鱿鱼(Dosidicus gigas)是软体动物头足纲的海洋经济动物,生命周期短，繁殖力强，富含高蛋白和多种必需氨基酸,是一种低脂肪的水产品[1]。2019年我国鱿鱼捕获量为29.2万t,约占全年海洋捕捞量的2.8%[2],是重要的水产品加工组成部分。在鱿鱼加工过程中产生大量下脚料,如鱿鱼内脏,占其鲜重约15%,直接丢弃不仅浪费资源,而且还会造成环境污染[3-6]。鱿鱼内脏营养丰富,富含脂肪、蛋白质和铁、钙、磷；特别是内脏油脂脂肪酸中含有10.58%的EPA和15.23%的DHA[7-8]。此外,鱿鱼皮蛋白含量丰富,有多种维生素、矿物元素和氨基酸[9]；将鱿鱼皮与内脏混合粉碎后进行蛋白酶酶解,可用于生产新型的海鲜酱汁[10-11]。所得酶解液通过美拉德生香反应,既去除了腥味和酶解后的苦味,又增添了肉香味[12]。
本研究以鱿鱼下脚料(鱿鱼内脏和鱿鱼皮)为原料,通过生物酶解法,将鱿鱼下脚料中富含的蛋白质水解为氨基酸,然后进行美拉德增香反应,再配以辅料蒸煮,研制一种风味独特富含营养的海鲜风味调味品。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鱿鱼下脚料,宁波市飞润海洋生物有限公司；碱性蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶,索莱宝科技有限公司；氢氧化钠、乙酸、乙醚、乙酸钠、丙酮、甲醛、乙酰丙酮、D-木糖、D-葡萄糖、L-谷氨酸,罗恩生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
DF-6CD型磁力搅拌水浴锅,常州市亿能实验仪器厂；H1650型台式高速离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Five Easy Plus pH计,Mettle Toledo仪器有限公司；L5S型紫外可见光分光光度计,上海精密仪器仪表有限公司；ME104E型电子天平,Mettle Toledo仪器有限公司；L-8900型全自动氨基酸分析仪,日立HITACHI；7890B型气相色谱-飞行时间质谱仪,美国LECO公司。
1.3 试验方法
1.3.1 海鲜酱汁的生产工艺
鱿鱼下脚料→捣碎匀浆→酶解→灭酶→过滤、离心→水解液→美拉德生香反应→加辅料调配风味→搅拌、均质、浓缩→包装(软包装)→灭菌(高压杀菌釜)→成品
1.3.2 氨基态氮含量测定
按GB/T 5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》进行测定。
1.3.3 游离氨基酸含量分析
按GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》进行测定。
1.3.4 风味成分分析
采用SPME固相微萃取GCxGC-TOFMS法进行分析测定。
1.3.4.1 SPME方法下GC×GC-TOFMS的条件
第一维柱DB-WAX(30 m×250 μm,0.25 μm)；进样温度250 ℃；初始温度40 ℃保留5 min,以4 ℃/min升至220 ℃,然后以10 ℃/min升至250 ℃,保留 5 min；氦气(99.999 9%)1.0 mL/min；分流比5∶1；二维柱DB-17MS(2 m×100 μm,0.10 μm)；柱温高于第一维柱10 ℃；调制解调器温度始终高于第二维柱15 ℃；全二维分析时调制周期6.0 s；接口温度270 ℃；离子源温度220 ℃；电子轰击源70 eV；检测器1 680 V；采集率50张/s；质谱扫描范围m/z 33～500；NIST谱库。
1.3.4.2 SPME样品处理
取样品放于顶空瓶中。然后采用DVB/CAR/PDMS纤维头1 cm,对样品进行SPME萃取。60 ℃下孵育10 min,萃取40 min,在GC进样口中脱吸附5 min。然后按照设定参数进行GC×GC-TOFMS分析。
1.4 工艺优化试验说明
1.4.1 酶解工艺
取质量比为3∶1的鱿鱼内脏与鱿鱼皮混合物于反应罐中,按1∶1(g：mL)的比例加水稀释,调节pH,加入生物酶,置于恒温磁力搅拌器中进行酶解反应。反应结束立即进行100 ℃沸水浴灭酶,冷却后罐装储存。
1.4.2 酶制剂的筛选
以鱿鱼下脚料混合液为底物,分别添加0.4%中性蛋白酶、0.4%碱性蛋白酶、0.4%风味蛋白酶以及0.2%中性蛋白酶与0.2%风味蛋白酶、0.2%碱性蛋白酶与0.2%风味蛋白酶(均为质量分数,下同),选择pH 7(风味蛋白酶)或8.5(碱性蛋白酶),温度50 ℃条件下酶解5 h。以氨基态氮为评价指标,比较各种蛋白酶及其组合对鱿鱼下脚料水解效果的影响,筛选较优酶制剂或组合。
1.4.3 复合酶配比的影响
在酶解时间5 h,温度50 ℃,pH 8.5,酶添加量0.4%,控制风味蛋白酶与碱性蛋白酶质量比为1∶1、1∶2、1∶3进行复配,以氨基态氮为评价指标,研究复合酶比例对鱿鱼下脚料酶解效率的影响。
1.4.4 酶添加量的影响
在50 ℃下,pH 7或8.5,酶解5 h,分别添加质量分数为0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的酶,以氨基态氮为评价指标,比较酶添加量对酶解效率的影响。
1.4.5 酶解时间的影响
在50 ℃下,pH 7或8.5,添加0.4%的酶,分别酶解4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 h,以氨基态氮为评价指标,比较酶解时间对酶解效率的影响。
1.4.6 酶解温度的影响
在pH 7或8.5,酶解5 h,添加0.4%的酶,分别在45、50、55、60、65 ℃条件下,以氨基态氮为评价指标,比较酶解温度对酶解效率的影响。
1.4.7 酶解工艺参数的正交优化
在单因素试验基础上,采用正交试验对酶解工艺参数进行优化,以氨基态氮为评价指标,综合考虑复合酶配比,酶解温度、酶解时间对鱿鱼下脚料酶解效果的影响。
表1 酶解过程正交试验L933设计表
Table 1 Factor and levels of enzymolysis process orthogonal array L9(33) design
水平因素酶配比(A)反应时(B)/h反应温度(C)/℃13∶14.55022∶15.05531∶15.560
1.5 美拉德反应工艺优化
1.5.1 美拉德反应工艺
取上述实验酶解液离心后的上清液经过活性炭振荡吸附24 h,再次离心,取10 mL上清液置于烧杯中,加水稀释至100 mL,调节pH,并添加一定量的D-木糖、D-葡萄糖和L-谷氨酸,搅拌均匀后放入油浴锅进行反应。反应结束后冷却到室温,进行感官评价。
1.5.2 美拉德反应工艺优化
鱿鱼下脚料酶解液美拉德反应的固定反应条件为还原糖30 g/L。在单因素预实验基础上,以感官评定为评价指标,设计关于反应pH、反应温度、反应时间以及氨基酸添加量的正交试验,优化美拉德反应的工艺参数。
表2 美拉德反应工艺正交试验L934设计表
Table 2 Factor and levels of Maillard reaction process orthogonal array L934 design
水平因素A(pH)B(反应时间)/minC(反应温度)/℃D(氨基酸添加量)/%17.080100128.0100110239.01201203
表3 美拉德反应产物感官评价标准
Table 3 Sensory evalution standard of Maillard reaction products
项目感官描述评分标准/分色泽(0.15)浅褐色,澄清透明7～10棕褐色,澄清透明3～6黑褐色,澄清透明0～2鲜香(0.4)浓郁鱼香,鲜美无腥味7～10有鱼香鱼鲜味,无腥味3～6有腥味略有鱼味0～2焦香(0.45)浓郁焦香且无糊味7～10有焦香,略有糊味3～6略有焦香有腥味0～2
1.6 数据处理
每组实验平行测定3次,实验数据采用SPSS 25.0及Excel 2019 统计软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 酶解单因素试验条件的确定
不同水解酶的特性能够影响鱿鱼下脚料酶解产物的品质与风味。碱性蛋白酶具有较强分解蛋白的能力,在水产资源上有一定的优越性[13-14]。由图1-a可以得到碱性蛋白酶与风味蛋白酶复配,有较好的酶解效率。此外,在使用碱性蛋白酶的情况下复配使用风味蛋白酶,能够起到掩蔽苦味,降低腥味的作用[15-16]。
由图1-b可知,在酶添加量达0.8%时,达到游离氨基态氮含量较高值,随后酶添加量的增加未显著增加酶解效果。酶添加量是生产工艺中重要的成本影响因素,为了完全酶解并且不造成额外成本,应选择酶添加量0.8%左右。
由图1-c可知,在5 h时,达到游离氨基态氮含量最高值。酶解时间是生产工艺中重要的成本影响因素,为了充分酶解并且取得最大效益,酶解时间应选择在5 h左右。
酶解温度也是生产工艺影响品质且影响成本的重要因素,由图1-d可知,为了取得良好收益,酶解温度应选择在55 ℃左右。
a-不同水解酶及组合的影响,b-酶添加量的影响,c-酶解时间的影响,d-酶解温度的影响
图1 不同因素对酶解效果的影响
Fig.1 Effect of different factors on enzymatic hydrolysis
2.2 酶解工艺的优化
在单因素试验的基础上,综合考虑酶解效果及辅料成本,进行正交试验设计。L933正交试验设计及结果见表4。在所选定的因素中,C(酶解温度)对酶解的影响最大,而酶配比和酶解时间对酶解的影响较小。将K值进行比较,可知A2B1C2为最佳工艺参数,该工艺条件下的酶解液中游离氨基态氮含量可达1.085 mg/100 mL。与同类型海鲜酶解实验比较,田爱民等[17]的鱿鱼内脏酶解实验工艺定在50 ℃下酶解6 h,陈美龄等[18]的鱿鱼调味品酶解工艺条件为50 ℃下酶解4 h；常钰菲等[19]在关于鳕鱼酶解的实验中选择55 ℃下酶解4 h作为最优条件；王红丽等[20]在对虾下脚料的酶解实验中选择50 ℃下酶解4.5 h作为最佳工艺参数。本实验选择的最佳工艺参数在一个合适的区间范围内。
表4 酶解正交试验L933设计及结果
Table 4 Design and results of enzymolysis process L9(33) orthogonal array
处理号ABC游离氨基态氮/(μg·mL-1)111196.612221107.273331102.784322132.795212165.056132125.78712391.84823393.809313106.14K1314.22367.80306.65K2366.12331.89423.62K3341.71322.36291.78R51.8945.44131.84
2.3 美拉德反应工艺的优化
在预实验的基础上,以美拉德反应得物的感官评定得分为评价标准,以420 nm紫外分光吸光度为参考,进行正交试验设计[21]。正交试验设计表及结果见表5。所选定因素中,C(反应温度)对反应产物感官评定影响最大,影响程度依次为C(反应温度)>D(氨基酸添加量)>B(反应时间)>A(pH),并且A1B2C3D2为最优的工艺条件。
表5 美拉德反应L934正交试验设计及结果
Table 5 Design and result of Maillard reaction L9(34) orthogonal array
编号ABCD得分A420111114.810.219222215.520.628333316.10.229432125.920.268521326.990.369613226.390.711712337.210.868823135.260.086931235.560.198K118.4117.3615.9916.43K217.7718.6517.4719.3K317.5817.7520.318.03R0.831.294.312.87
2.4 风味成分的分析
将最优酶解工艺条件下的酶解液取出部分留样后,在最优美拉德工艺条件下进行美拉德反应,取部分样,与酶解样品一起进行风味物质分析,得到结果如表6。美拉德反应大量减少了胺类物质的含量,而胺类物质是鱼腥味的主要来源[22]。醇类物质的风味阈值较高,对风味影响较小；而对风味有正面影响的醛类、酮类,呋喃类、吡嗪类以及一些含硫化合物含量在美拉德反应后都有一定增长。其中烷基吡嗪带来的烘烤香增加幅度最高,总体风味中烷基呋喃贡献的蟹香味提升也较为显著。
表6 鱿鱼酶解液与美拉德液特征风味相对成分含量
Table 6 Relative content of characteristic flavor components between squid hydrolysate and Maillard reaction products
比较成分风味酶解液中含量美拉德液中含量TMA与DMA鱼腥味TMA含量3.99%,DMA含量20.54%痕量烷基呋喃蟹肉香、甜味0.32%2.4%烷基吡嗪[23]坚果香、烘烤香1.29%9.48%
3 结论
酶解技术因为条件温和,反应安全性高,蛋白酶解效率高等优点,常用于水产品下脚料加工再利用。选择合适的蛋白酶,寻找适合的酶解条件,能使鱿鱼下脚料得到最大利用。因此,本文以氨基态氮为评价指标,筛选最佳酶制剂,通过单因素与正交试验确定酶解最佳工艺参数为：风味与碱性蛋白酶质量比1∶2,酶解时间5 h,酶解温度55 ℃。在此优化条件下,获得游离氨基态氮1.085 mg/100 mL,氨基酸得率高,且大大提高了酶解效率。在此基础上进行的美拉德反应,以感官评定得分为主要指标,通过正交试验确定美拉德反应最佳工艺参数为：反应pH 7.0,反应时间100 min,反应温度120 ℃,氨基酸添加量2%。此工艺下得到的美拉德反应液颜色黑亮澄清,焦香浓郁,口味鲜香,具有开发成为海鲜酱汁的市场前景。本研究成果为鱿鱼下脚料综合开发利用提供了一个新的产品技术开发思路。
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