核桃是世界上主要坚果之一，其仁中含有55%～70%的油脂，18%～24%的蛋白质，并富含矿物质、维生素和天然抗氧化剂[1]。核桃蛋白中8种必需氨基酸比例合理，接近WHO和FAO的推荐范围，是具有较大发展潜力的植物蛋白。
研究发现，光、过渡金属、自由基等物理化学因素可使蛋白质氧化，其主链和氨基酸残基的侧链发生变化，进而使蛋白质的感官、功能性质、消化率和营养品质降低[2]。蛋白质经氧化后羰基化合物含量增加[3]，蛋白的分子间作用力被破坏，高级结构改变并形成交联聚集[4-6]，因此通过研究蛋白质的理化性质、光谱特征、反应位点等可反映氧化对蛋白质的作用规律。据文献报道，羟自由基氧化可导致猪肉、鱼肉的凝胶化改变，持水能力下降[7]；其中，胱氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸等氨基酸较易被氧化[8-9]；羟自由基氧化在一定程度上可提高大豆蛋白和卵清蛋白的界面性质[10-11]，因此对改善富含蛋白质食品的稳定性有研究意义，但严重的氧化则会导致相反的结果，而一些植物提取物可起到抑制羟自由基氧化食物蛋白质的作用[2，12]。此外，相关研究也证实，一些植物和动物蛋白经氧化后，构象和相关性质均发生了相应的改变[13-14]。
目前，蛋白质的氧化研究主要集中于动物蛋白的贮藏和加工等方面，关于羟自由基氧化对核桃等植物蛋白的结构、性质、生理活性等方面的研究还不够全面和深入，而对蛋白质氧化的基础研究对于探明食物蛋白质在贮藏、加工、消化等阶段中的变化规律具有一定意义。因此，本文以核桃蛋白为研究对象，经铁/过氧化氢/抗坏血酸(Fe/H2O2/Asc)体系产生羟自由基，研究氧化修饰对核桃蛋白的主要基团、性质和微观结构等的影响规律，为核桃蛋白的基础研究和开发利用提供一定理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
核桃饼粕，大理州巍山县大仓镇大理鑫淼农业实业有限公司；福林酚试剂盒、2，4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)、二硫代二硝基苯甲酸[5,5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、牛血清白蛋白等，北京索莱宝科技有限公司；三氯化铁、抗坏血酸等，均为分析纯试剂，国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Nano-ZS纳米激光粒度仪，英国Malvem公司；S-3000 N扫描电子显微镜，日本HITACHI公司；3K15型高速冷冻离心机，美国Sigma 公司；FJ200-SH型数显高速分散均质机，上海标本模型厂；UV-1000紫外可见分光光度计，北京莱伯泰科技仪器有限公司；F50型酶标仪，北京市永光明医疗仪器有限公司；Lumina荧光分光光度计，美国赛默飞世尔科技公司；4.5 L真空冷冻干燥机，美国LABCONCO公司。
1.3 实验方法
1.3.1 核桃蛋白的制备
核桃饼粕经去杂、粉碎过60目筛后，加入25倍水调pH至8.7，于48 ℃搅拌提取1 h后，4 000 r/min离心20 min，取上清液调pH至5，于相同条件下离心，取沉淀水洗至中性，冻干为核桃蛋白(walnut protein, WP)。
1.3.2 羟自由基氧化核桃蛋白的制备
参照KONG等[15]方法并略做修改。控制FeCl3和抗坏血酸的浓度分别为0.01 mmol/L和0.1 mmol/L，分别调节H2O2浓度至0、0.1、1、5、10、15 mmol/L，核桃蛋白于上述氧化体系中4 ℃反应24 h后，经乙二胺四乙酸终止得到羟自由基氧化核桃蛋白(hydroxyl radical oxidized walnut protein, HRO-WP)。
1.3.3 羰基含量的测定
参照WANG等[16]方法并略做修改，采用DNPH显色法测定HRO-WP中羰基含量。HRO-WP与DNPH反应后，经三氯乙酸沉淀，盐酸胍溶解后，于370 nm测定吸光度值，采用22 000 L/(mol·cm)摩尔消光系数换算，羰基含量表示为nmol/mg蛋白。
1.3.4 游离巯基与总巯基的测定
参照KONG等[15]方法，采用DTNB显色法测定HRO-WP中总巯基与游离巯基的含量。HRO-WP与DTNB水浴反应1 h后，离心取上清液于412 nm处测定吸光度值，采用13 600 L/(mol·cm)摩尔消光系数换算，游离巯基含量表示为nmol/mg蛋白。
HRO-WP经β-巯基乙醇和尿素-盐酸胍处理后，按上述方法测定和计算HRO-WP的总巯基含量。
1.3.5 内源荧光光谱分析
参考ZHANG等[17]的方法并略做修改。配制1 mg/mL HRO-WP磷酸盐缓冲液，经充分搅拌均匀后，于4 ℃，10 000 r/min离心30 min，取上清液以290 nm为激发波长，发射波长为300～500 nm荧光扫描。
1.3.6 HRO-WP粒径分布的测定
HRO-WP经磷酸盐缓冲液稀释为1 mg/mL后，采用激光纳米粒度分析仪测定其粒径分布情况。
1.3.7 溶解度的测定
参考ZHANG等[18]的方法并略做修改。HRO-WP经0.05 mol/L pH 7.9磷酸盐缓冲液配制为1 mg/mL溶液，于8 000 r/min离心15 min，分别测定上清液和核桃蛋白样品中的蛋白质含量。核桃蛋白的溶解度按公式(1)计算：
溶解度
(1)
1.3.8 持水性和持油性的测定
参考孙英杰[19]的方法并略做修改。取0.4 g的HRO-WP和8 mL的水于离心管中涡漩振荡1 min后，于3 000 r/min离心20 min，倾出上清液，称量离心管中核桃蛋白和残留水的质量，持水性表示为单位质量核桃蛋白可结合水的质量(g/g)。把水换成大豆油，以类似的方法测定和计算HRO-WP的持油性，持油性表示为单位质量核桃蛋白可结合油的质量(g/g)。
1.3.9 乳化性和乳化稳定性的测定
参考卢岩[10]的方法并略修改，大豆油与1 mg/mL HRO-WP磷酸盐缓冲溶液按体积比1∶4混合后，于10 000 r/min高速分散1 min，立即从底部吸取50 μL乳状液与25 mL的0.1%(质量分数)SDS溶液混匀，于500 nm处测定吸光度值A0，静置10 min后再测定吸光度值A10，按公式(2)和公式(3)计算HRO-WP的乳化性(emulsifying activity index，EAI)和乳化稳定性(emulsifying stability index，ESI)：
(2)
(3)
式中：N，稀释因子，500；c，核桃蛋白溶液的质量浓度，mg/mL；t，时间间隔，10 min；φ，乳状液中油相的体积分数，0.25。
1.3.10 起泡性和起泡稳定性的测定
参考LI等[11]的测定方法并略做修改。HRO-WP经pH 7磷酸盐缓冲液配制为1 mg/mL溶液，于室温搅拌1 h，取20 mL于10 000 r/min高速分散2 min，分别测定0 min和30 min时总体积，按公式(4)、公式(5)计算起泡性(foaming capacity, FC)和起泡稳定性(foaming stability, FS)：
(4)
(5)
1.3.11 电镜扫描分析
取少量HRO-WP样品粘贴在扫描电镜样品台上，以无水乙醇润湿并分散均匀，干燥后经喷金处理，采用500倍放大扫描观察其微观形貌。
1.3.12 数据处理与分析
所有试验操作均重复3次，试验数据采用Microsoft Excel 2010和Origin 2018 32Bit处理分析和绘图。
2 结果与分析
2.1 核桃蛋白羰基含量的变化情况
羟自由基氧化蛋白的过程复杂并伴随着许多相应产物的产生，其中羰基是应用最广泛的初步评价蛋白氧化程度的指标，羟自由基对核桃蛋白羰基含量的影响如图1所示，随着氧化程度的增大，核桃蛋白的羰基含量呈浓度依赖性增加，当H2O2浓度为15 mmol/L时，羰基含量相比对照组显著增加88.94%(P<0.05)。与杨曦等[20]的研究结果相似，说明在氧化体系中，羟自由基攻击核桃蛋白的主肽链或侧链，形成碳中心自由基，进而生成醛类和酮类等羰基衍生物[21-22]。
图1 HRO对核桃蛋白羰基含量影响
Fig.1 Effect of HRO on the carbonyl content of WP
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.2 核桃蛋白游离巯基和总巯基的变化情况
蛋白质氧化首先导致巯基和蛋氨酸残基的修饰，因此核桃蛋白氧化后的结构变化可通过总巯基和游离巯基的含量反映。羟自由基氧化体系对核桃蛋白的总巯基和游离巯基的影响如图2所示。随着H2O2浓度的逐渐增大，核桃蛋白的总巯基和游离巯基呈显著下降趋势(P<0.05)，当H2O2浓度为15 mmol/L时，与对照组相比，总巯基和游离巯基含量分别下降28.2%和27.5%，表明核桃蛋白经羟自由基氧化后，可能会发生可逆的氧化反应，使巯基被氧化为二硫键和次磺酸状态，同时也可能发生不可逆的氧化，导致核桃蛋白游离巯基和总巯基的下降，这与卢岩[10]对大豆蛋白进行氧化后研究结果相似。
图2 HRO对核桃蛋白游离巯基和总巯基的影响
Fig.2 Effect of HRO on free and total sulfydryl of WP
2.3 内源荧光的变化情况
蛋白质内源荧光的产生是由于色氨酸残基的存在，其相对位置可通过荧光峰位来反映，常用来表征蛋白质构象的变化。羟自由基对可溶性核桃蛋白内源荧光强度和荧光最大发射波长的影响如图3和图4所示。随着H2O2浓度的增大，可溶性核桃蛋白的荧光强度逐渐减小，在H2O2浓度为15 mmol/L时，荧光强度下降34.8%。这可能是由于羟自由基使可溶性核桃蛋白的三级结构展开，色氨酸残基被氧化为犬尿氨酸，从核桃蛋白分子的外部迁移至内部，从而降低其内源荧光强度。此外，经羟自由基氧化后，可溶性核桃蛋白的最大荧光峰位由原来的328.9 nm蓝移到325.6 nm，这与李玲等[23]和LI等[24]的研究结果类似，说明经羟自由基氧化后，可溶性核桃蛋白的色氨酸残基暴露于疏水环境中，且暴露出来的疏水基团通过相互作用形成聚集体[5]。
图3 HRO对核桃蛋白内源荧光强度的影响
Fig.3 Effect of HRO on endogenous fluorescence
intensity of WP
图4 HRO对核桃蛋白最大发射波长的影响
Fig.4 Effect of HRO on maximum emission
wavelength of WP
2.4 核桃蛋白平均粒径的变化情况
动态光散射可监测蛋白质的聚集情况。羟自由基氧化修饰对核桃蛋白平均粒径的影响如图5所示。随着H2O2浓度的增大，核桃蛋白的平均粒径逐渐增加，当H2O2浓度为15 mmol/L时，核桃蛋白的平均粒径增大12.7%。可能是羟自由基氧化使核桃蛋白分子的疏水基团暴露，在二硫键和次级键的作用下空间结构发生交联，生成较大的蛋白质聚集体，表现为核桃蛋白的平均粒径增大。本研究的结果与王耀松等[25]的研究结果类似。
图5 HRO对核桃蛋白平均粒径的影响
Fig.5 Effect of HRO on mean particle size of WP
2.5 核桃蛋白功能性质的变化情况
羟自由基对核桃蛋白溶解度、持水性、持油性、起泡性质和乳化性质的影响如表1所示。核桃蛋白的溶解性与其粒径大小有一定关系，可用于表征蛋白质交联及聚集的程度。因此溶解度也可作为核桃蛋白氧化程度的一个指标。随着H2O2浓度的增加，核桃蛋白的溶解度呈下降趋势，在H2O2浓度为15 mmol/L时最小，相比对照组下降了45.6%。这可能是在羟自由基的氧化作用下，核桃蛋白的构象被破坏，一些疏水基团暴露，进一步发生聚合形成不可溶性大分子聚集体[26]，该结果也验证了本研究中核桃蛋白平均粒径随氧化浓度增大的结果。
如表1所示，羟自由基氧化可不同程度地增大核桃蛋白的持水性和持油性。其中持水性在H2O2浓度为15 mmol/L时最大，相比对照组增大136.6%；持油性在H2O2浓度为0.1 mmol/L时最大，相比对照组增大146.0%。可能是因为氧化使核桃蛋白一部分疏水基团显露，且巯基被氧化成二硫键发生交联，形成大分子蛋白聚集体，导致核桃蛋白的组织结构发生改变，与水或油的接触面积增加，能够吸收更多的水或油。此外，持水性和持油性还与核桃蛋白分子的聚集情况有关。这与大豆蛋白经氧化后持水性和持油性增大的结果相似[27]。
表1 HRO对核桃蛋白加工性质的影响
Table 1 Effect of HRO on functional properties of WP
H2O2浓度/(mmol·L-1)溶解性/%持水性/%持油性/%FC/%FS/%EAI/(m2·g-1)ESI/min对照26.3±1.3a5.52±0.56b1.13±0.47b20.2±1.3c48.9±2.4e52.2±2.6c15.7±0.4b021.5±0.6b7.30±0.64b1.85±0.22ab24.0±0.9b53.7±1.6d52.4±3.5c15.3±0.7b0.120.1±0.9bc7.99±0.86b2.78±0.81a25.6±1.6ab61.3±3.3cd31.4±3.3d23.5±1.4a117.3±1.4c7.36±1.37b1.57±0.16ab28.8±0.8a62.7±2.8c66.8±5.1b24.1±1.8a516.3±0.7cd8.34±1.78b2.45±0.22ab24.8±1.1ab71.0±1.7b97.2±4.9a21.1±0.5a1015.3±0.8cd9.68±1.91ab2.02±0.94ab22.7±1.7bc80.5±3.4ab109.0±3.4a17.2±1.3b1514.3±1.4d13.06±1.62a2.10±0.70ab20.4±0.6c92.6±4.5a102.4±5.5a17.4±0.7b
注：表中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
从表1可知，随着H2O2浓度的逐渐增大，核桃蛋白的EAI和ESI呈先上升后下降的趋势。EAI和ESI分别在H2O2浓度为10 mmol/L和1 mmol/L时最大，增幅分别为108.8%和53.4%，这是因为核桃蛋白的粒径、溶解度、分子柔性等方面均可影响其乳化性能。经低浓度H2O2氧化后，核桃蛋白结构被破坏，导致其内部疏水基团暴露，且氧化提高了核桃蛋白的分子柔韧性，更容易结合到油-水界面，形成更稳定的蛋白膜。这与卢岩[10]报道的适度氧化可增加大豆蛋白乳液稳定性的结果类似。而当氧化程度较高时(>10 mmol/L)，由于核桃蛋白的聚集、絮凝等作用，使其溶解性和分子柔性变小，从而表现为乳化性能的降低。
如表1所示，核桃蛋白经羟自由基氧化后，起泡性呈先上升后下降的趋势，在H2O2浓度为1 mmol/L时最大，相比对照样增大42.6%。这是因为在羟自由基氧化过程中，适宜的H2O2浓度可使维持核桃蛋白结构的非共价键展开，导致核桃蛋白的柔韧性增强，从而可更快地吸附聚合更多蛋白，同时核桃蛋白分子间相互作用逐渐变强，形成相对稳定的核桃蛋白分子结构和界面膜；而当过度氧化时，核桃蛋白分子内部结构充分展开，疏水基团暴露到一定程度则导致其起泡能力的下降。该结果与LI等[11]和孙领鸽等[27]的研究结果类似。
2.6 核桃蛋白微观形貌的变化情况
核桃蛋白经羟自由基氧化的电镜扫描结果如图6所示。相比对照样，经0.1 mmol/L H2O2氧化后，核桃蛋白分子聚集变得更紧实；而当H2O2浓度为15 mmol/L时，核桃蛋白分子聚集为较大尺寸的形状，表面孔隙率增加且分布不均匀，呈现类似于“蜂窝”的结构。可能是H2O2氧化使核桃蛋白分子的内部构象伸展，巯基和疏水基团暴露，并发生相互作用，从而改变核桃蛋白分子的聚集情况。这与核桃蛋白经氧化后的粒度增大和溶解度降低的结果相对应。同时，猪肉肌原纤维蛋白经氧化后的微观形貌也显示相似的结果[28]。
a-对照；b-0.1 mmol/L H2O2；c-15 mmol/L H2O2
图6 核桃蛋白的扫描电镜图
Fig.6 SEM of walnut protein
3 结论
本研究通过建立羟自由基氧化体系，分析其对核桃蛋白的结构和功能性质的影响。随着氧化体系中H2O2浓度的增加，核桃蛋白的总巯基、游离巯基、溶解性和内源荧光强度呈逐渐降低的趋势；羰基、平均粒径、起泡稳定性和持水性呈逐渐上升的趋势；乳化性、乳化稳定性、起泡性和持油性呈先上升后下降的趋势；核桃蛋白经羟自由基氧化后的微观结构呈聚集状态，孔隙率提高。羟自由基氧化对核桃蛋白的结构和功能性质有较大影响，适度氧化可改善其乳化性能和起泡性能。
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