倍半萜类化合物在医药、化妆品、调味品和生物能源方面具有巨大的经济价值[1-2]。法尼烯是植物产生的最简单的无环倍半萜之一，在苹果皮中分布丰富[3]。但是，它的天然合成受到植物生长的严重限制，无法满足市场需求[4]。因此，研究人员已经努力设计微生物细胞工厂以生产法尼烯[5-9]。最近，已经在大肠杆菌[5]、酿酒酵母[6]和解脂耶氏酵母[7-9]中通过设计代谢工程来生产法尼烯。与这些宿主相比，巴斯德毕赤酵母表达系统成本低、周期短、表达量高且可高密度培养，具有大规模生产α-法尼烯的潜力。一些研究已经证明，巴斯德毕赤酵母是生产类异戊二烯的合适宿主[10]。然而，目前没有报道描述巴斯德毕赤酵母中α-法尼烯的异源生产。
在本项研究中，首先成功构建了产α-法尼烯的巴斯德毕赤酵母重组菌株。然后揭示了巴斯德毕赤酵母甲羟戊酸途径和α-法尼烯合成途径中限速步骤。之后对限速酶组合过表达并优化基因拷贝数以平衡代谢途径逐步提高α-法尼烯产量。最后通过外源添加不饱和脂肪酸促进α-法尼烯分泌到细胞外，在摇瓶中最终获得α-法尼烯产量约1.40 g/L[0.32 g/g 细胞干重(dry cell weight，DCW)]。这些策略提供了增强巴斯德毕赤酵母中α-法尼烯生产的有效方法，并为其他增值化学品的生物生产提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒
酿酒酵母S288C、大肠杆菌DH5α、野生型巴斯德毕赤酵母X33、大肠杆菌-酵母穿梭质粒PGAPZA，购自Invitrogen。
1.2 试剂与仪器
限制性内切酶，Thermo Scientific；Taq DNA聚合酶、DNA Marker、DNA切胶回收试剂盒、T4DNA连接酶，TaKaRa；PCR引物、质粒快速提取试剂盒，上海生工；酵母基因组提取试剂盒，康为世纪；博来霉素、遗传霉素，Invitrogen；标准品β-法尼烯、玻璃珠，Sigma；正十二烷，罗恩试剂；油酸、硬脂酸、棕榈酸、亚麻酸、亚油酸、棕榈油酸均为国药分析纯。
台式高速冷冻离心机，德国Sigma公司；真空冷冻干燥机，日本Toshiba公司；高效气相色谱仪，日本Shimadzu公司；电脉冲基因转移仪，美国BIO-RAD公司。
1.3 培养基
LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠5；YPD培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10；BMDY培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，YNB 13.4，生物素0.5，磷酸钾缓冲液100 mmol/L (pH 6.0)。
1.4 重组质粒以及菌株的构建
表1和表2列出了该研究中使用的巴斯德毕赤酵母重组菌株和质粒。利用GENEWIZ对来自苹果(Malus domestica)的α-法尼烯合成酶(α-farnesene synzyme，AFS)基因(Gene ID：103446592)进行了密码子优化和合成。所有酶表达载体均基于PGAPZA载体插入了相应表达基因。ERG10，ERG13，ERG12，ERG8，ERG19，IDI1，ERG20分别从巴斯德毕赤酵母X33基因组中扩增相应基因。tHmg1从酿酒酵母S288C中扩增被截短的HMG1(Gene ID：854900)。AFSLERG20是AFS和ERG20的融合基因，两个基因之间用GSG 3个氨基酸连接。重组质粒通过使用Avr II酶切线性化然后将其整合到巴斯德毕赤酵母X33基因组上。
表1 本研究使用的菌株
Table 1 The strains used in this study
菌株描述来源X33Wild-type strainInvitrogenF1Strain X33 harboring plasmid PGA1本研究F2Strain X33 harboring plasmid PGA2本研究F3Strain X33 harboring plasmid PGA3本研究F4Strain X33 harboring plasmid PGA4本研究F5Strain X33 harboring plasmid PGA5本研究F6Strain X33 harboring plasmid PGA6本研究F7Strain X33 harboring plasmid PGA7本研究F8Strain X33 harboring plasmid PGA8本研究F9Strain X33 harboring plasmid PGA9本研究F10Strain X33 harboring plasmid PGA10本研究F11Strain X33 harboring plasmid PGA11本研究F12Strain X33 harboring plasmid PGA12本研究F13Strain X33 harboring plasmid PGA13本研究F14Strain X33 harboring plasmid PGA13 and PGA14本研究F15Strain X33 harboring plasmid PGA13 and PGA15本研究F16Strain X33 harboring plasmid PGA13 and PGA16本研究
表2 本研究中使用的质粒
Table 2 The plasmids used in this study
质粒描述来源PGAPZAZeocinr, Expression vector with PGAP promoterInvitrogenPGA-KKanar, Expression vector with PGAP promoter本研究PGA1PGAPZA carrying gene AFS from Malus domestica, AFS codon optimized本研究PGA2PGAPZA carrying gene AFS and tHmg1 from S. cerevisiae S288C本研究PGA3PGAPZA carrying gene ERG10, tHmg1 and AFS本研究PGA4PGAPZA carrying gene tHmg1,ERG13 and AFS本研究PGA5PGAPZA carrying gene tHmg1,ERG12 and AFS本研究PGA6PGAPZA carrying gene tHmg1,ERG8 and AFS本研究PGA7PGAPZA carrying gene tHmg1,ERG19 and AFS本研究PGA8PGAPZA carrying gene tHmg1,IDI1 and AFS本研究PGA9PGAPZA carrying gene tHmg1,ERG20 and AFS本研究PGA10PGAPZA carrying gene tHmg1 and AFSLERG20(a fusion gene AFS and ERG20 with a GSG linker between AFS and ERG20)本研究PGA11PGAPZA carrying gene tHmg1, AFS and AFSLERG20本研究PGA12PGAPZA carrying gene tHmg1,IDI1 and AFSLERG20本研究PGA13PGAPZA carrying gene tHmg1,ERG19 and AFSLERG20本研究PGA14PGA-K carrying gene IDI1 and an extra of IDI1本研究PGA15PGA-K carrying gene IDI1本研究PGA16PGA-K carrying gene IDI1, an extra of IDI1 and AFSLERG20本研究
1.5 巴斯德毕赤酵母的转化和筛选
按照JOAN等[11]的方法进行巴斯德毕赤酵母感受态细胞的制备和电穿孔。30 ℃、90 r/min复苏1 h，涂在含有100 mg/L博来霉素或者400 mg/L遗传霉素G418的YPD板上以筛选重组菌落。使用酵母基因组提取试剂盒提取酵母基因组，并通过PCR验证基因整合到基因组中。
1.6 细胞干重测定
取1 mL发酵液12 000 r/min离心弃上清液，用清水洗涤2次后于烘箱中90 ℃烘干至恒重,得到菌体干重。
1.7 α-法尼烯含量的测定
按照LIU等[9]的方法进行α-法尼烯含量的测定。收集两相培养物的上层有机相，并以12 000 r/min离心10 min以去除细胞碎片，然后使用日本Shimadzu GC-2010 Plus配备有火焰离子化检测器的气相色谱仪，以1∶20的分流比进样，并在db-17色谱柱(30.0 m×0.32 mm，0.25 μm)上分离出1 μL样品。烤箱温度最初在80 ℃下保持1 min，然后以15 ℃/min的速度升至245 ℃保持1.5 min，以相同的速度升温至280 ℃后运行时间为5 min。氦气用作载气，入口压力为96 kPa。探测器温度保持在250 ℃。通过比较样品和β-法尼烯标准品的峰面积进行定量分析。
1.8 重组毕赤酵母摇瓶培养
将重组菌接种于10 mL YPD培养基中，30 ℃、200 r/min 下培养17 h作为种子液。以10%接种量接种于50 mL BMDY培养基的500 mL摇瓶进行摇瓶培养72 h。培养基中添加体积分数为10%正十二烷来收集α-法尼烯。不饱和脂肪酸包括油酸、亚油酸、亚麻酸、棕榈油酸(均为液态)，直接加入培养基中。饱和脂肪酸包括硬脂酸和棕榈酸(均为固体颗粒)，为保证其在培养基中能够均匀地分散，将其溶于200 μL无水乙醇后进行添加，因此对于饱和脂肪酸，对照组应加入200 μL的乙醇。每组试验设置3个平行，分别测定α-法尼烯产量和菌体干重。
2 结果与分析
2.1 巴斯德毕赤酵母中α-法尼烯生物合成途径的构建
通过GENEWIZ对来源于苹果的法尼烯合成酶基因(AFS)进行了密码子优化和合成。构建了组成型表达质粒PGAPZA-AFS，通过Avr II将其线性化并整合到巴斯德毕赤酵母的基因组中从而获得重组菌株F1。仅使用少量线性化质粒(500 ng/80 mL 细胞)来确保单拷贝整合的通用性[12]。将重组菌株在BMDY培养基中培养72 h，其中分别覆盖体积分数为10%的十二烷以收获产物。GC/GC-MS分析表明(图1)，在菌株F1中观察到法尼烯产量为(451.13±18.92) mg/L。先前的研究表明，来源于苹果的α-法尼烯合成酶在大肠杆菌中α-法尼烯的产量为1.56 mg/L[3]，在酿酒酵母中为4 mg/L[20]，在解脂耶氏酵母中为0.13 g/L[9]。研究结果表明，重组毕赤酵母中α-法尼烯的产量是远高于其他宿主。这可能是与巴斯德毕赤酵母外源蛋白表达水平高，高密度培养特性有关[21]。此外，菌株之间的生产能力差异很大也突出了巴斯德毕赤酵母合成α-法尼烯的优越性。
a-气相色谱图；b-质谱图
图1 重组菌株F1合成的α-法尼烯气相色谱以及质谱图
Fig.1 GC/GC-MS of α-farnesene synthesized by
recombinant strain F1
2.2 揭示甲羟戊酸途径和α-法尼烯合成途径中的限速步骤
截短的HMG1(tHmg1)基因可以有效解除胆固醇合成途径中麦角固醇等的反馈抑制[13]，过表达tHmg1通常认为是有益于类异戊二烯在酵母中生产[14]。为了改善α-法尼烯在毕赤酵母中的生物合成，在菌株F1基础上成功地过表达tHmg1得到菌株F2。菌株F2显示α-法尼烯的产量达到(0.53±0.01) g/L，比F1中观察到的产物水平提高约18%。
研究表明，tHmg1与甲羟戊酸(mevalonate ，MVA)途径以及α-法尼烯合成途径其他基因的共过量表达可能会使α-法尼烯的产量进一步提高[15]。在此，将tHmg1分别与MVA途径与α-法尼烯途径(图2)中涉及到的8个基因ERG10、ERG13、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1、ERG20、AFSLERG20进行组合过表达(图3)，并探究对α-法尼烯合成的影响，从而确定了限速步骤。所有的基因都整合到毕赤酵母的基因组中，并以强组成型启动子PGAP表达。与菌株F2相比，菌株F7、F8、F10、F11的α-法尼烯浓度增加了约37.13%～55.24%(图3)。在F10/F11中，tHmg1和AFSLERG20组合过表达显示最高的α-法尼烯产量为(0.70±0.03) g/L，其次是tHmg1和IDI1/ERG19组合过表达。然而，F11是在F10中额外过表达AFS，几乎没有增加α-法尼烯的产生，说明此时AFS可能不是α-法尼烯合成途径中的限速基因。同时tHmg1与ERG8/ERG10/ERG12/ERG13/ERG20基因的过表达导致α-法尼烯产量仅产生细微的变化(图3)，可能是由于过表达导致中间体的积累和途径不平衡[7,16]。结果表明，tHmg1，IDI1，ERG19，AFSLERG20是MVA途径和α-法尼烯合成途径的限速酶基因，过表达后可改善巴斯德毕赤酵母中α-法尼烯的合成。
图2 α-法尼烯的生物合成途径
Fig.2 The biosynthetic pathway of α-farnesene
注：二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)，
异戊二烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)，牻牛儿焦磷酸(geranyl
pyrophosphate，GPP)，法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，FPP)
图3 tHmg1与MVA途径和α-法尼烯合成途径基因分别
组合过表达对巴斯德毕赤酵母中α-法尼烯产生的影响
Fig.3 Effect of overexpression of tHmg1 in combination with
genes of the mevalonate pathway and α-farnesene synthesis
pathway on the production of α-farnesene in P.pastoris
注：“+”代表包含对应的基因；“-”代表不包含对应的基因(下同)
2.3 过表达甲羟戊酸途径以及α-法尼烯合成途径限速酶促进α-法尼烯的合成
结果表明，tHmg1与AFSLERG20组合过表达对系统的贡献最大，其次是tHmg1与IDI1/ERG19。基于这些结果，选择了tHmg1，IDI1，ERG19和AFSLERG20这4个关键酶基因，通过3个或者3个以上组合过表达尝试进一步提高菌株中α-法尼烯的产量。在菌株F12中，tHmg1，IDI1和AFSLERG20的组合过表达，α-法尼烯的产量与菌株F10相比分别提高约25.96%(图4)。有趣的是，菌株F13中tHmg1，ERG19和AFSLERG20组合过表达与对照菌株F10相比，α-法尼烯产量反而降低约18.57%(图4)。菌株F13是在F10的基础上过表达ERG19，推测可能是由于F13具有更高水平的ERG19酶的表达以造成有毒中间体IPP的积累，从而导致α-法尼烯产量降低[5]。
异戊烯基二磷酸异构酶(由IDI1基因编码)催化IPP向DMAPP的异构化，并在GPP和FPP通量的分布中起关键作用[15]。为了验证猜想，通过在菌株F13引入1～2个拷贝IDI1基因，分别产生菌株F14和F15。菌株F14和F15的α-法尼烯产量达到约1.00 g/L，这暗示着平衡IPP和DMAPP池可能在增强倍半萜生物合成的碳通量中起重要作用。除此之外，构建了菌株F16，在F15基础上额外过表达1个拷贝AFSLERG20，α-法尼烯产量进一步提高，如图4所示，达到(1.09±0.02) g/L(菌株F1的2.42倍)。上述一系列组合的结果表明，优化MVA途径限速酶基因的组合表达可以有效地促进毕赤酵母中倍半萜的异源生物合成。同时也揭示了在微生物宿主中建立高效的萜类化合物途径，必须小心平衡途径中上下游代谢通量以避免有毒中间代谢物的积累。
图4 限速酶基因组合过表达以及基因拷贝数优化对
巴斯德毕赤酵母中α-法尼烯产生的影响
Fig.4 Effects of rate-limiting enzyme gene combination
overexpression and gene copy number optimization on the
production of α-farnesene in P.pastoris
2.4 添加不饱和脂肪酸促进α-法尼烯的分泌
小分子的萜类化合物，例如倍半萜和类黄酮，通常被分泌到细胞外[6]。然而，有限的细胞膜通透性是倍半萜分泌的障碍[6]。各项研究表明，增大不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid，UFA)/饱和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)的比例有助于增加有毒物质跨膜的膜通透性[6, 17-19]。同时，酵母细胞可以很容易地从培养基中吸收外源UFA和SFA，并迅速整合到膜脂质中[19]。因此，通过向菌株F16培养基中外源添加脂肪酸，来试图提高巴斯德毕赤酵母中α-法尼烯的产量。最初添加了10 mmol/L不饱和脂肪酸油酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)、亚麻酸(C18∶3)、棕榈油酸(C16∶1)、饱和脂肪酸硬脂酸(C18∶0)和棕榈酸(C16∶0)于菌株F16的培养基中，首先确定了不同脂肪酸对重组菌株的α-法尼烯产量以及对细胞生长的影响。如图5所示，除了亚油酸，其他不饱和脂肪酸对α-法尼烯产量的提高均有积极影响，其中油酸的积极作用尤为显著。之前的研究[19]和本研究都观察到添加饱和脂肪酸对异戊二烯产量的增加并没有积极影响。脂肪酸的添加可以促进菌体的生长，这种促进作用仅存在于3种不饱和脂肪酸中，饱和脂肪酸对菌体生长均没有促进作用(图5)。此外，亚油酸虽然对菌体生长有积极作用，然而对MVA途径似乎没有促进作用，这可能归因于菌体对脂肪酸的利用有偏好性和菌株对不饱和脂肪酸氧化压力的耐受能力不同[19]。因此选择油酸来促进α-法尼烯的分泌。为了最大程度地提高毕赤酵母中α-法尼烯的产量，优化了油酸添加浓度。如图6所示，确定向细胞提供20 mmol/L的油酸获得最佳的α-法尼烯产量约为1.40 g/L，收率约为0.07 g/g，生产率约为0.019 g/(L·h)。α-法尼烯产量是出发菌株F1的3.1倍。
图5 外源添加不同脂肪酸对巴斯德毕赤酵母中
α-法尼烯合成的影响
Fig.5 The effect of different fatty acids on the synthesis of
α-farnesene in P.pastoris
图6 外源添加油酸的最适浓度
Fig.6 Optimal concentration of oleic acid
3 结论与讨论
本研究是首次以发酵周期短，易高密度培养特性的巴斯德毕赤酵母作为底盘微生物细胞来生产α-法尼烯，揭示了MVA途径和α-法尼烯合成途径中限速步骤，对限速酶组合过表达并优化基因拷贝数以平衡代谢途径逐步提高α-法尼烯产量，最后通过外源添加不饱和脂肪酸促进α-法尼烯分泌到细胞外，在摇瓶中菌株F16最终获得α-法尼烯产量约1.40 g/L(0.32 g/g DCW)，生产率约为0.019 g/(L·h)。在摇瓶水平上，菌株F16的α-法尼烯生产率是解脂耶氏酵母[9]的1.38倍，大肠杆菌[3]的2.4倍，酿酒酵母[22]的3.8倍。尽管巴斯德毕赤酵母工程菌中α-法尼烯产量显著提高，但是竞争途径[13]以及代谢串扰[23]仍然是阻止目标化合物有效合成的障碍。因此，减弱竞争途径和代谢串扰将是未来努力的方向。总之，以巴斯德毕赤酵母作为底盘微生物生产α-法尼烯是非常有前景的，为大规模发酵生产α-法尼烯提供新的希望。
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