非热加工作为一种新兴的绿色食品加工技术,能够较好地保持食品原有的色香味品质、营养成分,并且能够延长货架期,已逐步成为食品加工领域的研究热点之一。食品非热加工技术,如超高压、超声波、高压脉冲电场、高压二氧化碳等已经应用于食品加工过程中,旨在提高食品质量和安全[1]。商用型超高压设备已在国外一些发达国家得到了产业化应用[2],国内也有企业正在研究将放大超声波设备应用于酱油生产。
超声波作为非热加工技术中的一种重要技术手段,因其设备具有简单、易放大、安全性能高和耗能低等优点,在食品行业越来越受到关注。超声波是指频率高于人类听觉阈值(20 kHz)的声波,它是一种弹性机械波,在弹性介质中传播时具有频率高、波长短、功率大、穿透力强等特点[3]。根据其频率范围可以分为低频超声波(20 k～100 kHz)、高频超声波(100 kHz ～1 MHz)和诊断超声波(1 M～10 MHz),还可以根据超声波频率和使用声强的不同分为2类,即频率大于100 kHz且声强低于1 W/cm2的低能量超声波和频率在20 k～500 kHz,声强高于1 W/cm2的高能量超声波[4-5]。超声波处理带来的空化效应、剪切效应、热效应、微扰作用和机械作用等会引起生物结构的化学和物理变化[6],可应用于食品工业中的杀菌、干燥、提取、液体食品乳化和均质等过程[5]。
传统液态发酵食品(酒、酱油、醋等)自然发酵周期一般较长,香气成熟严重滞后于滋味物质的成熟,且发酵过程中设备占地面积和劳动强度大,管理相对困难,大大降低了企业生产效率,增加了企业生产成本[7]。因此,加速液态发酵食品风味物质代谢,缩短发酵周期对企业资金周转和空间利用率都具有十分重要的意义。超声波可显著改变液态食品的风味,但不同研究者所使用的超声波条件(频率、时间、强度和模式)和研究对象存在显著差异[8-9],所得到的结果也存在显著差异。本文在分析大量前人研究结果的基础上,总结超声波在加速液态发酵食品风味成熟方面的规律和可能机理,并在此基础上提出超声波在加速液态发酵食品风味成熟中存在的问题。
1 超声波技术参数对液态发酵食品风味形成的影响
食品风味是指食物在口腔内对人的各种感觉受体的刺激并产生的一种短时的、综合的感觉。它是食品感官质量的重要指标之一,主要包括滋味和香气[10]。滋味是舌头和口腔对食物的反应,主要涉及酸、甜、苦、咸和鲜[10]。食品的香气通常由醇类、醛类、酸类、酯类、含硫化合物、含氮(氧)衍生物等产生,这些化合物含量虽低,却对食品香气具有重要作用。香气是食品极为重要的品质特征,传统的热杀菌技术会导致食品中挥发性组分和营养物质的损失。超声波作为非热加工方法,在合适的参数下,可以最大限度保持食品原有香气成分,但有时也会产生不利影响[11-12]。SIMUNEK等[13]研究了大功率超声波对苹果汁和苹果酒中香气物质的影响,发现与未处理样品相比,超声波处理后的样品中能产生新的香气物质(如2-甲基丁酸乙酯,2-己烯基2-己酸),但也能使原有的部分香气物质消失(如己酸异戊酯)。
超声波对传统液态发酵食品风味影响的研究在国内外取得了一定的进展。酒类发酵过程中不断增加的溶解CO2会抑制乙醇和酯类的生成,影响产品质量。日本大关(株)综合研究所的MATSUURA等人发现,以30 mW/cm2的弱超声波处理葡萄酒、啤酒和清酒时,可以降低发酵过程中溶解CO2水平,增加酒样中高级醇和酯的含量,缩短大约一半的发酵时间[14-15]。GOH等[16]对实验室发酵的酱醪进行连续10 min的超声波处理(每天1 次/7 d),7 d后超声处理酱醪中谷氨酸、天冬氨酸含量显著高于对照酱油,并且滋味物质成熟时间缩短了57%。于淑娟等[17]用超声波频率40 kHz、功率为10 W、每10 h超声15 min,对酱油进行处理后,酱油的氨基酸和氨基酸态氮含量大幅提高,并缩短了至少1个月的发酵周期。由此可知,超声波处理可显著改变液态发酵食品的风味。
1.1 超声波功率对液态发酵食品风味的影响
超声波功率对液态发酵食品风味形成具有显著的影响。在一定范围内,超声波功率越大,超声波的催陈效应越强烈,分子扩散速度也越快,加速各催化分子间的重新缔合；但功率过大时,会导致部分物质的降解、转化和挥发,影响食品口感和品质,其对液态发酵食品风味物质形成的影响见表1[18-20]。
表1 不同超声波条件对液态发酵食品风味形成的影响
Table 1 Effects of different ultrasonic conditions on the flavor formation of liquid fermented foods
超声波条件实验对象主要结果与分析参考文献超声波功率80、100、120、140、160、180、200 W食醋(100 mL)随超声波功率的增加,食醋中总酯含量不断上升并趋于稳定,表明超声波功率在一定范围内可以加速食醋中酸类和醇类的酯化反应。[18]50、90、130、170、210、250 W燕麦黄酒(150 mL)随超声波功率的增大,醇类物质活度降低,加快了醇氧化成醛酸的反应,醇类物质含量呈递减趋势。醇、醛类氧化为酸类物质的平均速率远大于酸形成酯类物质的速率,总酸含量呈上升趋势。超声波功率越大,酒体瞬间温度越高,促进了低沸点物质的挥发,酯类在生成的同时,有很大一部分挥发损失,其含量先上升后下降。[19]90、180、360、540、720 W蓝莓酒(150 mL)在试验功率范围内,与新酒相比,超声酒样中总酯含量均有所增加。因为超声波在为酒体提供能量的同时,还加速了酒中醇、醛、酸等成分之间的氧化、缩合及酯化反应;随着超声波功率的增大,酒中总酯含量呈现先增加后减小的趋势,可能是因为随着超声波功率的增大,超声波能量过大使酒体温度迅速升高造成部分酯类挥发。[20]超声波时间发酵过程中(酶解发酵半年)鱼露(100 mL)特征风味物质的相对含量有所增加,如乙酸增加27.09%、2-甲基丁酸增加3.33%、3-甲基丁醛增加了5.53%、3-甲硫基丙醛增加了 0.16%、呋喃类增加了1.86%,有效的改善了酶解半年鱼露缺乏鱼露特征挥发性风味的状况。与成熟鱼露相比,酸、醛和酯类的相对含量增加,醇类的相对含量大大减少,这是由于超声波的空化效应产生的瞬时高温高压促进了鱼露内部的氧化和酯化反应。[21]后发酵第2天至结束黄酒在后酵过程中进行循环超声波处理能使黄酒提前达到发酵终点时的风味。醪液中氨基酸和酯类总含量都高于未经超声波处理的样品,可能是因为超声波促进了后期酵母等微生物的自溶及醪液中蛋白质的分解并加速酯化反应的进行。[23]10、20、30、40、50 min青梅酒(300 mL)相同超声波频率下,青梅酒经360 W超声处理50 min后的感官评分要低于处理30 min的青梅酒,酒中风味物质特别是酯类物质减少,这可能与超声波的热效用会加速酯的蒸发有关。[24]10、20、30、45 min蜂蜜酒(150 mL)前20 min,酒样中总酸含量较未处理样品下降了55.68%(显著),而后随处理时间的延长逐渐趋于平稳,总酯含量随超声波作用时间延长出现大幅度下降。推测可能是由于超声波处理对酒体施加外来能量场,破坏了其原来的平衡,导致其酯类主要向分解反应的方向进行,从而出现总酯含量降低的现象。[25]10、20、30、40、50、60、90、120 min浓香白酒(200 mL)随着处理时间延长,酒精度呈下降趋势,总酸含量则是先降低后增加,总酯含量在0～10 min、20～30 min、50～60 min时出现波动性变化,60 min之后逐渐上升。酒精度降低的主要原因可能是超声波促进乙醇发生成酸成酯反应;总酸含量有升有降的原因可能是超声波处理时间较短时,某些酸与乙醇的成酯作用较强,导致总酸减少,随着处理时间的延长,乙醇氧化成醛、酸,总酸含量升高;总酯含量呈现波动性变化的原因可能与酯化反应的动态平衡有关。[26]
续表1
超声波条件实验对象主要结果与分析参考文献超声波频率20 kHZ、1.6 MHz糯米酒处理相同次数时,与自然陈化1年的糯米酒相比,20 kHZ下乙醛含量降低幅度和乙酸乙酯含量增加幅度都较1.6 MHz条件下小,而多元醇含量降低程度较1.6 MHz条件下大,低频超声波效果优于高频超声波。[27]25 k、40 k、80 kHz蓝莓酒(150 mL)与对照相比,随着超声波频率的增大,果酒中总酯含量逐渐增加。[20]20 k、24 k、28 k、32 k、36 kHz枇杷果酒(200 mL)总酸含量随着超声波频率的增加呈下降趋势,果酒酸味感略降。推测可能与超声波频率的增大加速了果酒中的部分酸与醇类形成酯类物质有关。[28]超声波模式20 kHz+28 kHz豉香型白酒(50 mL)双频超声波同时作用下,更有利于酯化反应的发生,酒样中乳酸乙酯含量增大,乙酸含量减少,口感效果优于传统酒样。[29]
在一定超声波功率范围内(5～120 W/L),合适的超声波强度可以加速风味物质(如酸类和酯类)的形成,但过高的超声波功率(>200 W/L)可能会促进某些香气物质的消失(如酯类)。此外,功率的单位目前仍然不统一。因此,用统一的功率单位,相同的食品体系内进行比较,数据和结论才更可靠。
1.2 超声波时间对液态发酵食品风味的影响
超声波处理时间和超声波时间段对食品风味形成具有显著影响。HASHEMI等[21]发现对未发酵的酸奶进行超声波处理会导致样品中蛋白酶浓度、肽含量和抗氧化活性增加；在发酵开始时对样品进行连续超声波处理或脉冲超声波处理,除75%的振幅连续超声波处理的样品外,所有进行超声波处理的发酵样品中蛋白酶活性、肽产物和自由基清除活性均有所提高,改善了发酵乳的品质。总的来说,超声波预处理和发酵之间存在正相互作用。肖宏艳等[22]和孟祥勇等[23]还分别在产品发酵中期和后期进行超声波处理,发现对产品风味也有一定的影响(见表1)。
超声波处理的不同时机和超声处理时间均对液态发酵食品风味具有重要影响。大量实验表明,在合适的超声波强度下,超声波处理时间过长(60～120 min)可能会导致酯类减少,适宜的超声波作用时间(10～40 min)对加快酯类物质的生成及其稳定性十分重要,具体见表1[24-26]。另外,不同样品的最佳超声波处理时间存在差异,需要针对具体样品的特性进行具体分析。
1.3 超声波频率对液态发酵食品风味的影响
超声波频率对液态发酵食品风味物质形成具有重要的影响。乙醛沸点较低,具有辛辣刺激性气味,而乙酸乙酯是酒精饮料中一种受欢迎的果香味化合物。高级醇(多元醇)如1-丙醇、2-甲基-1-丙醇、2,3-二甲基丁醇和甲醇通常具有米油风味,并在口中产生油腻感。多元醇含量降低程度较小时,再加上乙酸乙酯含量的显著增加和乙醛含量的显著减少,糯米酒会产生辛辣、发酸、不柔和的风味。CHANG[27]的研究表明糯米酒在20 kHz超声波频率下的效果优于1.6 MHz超声波频率,说明低频超声波在加速糯米酒风味成熟中的效果要优于高频超声波(具体见表1)。刘美玲[20]和袁敏等[28]还指出,随着超声波频率的增大,促进了酒中酸类和醇类物质酯化反应的进行,导致总酸含量减少,总酯含量增多。
超声波陈化具有替代传统陈化方法的潜力,合适的超声波频率(20 k～80 kHz)可促进液态发酵食品中酯类物质的形成,减少风味高级醇含量。这是由化合物中不同化学键对超声波频率的敏感性不同造成的,也就是说超声波频率与化学键之间可能存在某种“选择性”。因此,深入研究超声波频率与化学键之间的这种“选择性”,对利用超声波处理技术控制液态发酵食品风味具有重要意义。
1.4 超声波模式对液态发酵食品风味的影响
超声波模式(不同超声频率组合/扫频、固定超声频率)对液态发酵食品风味的形成具有重要影响。双频超声波作用下会产生空化泡,空化泡内爆产生新的空化核,既可维持该频率的自身空化,又可为另一频率的空化提供新的空化核。双频超声波可增加介质的机械搅拌运动,有助于更多的空气经液体表面进入液体而导致空化核增加,故适当的双频超声波催陈效果要优于单频超声波(见表1)[29]。图1为单频和多频超声装置图[29]。
扫频超声波是指围绕中心频率周期性的从较低频率增加至较高频率的超声波(图2为扫频超声波的频率变化曲线)[30],而固定超声波频率,顾名思义,超声波的频率是固定不变的。扫频超声波与固定超声波一样具有空化、机械和热效应,促进蛋白质颗粒破碎完全[30]。超声波空化效应引起局部巨大的剪切力能够破坏聚合物链,导致颗粒破碎,而扫频超声波具有比固定频率超声波更大的频率范围,可以作用各种结构特点的底物[31],使酶解反应更加充分。
a-单频超声装置示意图;b-多频超声装置示意图
图1 超声装置示意图
Fig.1 Schematic diagram of ultrasound equipment
图2 扫频模式下的超声频率变化曲线
Fig.2 Frequency variation curve of sweep mode ultrasound
双频超声波和扫频超声波模式较单一频率超声波对发酵食品风味具有更积极的影响。双频超声波可通过2种频率超声波的协同作用,加快风味物质(如酯类)的生成；扫频超声波可通过作用底物的多样性来加快食品内部一系列化学反应的进行,加快食品风味成熟。
2 超声波对液体食品风味影响的机理
2.1 超声波可加速微生物细胞生长及代谢并提高膜通透性
适当的超声波可通过促进微生物生长繁殖和风味物质形成而缩短发酵时间。研究表明,低强度超声波可依靠机械振动和稳态空化效应加速细胞生长和代谢,提高酶促反应速度,加快理化反应[32-33]。低强度超声波可通过在细胞膜上形成瞬时孔来提高细胞膜的通透性,这些孔增加了物质在膜上的转移以及代谢产物如胞内酶的分泌,从而刺激了细胞的生长和增殖[32]。
GHOLAMHOSSEINPOUR等[34]对含有植物乳杆菌的发酵乳进行100 W、30 kHz、25%的振幅超声波处理后,细胞膜通透性(核酸和胞外蛋白含量)比对照提高了88%～94%。另外,随着超声波处理时间的增加(5、10、15 min),发酵结束时乳酸菌菌群数量和发酵乳中抗氧化活性(显著)增加,β-葡萄糖苷酶活性也有所提高,乳糖含量显著降低,葡萄糖、半乳糖、乳酸含量显著增加,牛奶品质进一步提高。DAI等[33]发现,28 kHz、120 W/L、1 h的超声波强度处理迟缓期的酿酒酵母,酵母的生物量增加了127.03%,还提高了膜通透性,增加了细胞外蛋白质、核酸和1,6-二磷酸果糖的含量。HUANG等[30]利用转录组测序技术从基因层面找出了低强度超声波影响热带假丝酵母增殖的关键基因,为之后超声波对微生物影响的研究提供了新的思路。
2.2 超声波可降低化学反应活化能而加快化学反应速率
适当的超声波可通过降低化学反应活化能、加快生香反应速率而加速风味化合物形成。前人研究证明超声波可降低美拉德、酯化、氧化、非氧化、聚合缩合等反应的活化能,加速香气化合物吡嗪类(如2,6-二甲基吡嗪)、含硫化合物(如3-甲基巯基丙醛)、呋喃(如3乙酰基-2,5-二甲基呋喃)、醛类(如苯乙醛)、酚类(如4-乙基愈创木酚)、酯类(如3-甲基丁酸乙酯)、酮类(如2,3-丁二酮)、内酯(如γ-丁内酯)和酸类(如乙酸)的形成[35-36]。
高强度超声波提供的较高的瞬时温度和压力环境会降低活化能,促进美拉德反应中间产物和终产物的生成[35]。YU等[36]发现超声波协同美拉德反应生成2,5-二甲基吡嗪所需的活化能显著低于热美拉德反应,这说明高强度超声波可以促进风味化合物的生成。JELENA等[37]定量研究了与热预处理和常规酶水解相比,探头型超声仪和超声清洗仪产生的超声波对碱性蛋白酶水解蛋清蛋白的影响,发现与其他方法相比,超声波预处理可以显著改善酶解效果；探头型超声预处理降低了61.7%水解活化能(Ea)、61.6%酶活失能(Ed)、63.6%焓能(ΔH)和32.2%熵能(ΔS),蛋清蛋白在不同条件下的酶水解速率显著提高。
2.3 超声波可改变酶或底物的状态而加快酶解反应速率
适当的超声波可增加底物比表面积,增加酶与底物接触机会,从而加快反应速率,加速发酵食品风味成熟。超声波的声化学作用可使蛋白质分子疏水基团暴露、蛋白质二级结构重新分布(α-螺旋结构含量降低,β-折叠和无规卷曲结构含量提高)、蛋白质微观结构改变(分子粒径减小),加快酶解反应的进行[38]。
GOH等[16]的研究表明了酱油发酵周期的缩短与超声波促进蛋白质水解酶与底物之间的反应速率有关。GAO等[39]认为在酱油发酵过程中进行超声波处理不但提高了酱醪中酸性蛋白酶酶活性,而且超声波的破碎作用增大了底物的比表面积,增加了酶与底物的反应接触面积,加快了酱油中氨基酸生成速率和含量。黄姗芬等[40]发现超声波处理胰蛋白酶后,肽键含量没有发生变化,但对其二级结构具有显著影响。200 W的超声波处理使得胰蛋白酶处于中间体状态,同时具有高酶活力和高反应速率。
2.4 超声波可改善传质过程并促进反应产物扩散进而加快反应速率
适当的超声波可以改善反应系统中的传质过程,帮助产物从反应位点扩散到溶液中其他位置,降低位点附近终产物浓度,从而加快风味产物生成速率。在酶促反应过程中,由于底物和酶都是大分子,传质过程易受限制。而超声波和酶的协同作用,可以削弱酶和底物之间的扩散阻碍,改善传质过程[41]。酶催化反应中,超声波利用空化机制帮助水解产物转移,促进酶与未分解底物的结合[41],然后促进底物向酶的扩散(即促进酶与底物的结合)和产物向溶液中的释放。
于淑娟等[17]的研究表明了超声波的空化作用能移去物料中蛋白质、淀粉表面附近的液体,减薄颗粒表面的滞留层,超声波空化效应的不断形成和消失,起到了强烈搅拌的作用,加快了物质传输。
通过以上分析可知,超声波技术在加速发酵产品风味成熟和改善产品品质方面具有广泛的应用潜力。
3 超声波加速发酵食品风味成熟存在的问题
尽管超声波技术在发酵食品风味成熟中表现出良好的效果,但仍存在如下问题：
(1)高强度和长时间的超声波使得产物可控性差。高强度和长时间超声波空化作用所产生的自由基会引发一系列化学反应,导致原有风味物质的消失和/或新化合物的形成,可能对液态发酵食品风味造成负面影响。
(2)超声波空化效应产生的局部高温高压以及自由基可导致维生素C、类胡萝卜素、花色苷等营养物质降解,过高的温度还会使发酵产品中有益微生物死亡或酶失活。
(3)超声波在固态体系中能量传递效率低,其在固态发酵食品中的应用受到限制。
(4)目前超声波设备分布不均匀、能耗和占地面积较大,尚未在工厂中进行大规模应用。
4 总结与展望
超声波在促进发酵食品风味成熟方面具有光明的应用前景,它能够缩短发酵周期、降低企业生产成本,增大企业空间和资本利用率。目前超声领域的研究热点为：(1)研究不同超声波频率、时间、强度和模式(频率组合)对液态发酵食品风味化合物和风味特征的影响。(2)研究超声波对生物体/食品体系中关键活性物质或风味化合物化学键的选择性,以阐明超声波促进产香微生物繁殖和香气化合物形成的深入机制。超声波处理条件(频率、强度、时间、模式等)对液态发酵食品风味物质形成具有显著影响。超声波的空化效应产生的自由基及机械、搅拌、微扰和热等效应是超声波改变液态发酵食品风味的可能机理。
适当的超声波处理可显著加速和改善液态发酵食品风味物质的形成,不当的超声波可导致液态发酵食品风味物质降解和风味恶化。超声波加速液态发酵食品风味成熟的最优条件,随着液态发酵食品种类的变化而变化。根据液态发酵食品种类和超声波引起食品风味改变的具体机制设置合理的超声条件,控制液态发酵食品风味向目标方向发展,并开发和生产工业化生产用超声耦合发酵设备,使其适应不同液态发酵食品工业化生产,相信这些目标随着食品工业的发展以及超声波换能器设计技术的进步会一一实现。
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