3,4-二羟基苯甲酸分子上有2个酚羟基，而没食子酸分子上有3个酚羟基，因此可以观察到Ga-An的DPPH自由基清除率高于Dh-An。
在β-胡萝卜素漂白实验中，油酸在加热过程中被氧化生成自由基并造成β-胡萝卜素被漂白褪色。花色苷的加入可以有效清除油酸反应生成的自由基并抑制β-胡萝卜素褪色[1-3]。由图4-b可以观察到，天然越橘花色苷的β-胡萝卜素漂白抑制率为65.9%，接枝3,4-二羟基苯甲酸和没食子酸后，该值分别上升至79.5%和84.8%。
a-DPPH自由基清除率；b-β-胡萝卜素漂白抑制率
图4 越橘花色苷及改性花色苷的DPPH清除率和
β-胡萝卜素漂白抑制率
Fig.4 DPPH clearance and inhibition ratio in β-carotene
bleaching assay of native and acylated bilberry anthocyanins
2.5 花色苷稳定性分析
花色苷以其优异的抗氧化活性和鲜艳的颜色而闻名，它们在空气中很容易被氧化和变色。图5反映了在25 ℃的贮藏条件下，天然花色苷和改性花色苷溶液的褪色率变化。如图5所示，随着贮存时间的延长，花色苷溶液的褪色率不断上升。显然，氧化和水解破坏了越橘花色苷的分子结构，生成无色的甲醇假碱和查尔酮，导致花色苷溶液不断褪色。
图5 越橘花色苷及改性花色苷的褪色率
Fig.5 The fading degree of native and acylating anthocyanins
与天然越橘花色苷相比，经酚酸修饰后的花色苷的褪色率较低，稳定性提高。显而易见，酚酸的接枝抑制了花色苷的氧化和分解。3,4-二羟基苯甲酸和没食子酸对花色苷的保护作用可能体现在两个方面。一方面，作为良好的抗氧化剂，3,4-二羟基苯甲酸和没食子酸以其自身的氧化为代价阻止了花色苷被空气中的氧气氧化。由于没食子酸的抗氧化能力强于3,4-二羟基苯甲酸，因此Ga-An的褪色率也要显著(P<0.01)低于Dh-An。另一方面，3,4-二羟基苯甲酸和没食子酸分子可能会堆积在在花青素的苯环上，阻碍了花色苷的水解，并抑制其构型转换及褪色。
3 结论
为了克服天然花色苷在应用过程中易褪色的问题，本文拟通过3,4-二羟基苯甲酸和没食子酸对天然越橘花色苷进行酶法修饰，以提高其稳定性。UV-Vis、FTIR分析表明，在脂肪酶(Novozymes 435)的催化作用下，3,4-二羟基苯甲酸和没食子酸可通过酰化反应接枝到越橘花色苷分子的糖基上。酚酸是良好的天然抗氧化剂，当其接枝到花色苷上，大大提高了花色苷的抗氧化活性。酚酸抗氧化活性主要来自其分子上的酚羟基，每个3,4-二羟基苯甲酸分子上有2个酚羟基，而没食子酸分子上有3个酚羟基，因此，Ga-An组的DPPH自由基清除能力和β-胡萝卜素漂白抑制率要强于Dh-An组。除了抗氧化活性，酰化花色苷的颜色稳定性也要显著高于天然越橘花色苷。一方面，3,4-二羟基苯甲酸和没食子酸通过自身被氧化为代价阻止了花色苷被空气中的氧气氧化。另一方面，酚酸分子可能会堆积在花青素的苯环上，阻碍了花色苷的水解，并抑制其褪色。
[1] 李娜. 越橘花色苷对围绝经前期大鼠ER通路的影响[D].天津:天津科技大学, 2019.
LI N.Effect of bilberry anthocyanins on estrogen receptor pathway in premenopausal rats[D].Tianjin:Tianjin University of Science and Technology, 2019.
[2] BARON G, ALTOMARE A, REGAZZONI L, et al.Pharmacokinetic profile of bilberry anthocyanins in rats and the role of glucose transporters:LC-MS/MS and computational studies[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2017, 144:112-121.
[3] HAZAS M C L D L, MOSELE J I, MACI
A, et al.Exploring the colonic metabolism of grape and strawberry anthocyanins and their in vitro apoptotic effects in HT-29 colon cancer cells[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2016, 65(31):6 477-6 487.
[4] WANG Y H, LIN J, TIAN J L, et al.Blueberry malvidin-3-galactoside suppresses hepatocellular carcinoma by regulating apoptosis, proliferation, and metastasis pathways in vivo and in vitro[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2019, 67(2):625-636.
[5] PINA F, PETROV V, LAIA C A T.Photochromism of flavylium systems：An overview of a versatile multistate system[J].Dyes & Pigments, 2012, 92(2):877-889.
[6] MICHEAL M, REBECCA J R, TOM M C, et al.Red cabbage anthocyanins:The influence of d-glucose acylation by hydroxycinnamic acids on their structural transformations in acidic to mildly alkaline conditions and on the resulting color[J].Dyes & Pigments, 2018, 158(1):342-352.
[7] BOGA C, DELPIVO C, BALLARIN B, et al.Investigation on the dyeing power of some organic natural compounds for a green approach to hair dyeing[J].Dyes & Pigments, 2013, 97(1):9-18.
[8] BAKOWSKA A, KUCHARSKA A Z, 
J.The effects of heating, UV irradiation, and storage on stability of the anthocyanin-polyphenol copigment complex[J].Food Chemistry, 2003, 81(3):349-355.
[9] KOH J, XU Z, WICKER L.Blueberry pectin and increased anthocyanins stability under in vitro digestion[J].Food Chemistry, 2020, 302:125343.
[10] ANDERSEN O M, FOSSEN T.Anthocyanins with an unusual acylation pattern from stem of Allium victorialis[J].Phytochemistry, 1995, 40(6):1 809-1 812.
[11] KAZEMI M, KHODAIYAN F, HOSSEINI S S.Utilization of food processing wastes of eggplant as a high potential pectin source and characterization of extracted pectin[J].Food Chemistry, 2019, 294:339-346.
[12] ZHAO C L, YU Y Q, CHEN Z J, et al.Stability-increasing effects of anthocyanin glycosyl acylation[J].Food Chemistry, 2017, 214:119-128.
[13] CRUZ L, BENOHOUD M, RAYNER C M, et al.Selective enzymatic lipophilization of anthocyanin glucosides from blackcurrant (Ribes nigrum L.) skin extract and characterization of esterified anthocyanins[J].Food Chemistry, 2018, 266:415-419.
[14] YANG W, KORTESNIEMI M, MA X Y, et al.Enzymatic acylation of blackcurrant (Ribes nigrum) anthocyanins and evaluation of lipophilic properties and antioxidant capacity of derivatives[J].Food Chemistry, 2019, 281:189-196.
[15] FEI P, ZENG F S, ZHENG S Y, et al.Acylation of blueberry anthocyanins with maleic acid:Improvement of the stability and its application potential in intelligent color indicator packing materials[J].Dyes & Pigments, 2021, 184:108852.
[16] LIU J, ZHUANG Y, HU Y, et al.Improving the color stability and antioxidation activity of blueberry anthocyanins by enzymatic acylation with p-coumaric acid and caffeic acid[J].LWT-Food Science and Technology, 2020, 130:109673.
[17] PINHEIRO E S R, SILVA I M D A, GONZAGA L V, et al.Optimization of extraction of high-ester pectin from passion fruit peel (Passiflora edulis flavicarpa) with citric acid by using response surface methodology[J].Bioresource Technology, 2008, 99(13):5 561-5 566.
[18] 李晓娇, 何健民, 韩德仙, 等.粗梗稠李中花色苷的提取及其理化性质和稳定性研究[J].食品与发酵工业, 2020, 46(15):208-215.
LI X J, HE J M, HAN D X, et al． Study on the extraction, physical and chemical properties and stability of anthocyanins from Padus napaulensis[J].Food and Fermentation Industries, 2020, 46(15):208-216．
[19] YANG W, KORTESNIEMI M, YANG B, et al.Enzymatic acylation of anthocyanins isolated from alpine bearberry (Arctostaphylos alpina) and lipophilic properties, thermostability, and antioxidant capacity of the derivatives[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2018, 66(11):2 909-2 916.
[20] HARBORNE J B.The natural distribution in angiosperms of anthocyanins acylated with aliphatic dicarboxylic acids[J].Phytochemistry, 1986, 25(8):1 887-1 894.
[21] HARBORNE J B.Spectral methods of characterizing anthocyanins[J].Biochemical Journal, 1958, 70(1):22-28.
[22] 古明辉, 陈虎, 李希羽, 等.苹果酸酰化对黑果枸杞花青素稳定性改善的研究[J].食品工业科技, 2017,38(23):58-63;68.
GU M H, CHEN H, LI X Y, et al.Study of improvement on stability of anthocyanin modified by malic acid acylation from Lycium ruthenicum[J].Science and Technology of Food Industry, 2017，(23):58-63;68.