新疆杏品种资源丰富,2019年全区杏种植面积为10.9万hm2,产量84.38万t[1]。小白杏是南疆地区主栽品种之一,因其酸甜可口、颜色鲜亮等特点,深受广大消费者喜爱。小白杏是典型的呼吸跃变型果实,采收期短,且果实采后会在短期内迅速出现后熟现象,严重影响物流运输过程中的商品价值[2]。为提高小白杏的物流品质,亟需寻找一种新型有效的保鲜方式以防控小白杏果实在贮运过程中出现的果实软化和腐烂等问题。
真空预冷是国内外广泛应用的果蔬预冷技术之一,其冷却时间短,能够快速去除采后杏果实中的田间热,进而提升鲜杏采后的贮藏品质[3]。研究发现真空预冷可以显著延缓澳洲芒果果实的软化,抑制呼吸作用,减少营养成分流失[4]。刘芬等[5]通过测定呼吸强度、乙烯释放量、腐烂率和可溶性固形物等指标,发现真空预冷处理具有延缓杏果实衰老的作用。
N2熏蒸是一种气体熏蒸保鲜方式,现已有大量关于其在新鲜果蔬采后贮藏领域的研究。当N2质量分数达到86.6%时,N2熏蒸对白玉菇有很好保鲜效果,可使保鲜时间延长5 d以上[6]。侯玉茹等[7]发现使用90%～95%的N2处理草莓,可减少贮藏过程中草莓果实病害的发生,保持果实硬度,延缓维生素C、总酚含量的下降以及花青素的积累,从而延长了草莓的贮藏时间。真空预冷和N2处理虽然能延缓一些新鲜果蔬的成熟衰老进程,改善贮藏品质,但其在延缓杏果实软化和腐烂等问题上的研究不够深入。本研究拟采用真空预冷结合N2熏蒸对小白杏进行采后处理,研究其对杏果实采后品质及细胞壁相关酶活性的影响,为真空预冷结合N2熏蒸方式在杏果实中的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
绿熟期小白杏(可溶性固形物≥12.18%)于2020年5月采自新疆库车县小白杏种植基地。挑选无病虫害、无机械损伤,且大小、颜色、外观一致的小白杏,利用真空预冷机将果心温度预冷至4 ℃ 备用。
2,6-二氯酚靛酚、草酸、抗坏血酸、NaHCO3、三氯乙酸、NaOH、多聚半乳糖醛酸,天津市光复精细化工研究所;乙醇、葡萄糖、柠檬酸、柠檬酸钠、果胶、硫酸、羧甲基纤维素,天津市致远化学试剂有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
GY-4型数显果实硬度计,艾德堡仪器有限公司;PAL-1型数显糖度计,日本Atago公司;P902型电导率仪,上海佑科仪器仪表有限公司;UV-2600型紫外分光光度计,日本岛津公司;A11型研磨机,广州IKA实验室技术有限公司;激光打孔机,日本HITACHI公司;GD1913型气调包装机,广州行远包装机械有限公司。
1.3 试验方法
将气调包装机的气调比例调到100% N2,通过 O2和 CO2检测器测量确定保鲜盒中的O2浓度≤0.05%(体积分数)。将预冷后的果实放入保鲜盒中(每盒 20个)进行气调包装。用激光打孔机分别于2、4、6 h后打孔,贮于10 ℃恒温箱中,每隔3 d测定各项生理指标。杏果实用液氮冻样后,放入-40 ℃冰箱贮存。真空预冷4 ℃、真空预冷4 ℃结合N2熏蒸 2、4、6 h 分别表示为CK、N2-2、N2-4和N2-6。
1.4 指标测定方法
1.4.1 硬度的测定
参考曹建康等[8]的方法,每盒随机选择15个杏果,围绕果实的赤道部位,间隔等距离的3个位置,分别削去果皮(厚约1 mm),使用果实硬度计测定各个位置果肉的硬度,重复3次。最终结果以平均值计,单位为 N。
1.4.2 细胞膜透过性
采用电导率仪法[9],如公式(1)所示:
电导率
(1)
1.4.3 腐烂率的测定
腐烂率的测定如公式(2)所示:
腐烂率
(2)
1.4.4 原果胶、可溶性果胶及纤维素含量的测定
原果胶和可溶性果胶含量的测定参照YANG等[10]的方法,略有修改。取5 g冷冻组织于10.0 mL 95%(体积分数)乙醇中研磨,8 000 r/min离心15 min,加入5.0 mL 80%(体积分数)乙醇洗涤沉淀物。恒温水浴1 h后,收集上清液,稀释至100 mL,作为原果胶提取物。倾去上清液,向沉淀物中添加0.5 mol/L H2SO4,沸水浴煮45 min,冷却至室温,8 000 r/min离心15 min,即为可溶性果胶。分别取1.0 mL 原果胶与可溶性果胶,并向试管中加入6.0 mL浓硫酸,煮沸10 min。待溶液冷却至室温后再加入0.2 mL 1.5 g/L咔唑试剂,混匀,于530 nm处测定吸光度。根据半乳糖醛酸标准曲线计算原果胶和可溶性果胶的含量并用%表示。
纤维素含量的测定参照ZHAO等[11]的方法。将原果胶和可溶性果胶提取后的沉淀物放入105 ℃烘箱中烘干后称取质量,至质量恒定。损失的质量即为纤维素含量。
1.4.5 酶液的提取
参照GE等[12]的方法,稍作修改。取5.0 g冷冻组织于10.0 mL 95%乙醇中研磨,8 000 r/min离心15 min,去除上清液,加入5.0 mL 80%乙醇洗涤沉淀物。用5.0 mL 50 mmol/L乙酸盐缓冲液(pH 5.5,含1.8 mol/L NaCl)提取沉淀。4 ℃、12 000 r/min离心10 min,收集上清液,分析果胶甲酯酶(pectin methyl esterase,PME)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)、纤维素酶(cellulase,Cx)活性。
1.4.6 果胶甲酯酶活性的测定
参照PRESSEY等[13]的方法,稍作修改。将0.5 mL粗酶、0.5 mL 10 g/L果胶和1.0 mL 50 mmol/L醋酸缓冲液(pH 5.5)加入试管中,混匀后置于37 ℃恒温水浴1 h,再加入1.5 mL 3,5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)终止反应,煮沸5 min,迅速冷却至室温,记录540 nm吸光度。酶活力通过单位时间内吸光度的变化来表示,1个PME酶活性单位(U)以540 nm下的吸光度在1 min内变化0.1表示,PME酶活性表示为U/g。
1.4.7 多聚半乳糖醛酸酶活性的测定
PG活性测定参照GE等[14]的方法。向试管中加入0.50 mL粗酶,0.50 g/L半乳糖醛酸,37 ℃恒温水浴1 h后,加入1.5 mL DNS终止反应,冷却至室温,以蒸馏水稀释至25 mL刻度处,混匀。在波长540 nm处测定各管中溶液的吸光度。酶活力通过单位时间内吸光度的变化来表示,一个PG酶活性单位(U)以540 nm下的吸光度在1 min内变化0.1表示,PG酶活性表示为U/g。
1.4.8 纤维素酶活性的测定
Cx活性参照WU等[15]的方法测定。向试管中加入0.5 mL酶提取物和1 mL 10 g/L羧甲基纤维素。37 ℃恒温水浴1 h,加入1.5 mL DNS停止反应,沸水浴5 min,然后迅速冷却至室温,记录540 nm处吸光度值。酶活力通过单位时间内吸光度的变化来表示,1个Cx酶活性单位(U)以540 nm下的吸光度在1 min内变化0.1表示,Cx酶活性表示为U/g。
1.5 数据分析方法
使用 GraphPad Prism 8.0软件作图,SPSS 20.0进行数据分析以及利用Duncan法来比较均值。P≤0.05表示差异显著,P≤0.01表示差异极显著。
2 结果与分析
2.1 真空预冷结合N2熏蒸对小白杏硬度、腐烂率、细胞膜透性的影响
在贮藏期间,杏果实硬度呈现下降趋势(表1)。第15天时,CK、N2-2、N2-4、N2-6的硬度分别为4.12、6.60、4.03、4.46 N,N2-2硬度高于对照组2.48 N,且CK、N2-4、N2-6果实硬度无明显差异,N2-2与其他组相比差异显著(P<0.05)。表明N2-2处理能显著减缓杏果实硬度的下降。
由表1可知,随着贮藏时间的延长,对照组和N2-4、N2-6的杏果实腐烂加剧。第18 天,对照组杏果实的腐烂率达到了(21.52±0.39)%;N2熏蒸的杏果实的腐烂程度要显著低于对照组(P<0.05)。在贮藏结束时,N2-2、N2-4、N2-6杏果实的腐烂率分别比对照组低15.96%、14.73%、12.94%。N2-2抑制小白杏腐烂的效果要显著优于N2-4和N2-6(P<0.05)。说明N2-2能通过延缓果实硬度的下降从而抑制果实的腐烂,延长小白杏的贮藏期。
细胞膜透性在一定程度上反映了细胞受伤害和果品的衰老程度[16]。随着贮藏时间的延长,杏果实采后细胞膜透性持续上升,而N2熏蒸处理有利于保持细胞膜结构,从而抑制果实中细胞膜透性的增加。第18天时,各组细胞膜透性分别是78.48%、71.71%、76.42%、75.48%,与对照组相比,N2-2处理能维持膜透性的稳定性,保持细胞膜的完整性。
综上所述,选择真空预冷后N2-2作为后续试验条件,研究真空预冷结合N2熏蒸对小白杏果实采后品质的影响。
表1 真空预冷结合N2熏蒸对小白杏硬度、腐烂率、细胞膜透性的影响
Table 1 Vacuum pre-cooling combined with N2 fumigation on the firmness,decay rate and cell membrane permeability of Xiaobai apricot
贮藏时间/d熏蒸时间/h硬度/N腐烂率/%细胞膜透性/%0CK12.66±0.12039.54±0.66N2-212.66±0.12039.54±0.66N2-412.66±0.12039.54±0.66N2-612.66±0.12039.54±0.663CK10.29±0.09c048.58±1.13aN2-211.39±0.11a045.54±0.6bN2-410.89±0.12b048.34±0.59aN2-611.04±0.18b048.21±0.74a
续表1
贮藏时间/d熏蒸时间/h硬度/N腐烂率/%细胞膜透性/%6CK9.34±0.16c058.48±0.81aN2-210.76±0.15a054.44±0.85cN2-49.96±0.27b055.59±0.73bcN2-69.61±0.25bc056.63±0.52b9CK5.31±0.63c0.94±0.04a62.62±0.9aN2-29.37±0.10a0c58.34±0.63cN2-48.82±0.16a1.05±0.13a60.46±0.63bN2-66.68±0.16b0.93±0.02a61.52±0.70ab12CK4.71±0.18c2.78±0.13a64.6±0.83aN2-27.54±0.15a0.93±0.16b60.04±0.97cN2-45.45±0.27b1.85±0.09c62.65±0.57bN2-65.62±0.17b2.78±0.11b63.01±0.1b15CK4.12±0.12b8.85±0.09a75.49±0.67aN2-26.60±0.34a3.70±0.13c66.55±1.36cN2-44.03±0.16b5.61±0.14b73.31±1.13bN2-64.46±0.19b5.52±0.10b72.26±1.09b18CK2.35±0.13c21.52±0.39a78.48±0.91aN2-24.75±0.18a5.56±0.18d71.71±0.87cN2-43.80±0.14b6.79±0.13c76.42±0.51bN2-62.46±0.21c8.58±0.18b75.84±0.2b
注:不同小写字母表示同一贮藏时间组间差异显著 (P<0.05)
2.2 N2-2处理对小白杏原果胶、可溶性果胶、纤维素含量的影响
由图1可知,小白杏在贮藏过程中原果胶的含量逐渐降低,可溶性果胶的含量逐渐上升,鲜杏在贮藏期间硬度与原果胶变化规律一致,而与可溶性果胶的变化规律相反。对照组(CK)原果胶含量下降较快,N2-2处理在贮藏15 d时,原果胶的含量是对照组的1.25倍，可溶性果胶的含量是对照组的25.00%、71.63%。由图1-c可知,纤维素的含量呈先增大后减小的变化趋势。第3天时,对照组达到最大为0.34%,第6天时,N2-2达到最大值为0.34%。第12 天时,N2-2处理纤维素含量是对照组的1.55倍。与对照组相比,N2-2能有效抑制原果胶的分解、可溶性果胶的增加、细胞壁物质减少,从而延缓果实硬度下降。这说明N2-2通过抑制细胞壁物质的分解来延缓果实的软化。
2.3 N2-2处理对小白杏细胞壁相关酶活性的影响
由图2-a可知,在整个贮藏期间,处理组和对照组PME的活性呈现先上升后下降的趋势。对照组与N2-2处理组酶活性在第12天达到最大值,分别为13.46、12.86 U/g。N2-2处理显著抑制PME活性(P<0.05),在整个贮藏期间PME都相对稳定,并处于较低的活性水平。
a-原果胶含量;b-可溶性果胶含量;c-纤维素含量
图1 N2-2处理对小白杏原果胶、可溶性果胶、纤维素含量的影响
Fig.1 Effects of N2-2 treatment on contents of pectin,soluble pectin and cellulose in Xiaobai apricots
由图2-b可知,PG活性呈现先上升后下降的趋势,其中N2-2处理组的PG活性始终低于对照组。对照组与N2-2处理组PG活性分别于第9、12天达到最大值,分别为12.78、11.86 U/g。N2-2处理能够延缓PG活性高峰的出现。
如图2-c所示,0～9 d对照组果实Cx活性逐渐升高,之后逐渐下降。而N2-2处理组中的Cx活性在贮藏0～12 d内逐渐升高,随后呈下降趋势。第9天时,对照组比试验组纤维素酶活性高2.69%。与N2-2处理组相比,对照组在整个贮藏时间内均保持较高的Cx活性,N2-2显著抑制采后小白杏Cx活性,从而减少纤维素的降解。
a-PME活性;b-PG活性;c-Cx活性
图2 N2-2处理对小白杏细胞壁相关酶活性的影响
Fig.2 Effects of N2-2 treatment on enzyme activities of cell wall in Xiaobai apricot
3 讨论
果实硬度的变化是反映果实软化的重要指标,与此同时硬度与果实成熟度也有着密切的联系,在果实成熟的同时,其硬度也相应地降低。本试验发现,随着贮藏时间的延长,果实硬度逐渐下降,细胞膜透性增加。这可能是因为果实在采摘后期的成熟进程中,分子量较大的物质逐步分解成分子量较小的物质,使得分子间的空隙加大,使完好的细胞壁受到损坏[17]。真空预冷结合N2熏蒸延缓了果实中大分子的分解,从而抑制果实中细胞膜透性的增加,维持了细胞膜结构的完整性,进而延缓了小白杏果实的软化,降低了小白杏果实的腐烂率。
细胞壁结构的松散和细胞壁多糖的降解是果实软化的主要原因之一。果胶和纤维素是植物细胞壁中胶层的主要成分,中胶层的消融会导致细胞间隙增大和细胞游离,进一步导致果实的软化[18]。在柿果[19]中发现果实在冷藏过程中能有效地抑制原果胶的分解、可溶性果胶的增加、细胞壁物质减少,从而延缓果实硬度下降,这与本试验结果一致。这说明N2-2通过抑制原果胶的分解来延缓果实的软化。
纤维素、半纤维素是构成果实细胞壁的主要成分,维持果实的结构。纤维素-半纤维素结构的松散会导致细胞壁成分降解,加速果实软化[20]。草酸处理能够在贮藏前期降低芒果中纤维素酶活性,从而延缓果实中纤维素的降解[21]。对照组果实中纤维素酶活性较高,导致纤维素分解加速,促进果实的软化和腐烂,这严重影响小白杏果实的商品价值。然而,真空预冷结合N2熏蒸能抑制纤维素酶活性,从而抑制小白杏果实中纤维素的降解,延缓小白杏果实的软化进程。
果实软化过程中细胞壁成分的降解是果实中细胞壁代谢相关酶协同作用的结果,这些酶主要包括PME、PG、Cx等[22]。PME主要作用位点是多聚半乳糖醛酸的半乳糖醛酸残基的C-6酯化基团,使果胶去甲酯化,随之PG水解去甲酯化的多聚半乳糖醛酸聚糖,可溶性果胶含量增加致使细胞壁膨胀,导致果实软化[23]。PG在果实软化过程中与果胶物质的降解有关,且在贮藏前期与中期促进果实软化。番茄果实的软化与PG活性密切相关,软化进程的加剧往往都伴随着PG活性的增加[24]。此外,PME活性增加也与果实的软化有关[25]。虽然,PME不直接参与果胶的降解过程,但其能有效地为PG提供底物[26]。因此,PME可能也是杏果实采后软化的关键酶。本研究表明,经真空预冷结合N2熏蒸鲜杏中PG、PME活性显著低于对照组。在甜瓜果实软化过程中Cx对纤维素的分解具有专一性,可能是纤维素酶使细胞壁中粗纤维解体[27]。本试验中,纤维素酶活性的升高会加速纤维素的分解,导致小白杏果实结构松散,细胞膜透性增加,果实迅速软化。真空预冷结合N2熏蒸通过调节细胞代谢,降低了杏果实在贮藏期间PG、PME、Cx的活性,抑制了杏果实细胞壁物质的降解,从而抑制了果实的软化。
4 结论
小白杏果实软化与细胞壁代谢密切相关。真空预冷结合N2熏蒸通过抑制PME活性和延缓PG、Cx活性高峰的出现,延缓了原果胶、纤维素的分解和水溶性果胶含量的增加,从而抑制细胞膜透性的增加,降低果实腐烂率,维持果实硬度。因此,真空预冷结合N2熏蒸技术作为一种安全有效、便于应用的保鲜技术,可为小白杏采后保鲜贮藏及提高果实物流品质提供理论和技术支持。
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