枸杞是茄科枸杞属(Lycium)多年生落叶灌木，其叶、茎、花、果均可利用。据《本草纲目》中记载，枸杞叶名“天精草”，具有除烦益志、清热解毒、祛风湿、止痛、止渴、益精明目等功效[1]。现代研究表明，枸杞叶含有丰富的多糖、蛋白质、脂肪、氨基酸、营养元素及黄酮、总酚等次生代谢物[2-6]，具有降血糖[7]、抗氧化[8]、提高免疫力[9]等作用。枸杞叶是传统的草药，在我国南方地区常作茶用和菜用[10-13]，另外枸杞叶还可以作饲用[14]、作为重要的食品添加剂[15]以及开发成天然香精[16]。由此可见，枸杞叶在食品、医药等领域具有很大的发展潜力和应用前景。
相关研究表明，枸杞叶的营养成分及活性物质组成方面与枸杞子相当，有些生物活性成分的含量甚至显著高于枸杞子[14]，但目前对于枸杞的研究多集中在枸杞子[17-18]，对于枸杞叶的研究尚处于初步阶段。已有的研究主要集中在对甘肃、宁夏、青海等西北地区的枸杞叶个别营养成分的测定[19-20]，对于不同品种枸杞叶及我国南方地区种植的枸杞叶营养成分研究较少。鉴于此，本研究对青海德令哈、甘肃玉门、江苏盐城3个地点种植的4个品种枸杞叶营养成分进行双因素方差分析、主成分分析，为枸杞的引种、优选、深加工提供理论依据，促进枸杞叶资源的开发利用。
1 材料与方法
1.1 试验材料与地点
选取海西州农业科学研究所及宁夏神杞农林科技有限责任公司培育的4个优良枸杞品种(柴杞1号、柴杞2号、柴杞3号、宁杞1号)的一年生扦插苗，扦插苗规格基本一致，主干粗为(3.0±0.5) mm，株高为(40±10) cm，于2019年分别种植在青海德令哈、甘肃玉门、江苏盐城地点，地点概况见表1，气象数据来源于中国气象数据网(http://data.cma.cn/)。
表1 试验地点概况
Table 1 The situation of three test place
地点经度纬度海拔/m土壤类型土壤pH年平均降雨量/mm年平均温度/℃年平均日照时数/h青海德令哈97°12′34″37°18′55″2 889沙壤土8.2146.85.923 554.0甘肃玉门 98°58′51″40°20′44″1 479沙壤土7.8171.99.343 031.9江苏盐城 120°28′41″33°36′18″1壤土7.6962.215.091 976.8
1.2 试验设计
3个试验地均按照统一种植方式，采用完全随机区组设计。每个试验地的每个品种均有3个区组，每个区组种植40株，株行距为1 m×2 m。田间试验管理采用与大田相同的管理措施。
1.3 试验材料采集
2020年6月份，每个小区选择10株树，从东、西、南、北、中5个方向抽出的新稍上采摘10片已展开的成熟叶。将枸杞叶片于50 ℃烘干，磨碎后备用。
1.4 营养成分测定
选取1 g样品，用滤纸包好后放入索氏提取器，加入75 mL石油醚在80 ℃下回流4 h，除去样品中脂溶性等成分。回收滤纸包，用于测定多糖、总黄酮、总酚含量。多糖、总酚含量测定按照刘赛等[20]的方法，黄酮含量测定参照张鹰等[21]的方法。
蛋白质含量测定采用国标GB/T 6432—2018方法；脂肪含量参照国标GB 5009.6—2016方法；游离氨基酸含量采用茚三酮比色法测定，以谷氨酸为标准品，参照梁晓婕等[22]研究具体操作。
营养元素含量的测定主要包括钾、钙、铁、锌4种营养元素。称取0.2 g样品于烧瓶中，加入1 mL高氯酸和9 mL浓硫酸，进行消煮，直至溶液变透明，冷却后过滤，并定容至100 mL。待测液用原子吸收光谱仪测定钾和钙；用电感耦合等离子体质谱仪测定铁和锌。
1.5 数据处理与分析
试验数据采用Excel 2013进行数据统计分析，DPS 9.01进行方差分析，Duncan多重比较(P<0.05)，Origin 2018制图。由于枸杞叶各项营养成分指标存在差异，根据各指标相关性大小，通过SPSS 24.0将10个营养成分指标降维成4个综合指标，以4个主成分指标进行综合指标评价。
2 结果与分析
2.1 枸杞叶营养成含量
3个地点4个品种枸杞叶6种基本营养成分中多糖、总黄酮、总酚、游离氨基酸的含量变幅较大，蛋白质和脂肪含量变幅较小(表2)。多糖含量的变幅是4.56%～8.51%，其中含量最高的是甘肃地区的宁杞1号。总黄酮含量的变幅是3.65%～10.49%，青海德令哈的宁杞1号含量最高，江苏盐城的柴杞2号含量最低。总酚含量的变幅是5.71%～12.02%，青海的柴杞1号含量最高，江苏盐城的柴杞3号含量最低。游离氨基酸含量的变幅是1.60%～3.68%，甘肃玉门柴杞1号含量是青海德令哈宁杞1号的2.3倍。3个地点4个品种枸杞叶的营养元素的变幅较大(表3)，钾含量的变幅是3 327.33～5 341.50 mg/100g。钙含量的变幅是624.12～1 178.43 mg/100g，青海德令哈的宁杞1号含量最高，甘肃玉门宁杞1号含量最低。铁和锌含量最高的均是甘肃玉门的柴杞1号，含量分别为16.88和1.99 mg/100g。
表2 三个地点的不同品种枸杞叶基本营养成分含量 单位：%
Table 2 The contents of basic nutrients in leaves of
different Lycium barbarum varieties in three place
营养成分指标品种青海德令哈甘肃玉门江苏盐城柴杞1号5.74±0.598.47±0.915.94±0.06多糖柴杞2号6.18±0.374.56±0.385.36±0.3柴杞3号6.75±0.415.28±0.125.50±0.43宁杞1号6.81±0.038.51±0.545.36±0.33柴杞1号7.28±0.316.64±0.25.53±0.15总黄酮柴杞2号9.43±0.259.61±0.283.65±0.11柴杞3号10.17±0.018.22±0.103.69±0.16宁杞1号10.49±0.059.44±0.044.93±0.32柴杞1号12.02±0.439.82±0.496.81±0.48总酚柴杞2号8.93±0.8910.22±0.075.77±0.16柴杞3号11.80±0.359.82±0.495.71±0.30宁杞1号9.65±0.39.78±0.566.21±0.36柴杞1号4.12±0.034.47±0.055.74±0.44蛋白质柴杞2号4.75±0.024.78±0.075.05±0.17柴杞3号4.73±0.034.62±0.025.45±0.06宁杞1号4.30±0.075.37±0.024.84±0.03柴杞1号2.37±0.152.77±0.311.47±0.25脂肪柴杞2号2.00±0.102.57±0.212.73±0.71柴杞3号2.30±0.102.93±0.351.87±0.76宁杞1号2.37±0.153.13±0.323.37±0.81柴杞1号1.90±0.153.68±0.222.41±0.00游离氨基酸柴杞2号1.77±0.033.60±0.112.33±0.05柴杞3号1.76±0.093.45±0.022.39±0.08宁杞1号1.60±0.073.20±0.042.51±0.24
表3 三个地点的不同品种枸杞叶营养元素含量 单位：mg/100g
Table 3 The nutritional elements content in leaves of
different Lycium barbarum varieties in three place
营养成分指标品种青海德令哈甘肃玉门江苏盐城柴杞1号4 554.17±10.545 341.5±313.765 341.50±313.76钾柴杞2号4 379.00±89.375 296.17±248.275 296.17±248.27柴杞3号4 843.17±310.875 304.33±215.245 304.33±215.24宁杞1号3 510.00±88.753 327.33±126.563 327.33±126.56柴杞1号1 056.75±4.91738.25±10.531 055.77±5.10钙柴杞2号994.93±9.87679.93±18.6967.35±8.03柴杞3号1 054.52±52.93718.33±9.861 140.23±2.43宁杞1号1 178.43±4.98624.12±8.45929.52±7.01柴杞1号7.31±0.1011.35±0.086.17±0.03铁柴杞2号11.70±0.3110.26±1.736.32±0.33柴杞3号12.11±0.2610.20±0.217.26±0.13宁杞1号16.15±0.3516.88±0.106.64±0.14柴杞1号0.84±0.131.70±0.041.20±0.03锌柴杞2号1.63±0.071.19±0.070.72±0.07柴杞3号0.96±0.041.22±0.030.52±0.02宁杞1号1.25±0.061.99±0.010.70±0.03
2.2 不同地点间枸杞叶营养成含量
对参试地点枸杞叶的多糖、总黄酮、总酚、蛋白质、脂肪、游离氨基酸以及4种营养元素的分析，发现不同地点间枸杞叶营养成分差异显著(P<0.05)(表4)。对参试品种各地点枸杞叶10种营养成分的做了精确分析，结果见图1和图2。
图1 不同地点枸杞叶基本营养成分含量
Fig.1 The contents of basic nutrients in Lycium
barbarum leaves in different place
注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
图2 不同地点枸杞叶营养元素含量
Fig.2 The contents of nutritional elements in different
Lycium barbarum leaves in different place
表4 枸杞叶营养成分双因素方差分析
Table 4 Two-factor variance analysis on the nutrients
content of Lycium barbarum leaves
营养成分指标地点(F值)品种(F值)产地×品种(F值)多糖 22.76∗25.39∗22.85∗总黄酮 216.54∗130.64∗126.93∗总酚 605.76∗19.83∗19.73∗蛋白质 95.18∗1.8430.25∗脂肪 6.53∗5.20∗3.79∗游离氨基酸673.43∗5.80∗4.19∗钾 27.04∗102.89∗20.61∗钙 1 667.19∗47.23∗60.31∗铁 400.48∗139.58∗50.83∗锌 463.70∗83.24∗109.22∗
注：“*”表示5%差异显著水平
各参试地点中，青海德令哈的枸杞叶片中总黄酮和总酚显著高于其他两地，分别为9.34%，10.70%；江苏盐城的蛋白含量显著高于其他两地，含量为5.27%，但多糖、总黄酮和总酚含量显著低于其他两地；甘肃玉门的叶片多糖、脂肪和总游离氨基酸含量相对较高，含量分别为6.70%、2.85%和3.48%。
甘肃玉门的枸杞叶片中钾、铁、锌这3种元素含量显著高于其他地点，含量分别是4 817.3、12.17、1.53 mg/100g；青海德令哈的枸杞叶中钙含量最高(1 071.16 mg/100g)，是甘肃玉门的1.55倍。
2.3 不同品种间枸杞叶营养成分含量的差异
对参试品种枸杞叶的多糖、总黄酮、总酚、蛋白质、游离氨基酸以及4种营养元素的分析，发现不同品种之间除蛋白质外，其他营养成分均差异显著(P<0.05)(表4)。对各个参试品种枸杞叶10种营养成分的进行了精确分析，结果见图3和图4。
图3 不同品种枸杞叶基本营养成分含量
Fig.3 The contents of basic nutrients in leaves of
different Lycium barbarum varieties
图4 不同品种枸杞叶营养元素含量
Fig.4 The contents of nutritional elements in leaves of
different Lycium barbarum varieties
参试品种中，柴杞1号的总酚和游离氨基酸含量均高与其他3个品种，分别为9.55%和2.66%；柴杞2号的多糖含量和总酚含量均低于其他品种，含量分别为5.37%和8.44%；柴杞3号的基本营养成分在参试品种中处于中等水平；宁杞1号多糖、总黄酮、脂肪含量显著高于其他品种，含量分别为6.89%、8.28%和2.96%。
参试品种中，柴杞1号的钾含量最高，含量为4 966.89 mg/100g，但与柴杞2号和柴杞3号差异不显著；柴杞3号的钙含量最高，但与柴杞1号差异不显著；宁杞1号的铁和锌含量显著高于其他品种，含量分别为13.23和1.31 mg/100g。
2.4 主成分分析
对3个地点4个品种枸杞叶营养成分的10个指标进主成分分析，前4个主成分累计贡献率达到87.61%。基本上包括了10个指标的大部分信息，因此选择前4个主成分作为综合指标对其品质进行综合评价。指标转化为4个独立的主成分，如表5所示，第1主成分贡献率38.54%，铁、锌、多糖、总黄酮、总酚有较高载荷。第2主成分贡献率为22.91%，脂肪、游离氨基酸、钾、钙具有较高载荷量，其中钙符号为负，说明钙与之呈显著负相关。第3主成分贡献率为15.85%，多糖、蛋白质有较高的载荷。第4主成分贡献率10.33%，脂肪和钾有较高载荷。
表5 主成分荷载矩阵及方差贡献率
Table 5 Principal component load matrices and
variance contribution rates
营养成分指标主成分荷载量PC1PC2PC3PC4多糖0.66-0.090.460.04总黄酮0.81-0.33-0.260.18总酚0.72-0.21-0.560.14蛋白质-0.380.270.730.32脂肪0.350.44-0.05-0.79游离氨基酸0.280.92-0.010.10钾-0.320.54-0.580.41钙-0.55-0.800.010.00铁0.89-0.260.210.00锌0.840.160.290.28特征值3.852.291.591.03贡献率/%38.5422.9115.8510.33累积贡献率/%38.5461.4477.2987.61
根据表5计算出特征向量，再以特征向量为权重构建4个主成分的表达函数式:
F1=0.22X1-0.05X2-0.07X3-0.55X4+0.44X5+0.46X6-0.45X7+0.36X8+0.21X9-0.30X10
F2=-0.04X1+0.57X2+0.55X3-0.17X4-0.25X5+0.03X6+0.19X7+0.20X8-0.02X9-0.45X10
F3=0.68X1-0.01X2+0.13X3-0.02X4-0.16X5-0.15X6+0.06X7-0.26X8+0.63X9+0.05X10
F4=-0.10X1+0.01X2+0.13X3+0.73X4+0.09X5+0.28X6+0.24X7+0.42X8+0.32X9+0.14X10
式中：X1～X10分别表示多糖、总黄酮、总酚、蛋白质、脂肪、游离氨基酸、钾、钙、铁、锌等原始数据的标准化值。
综合评价函数的计算方法：以各个主成分对应的方差贡献率作为权重，由主成分得分和对应的权重线性加权求和:
F=0.39F1+0.23F2+0.16F3+0.10F4
根据主成分综合得分模型，计算出3个地点枸杞品种的综合得分值和排序结果(表6)。综合得分由大到小依次为宁杞1号(青海德令哈)、柴杞3号(青海德令哈)、柴杞1号(青海德令哈)、柴杞1号(甘肃玉门)、柴杞3号(甘肃玉门)、宁杞1号(甘肃玉门)、柴杞2号(青海德令哈)、柴杞2号(甘肃玉门)、宁杞1号(江苏盐城)、柴杞3号(江苏盐城)、柴杞1号(江苏盐城)、柴杞2号(江苏盐城)。
表6 三个地点不同品种枸杞叶营养成分综合得分
Table 6 The comprehensive score of nutrient composition of
different varieties of Lycium barbarum leaves in three place
地点品种F1F2F3F4F综合得分排序柴杞1号0.501.53-0.5-1.270.343青海德令哈柴杞2号-0.700.270.48-0.14-0.157柴杞3号-0.201.830.810.120.482宁杞1号1.520.911.18-0.470.941柴杞1号0.51-0.521.6-1.270.214甘肃玉门柴杞2号-0.560.82-0.620.22-0.118柴杞3号-0.020.35-0.360.690.085宁杞1号0.71-1.390.370.690.096柴杞1号-2.05-0.67-0.511.14-0.9211江苏盐城柴杞2号-1.08-1.31-1.46-0.28-0.9812柴杞3号-0.51-0.73-1.30.65-0.5110宁杞1号0.8-1.08-1.52-0.53-0.239
3 结论与讨论
研究结果表明，枸杞叶的多糖、总黄酮、总酚、游离氨基酸及4种营养元素含量均受地点、品种及其交互作用影响，蛋白质含量受地点及地点与品种交互作用影响。
不同地点枸杞营养成分及品质具有较大差异[19,23]。本研究对青海德令哈、甘肃玉门、江苏盐城3个地点的枸杞叶营养成分进行分析，发现多糖、总黄酮和总酚基本上表现为青海德令哈和甘肃玉门高于江苏盐城，这可能是因为青海德令哈和甘肃玉门差地海拔高具有昼夜温差大、平均日照时数长等气候条件，有利于糖分和次生代谢物的积累[20,24]。3个地点中江苏盐城和甘肃玉门枸杞叶的蛋白质和游离氨基酸含量较高，这有可能是与不同地点的土壤因子有关，比如土壤中的水解氮含量对枸杞蛋白质和氨基酸的合成有一定作用[25]。甘肃玉门枸杞叶的脂肪、钾、铁、锌含量均较高，说明参试地点中，该地环境最有利于脂肪的积累及钾、铁、锌元素的聚集，此地属于温带干旱气候，气候干燥，降雨量少，在3个参试地点中，海拔和年平均温度适中。
不同枸杞品种之间营养成分具有较大差异[26-28]。但目前关于不同品种枸杞叶营养成分分析的研究鲜有报道。本研究结果表明，4个不同品种枸杞叶片多糖、黄酮、总酚、钙和铁含量差异较大，可以通过品种筛选来获得具有不同营养成分的植株，在生产上可根据枸杞叶不同营养成分及其功效进行相关的加工利用。宁杞1号多糖和黄酮含量较高，柴杞1号枸杞叶的多糖和总酚含量较高，有望开发成功能性食品或者可作为提取天然多糖、黄酮和总酚的原料。钙元素是人体必需元素之一，缺钙会导致骨质疏松症，柴杞1号、柴杞3号枸杞叶中钙元素较高，有望开发成新的补钙食品。铁是重要的微量元素，柴杞3号和宁杞1号枸杞叶铁元素含量高，可以作为重要的食品添加剂，补充人体所需要的铁元素。
为了科学评价不同地点和不同品种枸杞叶的营养成分，本研究通过主成分分析提取了4个独立的主成分，对3个地点，4个品种枸杞叶营养品质进行综合排名。青海德令哈总体上得分较高，这可能是由于青海是枸杞的原产地。柴杞3号和宁杞1号在3个地点的排名都高于另外2个品种，说明柴杞3号和宁杞1号6月份叶片比柴杞1号和柴杞2号6月份叶片综合营养价值高。
本文通过对2年生的枸杞叶营养成分进行分析，根据综合得分作出排名，在未来3个地点各品种表现排名可能会由于树龄或其他因素的变化而出现差异[29]。还需要继续展开试验，为枸杞引种及枸杞叶资源开发利用提供完整的理论及技术支撑。
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