茶(Camellia sinensis L.O.Ktze.)为山茶属多年生常绿木本植物，茶叶内富含多酚、咖啡碱、氨基酸、多糖和B族维生素等多种对人体有益的有效成分，具有降脂减肥[1]、抗氧化[2]、助消化和调理肠胃[3-5]等功效，是世界三大无酒精饮料之一[6]。随着国民生活水平的逐步提升，饮食性肥胖成为公众关注的重点健康问题。有研究表明，肥胖患者常伴有胰岛素抵抗症状致使机体营养代谢失调和脂肪积累，加剧高血脂、高血糖等并发疾病患病的风险，也是诱发非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)的重要原因之一[7]。
目前，关于改善胰岛素抵抗的西药包括：曲格列酮、口比格列酮、罗格列酮等二酮类化合物，在降低机体胰岛素抵抗的同时，对机体和肝脏均具有一定程度的毒副作用。因此，寻找一种天然有效降低胰岛素抵抗的食品或饮品具有重要意义。WU等[8]与PHUNG等[9]研究团队分别以流行病学分析和随机对照干预试验2个方向证明，习惯性饮茶可减少身体脂肪积累和腰围增加。CHEN等[10]研究者也提出，成人每日饮用10杯绿茶(约20 g)可有效预防肥胖，同时小鼠实验证明，饲料添加0.32%的表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)能显著降低小鼠体重增加，改善血浆总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)水平，减少脂肪吸收和积累。众多研究表明，茶能控制体重和体脂含量，对于肥胖及并发症具有显著调节作用。本实验以C57BL/6小鼠为研究对象，每天高脂饮食喂养小鼠模拟非健康饮食状态，通过补充1%茶叶水提物(tea water extract，TAE)，研究TAE对于小鼠血脂水平、肝脏脂肪累积、胰岛素抵抗等功能指标的影响，以期阐明TAE改善小鼠胰岛素抵抗的作用机制，为进一步开发富含TEA的功能性食品和膳食补充剂提供依据。
1 材料与方法
1.1 TAE的制备
TAE制备过程：绿茶茶样500 g(茶叶原料品种：渝茶4号)来自重庆市农业科学院茶叶研究所，经过粉碎后过孔径350 μm筛，然后按照茶水质量比1∶20，用100 ℃沸蒸馏水浸提2次，第1次浸提20 min，第2次浸提10 min，合并滤液后过滤，于55 ℃下减压浓缩，最后冷冻干燥成粉110 g，-20 ℃冷冻保存备用。
1.2 HPLC分析
将TAE粉末25 mg溶解于25 mL甲醇中，经0.22 μm过滤器过滤后，采用安捷伦1200系列高效液相色谱仪进行定量分析。使用安捷伦C18色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)在278 nm处分离成分，控制条件(柱温30 ℃，剂量10 μL)，流动相由甲醇(A)和水(B)组成，流速为0.8 mL/min，梯度洗脱方法：0～20 min，80%～50% A；20～25 min，50%～75% A。
1.3 动物和实验设计
8周龄雄性C57BL/6小鼠，购自重庆医科大学实验动物中心(认证号：SCXK 2018-0003)，将小鼠圈养在(25±1) ℃和湿度受控的室内，其具有12 h光照/12 h黑暗循环。适应期为1周后，将小鼠随机分为4组(n=10)：正常饮食(normal control，NC)，高脂饮食(high fat diet，HF，脂肪40%卡路里)，NT-NC补充1%(质量分数)TAE(NC+1%TAE)和HT-HF补充1%(质量分数)TAE(HF+1%TAE)，持续13周。所有小鼠都可以自由饮水和饮食，每隔1 d记录体重和食物摄入量。
1.4 生化分析
关于血糖和胰岛素测量，在研究期的最后一天将小鼠禁食12 h后，使用罗氏血糖仪(Accu-Chek Active， Roche，Mannheim, Germany)从尾静脉血测定小鼠血糖水平。基于酶联免疫(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法通过胰岛素试剂盒测量小鼠胰岛素浓度。稳态模型评估(homeostasis model assessment，HOMA)是用于评估胰岛素抗性的方法，获得HOMA指数(HOMA-IR)，计算如公式(1)所示：
(1)
1.5 血清指标测定
实验结束后，以20%(质量分数)氨基甲酸乙酯麻醉小鼠，心脏穿刺取小鼠血样，经3 000×g离心15 min，得到小鼠血清样本，采用中国上海中贝特生物技术有限公司的商用ELISA试剂盒测定小鼠血清中丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、TC、TG、胰岛素、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等指标。
1.6 组织学分析
制作石蜡切片，将小鼠附睾白色脂肪组织(epididymal white adipose tissue，Epi-WAT)在4%多聚甲醛中4 ℃固定浸泡，石蜡包埋，在5～7 μm处进行切片。苏木精和伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色按标准方法进行[11]，使用细胞轮廓仪软件分析Epi-WAT脂肪细胞的大小。小鼠肝脏冷冻切片(8～10 μm)用油红O(oil red O)染色，在正置显微镜下进行病理组织学观察。
1.7 统计分析
所有结果均以平均值±标准差表示。用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析和Duncan多区间检验。
2 结果与分析
2.1 TAE生化成分分析
实验采用茶叶国标法和高效液相色谱法对TAE进行理化成分分析及儿茶素、咖啡因含量分析。TAE的理化成分含量如图1-A所示，茶多酚占比53.98%，氨基酸占比7.35%，咖啡碱占比7.03%，可溶性糖占比23.49%。TAE中儿茶素、咖啡因(caffeine, CAF)含量分析如图1-B所示，其中EGCG含量达(126.82±5.22) mg/g、CAF含量达(50.01±1.17) mg/g。
A-茶叶水提物常规理化成分；B-茶叶水提物儿茶素、咖啡因含量
图1 TAE生化成分分析
Fig.1 Biochemical analysis of TAE
2.2 TAE预防高脂诱导引起的肥胖
为研究TAE对于雄性C57BL/6小鼠体重的影响，8周龄雄性C57BL/6小鼠分别饲喂正常饮食NC、NC+1%TAE与高脂饮食HF、HF+1%TAE，共13周。如图2-A所示，高脂诱导饮食显著增加小鼠体重，是NC组的1.32倍，通过添加1%TAE可以显著降低高脂诱导小鼠的体重。喂食期间，添加1%TAE不影响正常饮食或高脂饮食小鼠的摄食量(图2-B)。
2.3 TAE改善高脂诱导引起的血脂异常和肝损伤
为了探索TAE抑制高脂血症的能力，研究测量了小鼠的血脂浓度。如图3-A，图3-B所示，实验饮食13周后，TG和TC浓度显著升高，补充1%TAE喂食可显著降低小鼠TG、TC含量。此外，由于血清ALT和AST水平是2个关键的肝脏病理学预后指标[12]，所以研究测定了小鼠血清AST和ALT水平。如图3-C、图3-D所示，高脂诱导喂食以后，HF小鼠血清AST和ALT水平显著增高，表明小鼠肝脏受到损伤，而HT小鼠显著较低的血清AST和ALT水平水平，表明TAE对高脂诱导的肝损伤具有保护作用。
A-体重；B-饮食量
图2 TAE预防高脂诱导引起的肥胖
Fig.2 TAE prevents obesity induced by high-fat
注：数据显示为每组10只小鼠的平均值±SD；*表示与NC组相比
差异显著(P<0.05);#表示与HF组相比差异显著(P<0.05)(下同)
A-TG；B-TC；C-ALT;D-AST
图3 TAE改善高脂诱导引起的血脂异常和肝损伤
Fig.3 TAE improves dyslipidemia and liver damage induced by high-fat
2.4 TAE改善高脂诱导引起的胰岛素抵抗
有研究表明，肥胖和胰岛素抵抗密切相关。因此研究测定评估了小鼠空腹血糖、胰岛素水平及相应的HOMA-IR。如图4-A～图4-C所示，与NC组相比，HF高脂诱导了更高的空腹血糖和胰岛素浓度，而TAE显著逆转了它们的含量，通过添加TAE，HT组小鼠相应的HOMA-IR也显著降低到接近正常水平。
2.5 TAE可降低高脂诱导引起的全身低度炎症
通过研究TAE对小鼠血清内毒素的影响[LPS和炎性细胞因子(TNF-α和IL-2)水平],发现TAE可以显著降低高脂喂养肥胖小鼠血清的内毒素LPS、TNF-α、IL-2水平(图5)，表明TAE对小鼠的肝脏脂肪变性有很强的抑制作用，并能改善全身低度炎症。
A-胰岛素水平；B-空腹血糖水平；C-HOMA-IR
图4 TAE改善高脂诱导引起的胰岛素抵抗
Fig.4 TAE improves insulin resistance induced by high-fat
A-IL-2；B-LPS；C-TNF-a
图5 TAE可降低高脂诱导引起的全身低度炎症
Fig.5 TAE can reduce systemic low-grade inflammation induced by high-fat
2.6 TAE预防高脂诱导小鼠Epi-WAT肥大和肝脏脂肪变性
通过自动图像分析测量脂肪细胞大小，从小鼠Epi-WAT切片中获得脂肪细胞的大小(图6-A)。在400倍视野下，HF与NC相比，平均脂肪细胞大小较大，而HT组可以明显地观察到细胞数目比HF多，平均脂肪细胞大小接近于NC组的正常水平。肝脏油红O染色结果显示(图6-B)，HF组小鼠肝脏脂肪着色明显，可见大量的脂肪滴。HT与HF相比，切片内着色脂肪颗粒明显减少，分布稀疏，表明TAE能明显抑制HF小鼠肥胖和肝脏脂质积累，防止肝脏脂肪变性。
A-Epi-WAT、HE染色；B-油红O染色
图6 TAE对高脂诱导小鼠Epi-WAT、肝脏病理变化HE染色和油红O染色的影响
Fig.6 Effect of TAE on Epi-WAT and liver pathological changes in mice induced by high-fat in HE staining and oil red O staining
3 讨论
肥胖是目前备受全球关注的健康问题，主要表现为机体营养代谢失调和脂肪积累，现已成为影响人类健康生活的重要因素，其根本原因在于能量摄入超过了能量消耗。有研究表明，绿茶可以增强脂肪分解和能量消耗，以防止肥胖[13-14]，HAMDAOUI等[15]通过动物实验证明，通过对Wistar大鼠灌胃5%的绿茶和红茶煎煮茶汤，能有效减少大鼠脂肪摄入，降低肝脏和血浆TG含量，减少脂肪累积，减轻体重；LEE等[16]研究普洱茶降脂减肥实验中发现，普洱茶可显著降低高脂饮食大鼠体重和脂肪系数。本研究对高脂诱导饮食C57BL/6小鼠喂养13周TAE，观察TAE对于小鼠肥胖和胰岛素抵抗的影响。实验发现，在高脂诱导饮食小鼠模型中，TAE喂养可显著降低小鼠体重增加和Epi-WAT平均脂肪细胞大小，使其接近对照水平，与之前研究结果保持一致，研究认为TAE具有显著的治疗饮食性肥胖的作用。
胰岛素抵抗与肥胖、非酒精性脂肪肝病、高胰岛素血症和血脂异常等严重代谢障碍密切相关[17]。实验中发现，高脂诱导喂养HF小鼠血糖和胰岛素水平显著增高，而TAE的补充使用产生了保护作用，抵消了肥胖小鼠胰岛素抵抗的增加。非酒精性脂肪性肝病的主要特征是脂肪变性，是由于细胞质脂质在肝细胞内过度积累而形成的，当肝脏中脂肪酸的合成或导入速度超过出口或分解代谢速度时，肝脏脂肪变性容易发生[18]。本研究中，添加1%TAE喂养的HT组小鼠能显著降低血清TG以及肝脏脂质积累，有助于改善肝脏脂肪变性。同时发现，补充1%TAE喂养可显著降低血清TC水平和ALT、AST浓度，这与CHEN等[19]在研究绿茶提取物帮助SD大鼠抵抗高能量饮食诱导的肥胖实验的研究结果保持一致，绿茶提取物可以增加大鼠能量消耗，减少脂肪积累，降低血清TG、TC、游离脂肪酸、LDL、ALT、AST浓度。因此，推断补充TAE可能是一种潜在的饮食补充，影响体内胆固醇代谢，以防止高胆固醇血症的发生，后续将对于胆固醇代谢相关基因检测，解析TAE补充后TC降低的可能机制做进一步探究。
高脂肪饮食会引起肠道菌群紊乱，导致代谢内毒素血症，异位脂肪沉积以及低水平的全身炎症。有研究表明，绿茶提取物与麦芽低聚糖协同作用，可以帮助饮食性肥胖小鼠的肠道微生态恢复正常，同时二者协同可降低小鼠血浆LPS、炎性细胞因子Resistin、TNF-α、IL-1、脂联素和IL-6的水平[20]。AXLING等[21]在研究绿茶粉与Lactobacillus plantarum DSM 15313(Lp)协同抑制肠道有害菌群，促进有益菌群增殖的实验中发现，复配物可降低小鼠炎症指标PAI-1、IL-6、MCP-1、TNF-α及TLR4的水平，改善小鼠脂质代谢。本实验中也发现TAE可以显著降低高脂喂养肥胖小鼠血清的内毒素LPS、TNF-α、IL-2水平，抑制肝脏脂肪变性，减轻了内毒素诱导的小鼠NAFLD，改善肠道菌群微生物菌群及代谢。但目前缺乏基础性的调节机制研究，证明TAE在调节胰岛素抵抗过程中与肠道微生物相互作用的因果关系。因此，本研究后续将从微生物种类及相关代谢通路上分析，阐明具体的作用靶点和调节机制，更深层次挖掘调节机理。
本研究以高脂饮食诱导C57BL/6小鼠模型为研究对象，通过补充1%TAE 13周后发现，TAE可显著降低高脂诱导小鼠体重增加和Epi-WAT平均脂肪细胞大小，减轻高脂诱导所致胰岛素抵抗，改善糖稳态、脂质代谢、肝氧化损伤等代谢参数。结果表明，TAE对高脂饮食引起的肥胖、胰岛素抵抗、肝脏脂肪变性和低度炎症具有保护作用，为改善饮食所致胰岛素抵抗，降低Ⅱ型糖尿病的发生提供有效途径，并为今后开发富含TAE的功能性食品和膳食补充剂提供重要的实验基础和理论支持。
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