随着社会的发展和消费者消费观念的不断转变,安全、绿色、健康的减菌剂已成为研究热点。肉类的减菌和保鲜方法有涂膜液抑菌[1]、天然提取物抑菌[2]、微酸性电解水减菌[3-4]、乳酸减菌[5]等。常见的70%～75%的酒精杀菌效果最好[6],但其闪点低,在空气中弥漫易造成火灾等安全隐患。食品级甘油能够与乙醇互溶,在避免酒精挥发的同时不影响酒精的杀菌作用[7],同时具有吸湿润肤的功能[8];乳酸可抑制大肠杆菌、单核增生李斯特菌[9]、沙门氏菌等的生长,达到抑菌和延长货架期的作用[10-11],因其较高的安全性和有效的抑菌保鲜作用在食品中被广泛应用。

减菌技术在不断发展,但无法忽视存在的实际问题,如企业成本控制、专业技术人员的缺乏;同时,中小型企业在安全措施保障方面还存在不足[12-13]。本研究在传统工艺基础上与现代减菌技术相结合,优化减菌工艺,为冷鲜肉的保鲜提供技术支持,并为肉制品加工前处理提供切实可行的减菌方法。

1 材料和方法

1.1 原料与试剂

原料:猪后腿肉,均购买于六盘水市盘州红果区合力超市,在低温条件下1 h内运回实验室置于4 ℃冰箱中冷藏,用于当日试验。

试剂:食品级酒精,河南鑫河阳酒精有限公司;食品级乳酸,河南金丹乳酸科技有限公司;平板计数琼脂培养基,上海博微生物科技有限公司;NaCl,成都金山化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2D双人单面净化工作台,上海豫明仪器有限公司;DHP-600BS电热恒温培养箱,北京市永光明医疗仪器有限公司;Vortex-genie涡旋振荡,美国Scientific Industries公司;Super-T-20超纯水机,深圳市莱克智能精密仪器有限公司;NR110便携式色差仪,深圳3nh有限公司;3H16R1智能高速冷冻离心机,湖南赫西仪器装备有限公司;Testo 205便携式pH计,深圳德图仪表有限公司;GYW-1 W冠亚水分活度仪,深圳冠亚水分仪科技公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

购买的样品置于无菌实验室中,用无菌的剪刀去掉皮和筋膜后进行分割。每组样品30.00 g,在无菌超净台中对样品进行相应的减菌方法处理。每组试验进行3次重复,同时设置空白组(K组)。

1.3.2 水分活度

使用水分活度仪进行测定。取3.00 g绞碎的猪肉样品,均匀平铺于器皿中,测试时间为10 min。

1.3.3 pH值

每个样品随机选取3个不同部位,每个部位进行5次重复测定。校准后将pH计的探针插入样品中,并与样品紧密接触,待数字稳定并发出提示音后读取数值。

1.3.4 色差

便携式色差仪使用前用白板调零后进行样品测定,得到样品的L*(亮度)值、a*(红色度)值和b*(黄色度)值。

1.3.5 离心损失率

称取5.00 g块状样品,初始肉样质量为m1,用滤纸将样品包好,放置于离心管中,14 ℃条件下 4 000 r/min离心25 min,取出样品,称量肉样质量为m2,按公式(1)计算:

离心损失率

(1)

1.3.6 减菌率

参照 GB 4789.2—2016的倾注平板法[14],选择合适的稀释度,每个梯度做3个平行。在37 ℃恒温培养箱中恒温培养48 h后计数。

以减菌率直观表现出实验组的减菌效果。按公式(2)计算:

减菌率

(2)

1.4 减菌工艺单因素试验

减菌工艺单因素试验如表1所示:

1.5 减菌工艺联合使用顺序的确定

紫外不仅仅具杀菌功能,还有成本低、无污染等优点[15],优先使用紫外杀菌,一方面,可在处理样品的过程中杀死样品表面的微生物;另一方面,利于创造无菌的操作环境。因此,在减菌工艺顺序中将其设为第一道处理工序,比较其余的减菌顺序对减菌率的影响。

1.6 减菌工艺响应面优化试验

根据Box-Behnken试验设计原理,在单因素试验的基础上,以减菌率为响应值,选取对减菌率影响较为显著的紫外照射时长30 min、EG使用量、乳酸使用量3个因素,通过响应面分析法对工艺条件进行三因素三水平试验。试验因素水平见表2。

1.7 数据处理与统计

每个处理进行3次平行试验。采用Design-Expert 10.0软件进行响应面试验设计与分析,使用SPSS 20.0软件进行数理统计和采用Duncan法进行平均数之间的差异显著性分析(P<0.05),采用Origin 2018软件绘图,结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 减菌工艺单因素试验

2.1.1 紫外照射时长对减菌率影响

由图1 可知,随着照射时间的延长,减菌率不断上升,但在30 min后减菌率变化并不明显。

在20 min出现下降的趋势,造成这一现象的原因可能是原料肉表面微生物分布不均匀[16-17]。研究表明,适当的紫外照射不仅会提高原料卫生学品质,对生产环境还有一定的净化作用[18],且与其他杀菌方式相组合使用要优于单一紫外照射杀菌效果。因此,结合实际生产,考虑时间成本和经济成本,选择30 min为适宜的紫外照射杀菌时间。

2.1.2 食用酒精体积分数和使用量对减菌率的影响

乙醇是消毒剂的有效成分之一,是日常生活中皮肤消毒液中的主要有效成分,乙醇常与甘油、植物提取物、壳聚糖、海藻酸钠等制备成混合消毒液[19]。由图2可知,与空白对照组相比随着食用酒精体积分数的升高,减菌率不断上升,但当食用酒精的体积分数达到80%时的减菌率与体积分数为75%食用酒精减菌效果无显著性差异,这与傅松哲等[20]的研究结果一致。因此,采用体积分数为75%的食用酒精对原料肉进行处理,可以达到有效的减菌效果。

以体积分数75%的食用酒精为减菌剂对原料肉进行处理,由图3可知,当体积分数为75%的食用酒精使用量为1～2 mL/100 g时,已达到较高的减菌率且无显著性差异。前期调研发现大多数食品企业高粮食酒的使用量为2 mL/100 g左右,初步将体积分数为75%食用酒精的使用量设为2 mL/100 g。

混合溶液EG,不仅有抑菌的作用,且酒有去腥增加原料肉风味的功能[21],而甘油具有保湿性、吸水性,微甜,且能够与乙醇互溶,在肉制品中有着广泛的应用[22]。由图4可知,用高体积分数的食用酒精和粮食酒配制的体积分数为75%的EB溶液,与体积分数为75%的食用酒精能够达到基本相同的杀菌作用,其中食用酒精的减菌率达到91.36%,复配的EB溶液减菌率达到90.98%,两者无显著性差异。EB溶液与食品级甘油混合使用减菌效果同EB溶液相比没有显著差异。因此,可将甘油与EB溶液混和制成的减菌溶液EG溶液应用于实际生产。

2.1.3 乳酸体积分数和使用量对减菌率的影响

乳酸具有抑菌保鲜的作用,并具有提高样品品质的特性。目前,大型屠宰厂会应用喷淋设施对分割后的胴体进行乳酸喷淋,以减少因为分割胴体等操作而造成的污染,达到提高原料肉初始品质的目的[5]。由图5可知,随着乳酸体积分数变大,减菌率不断上升,在乳酸体积分数达到2%时,减菌率达到100%,这与牛淑慧等[23]研究结果一致。

目前,对原料肉减菌效果的研究大多数集中于乳酸体积分数的确定,对于乳酸使用量确定研究相对较少,而这种现象既不利于研究成果的转化,更不利于企业实际生产中的参考应用。由图6可知,使用量与减菌率呈正相关,在乳酸使用量为5 mL/100 g时,减菌率发生显著性变化并达到97.63%。因此,乳酸的体积分数为2%,使用量为5 mL/100 g。

2.1.4 乳酸与EG溶液联合使用对减菌效果的影响

由图7可知,EG溶液虽可以有效的杀死样品表面的细菌,但是后期随着时间的延长,乙醇的有效体积分数降低,抑菌效率也将会下降。而乳酸本身的抑菌效果较为突出,且乳酸在后续贮藏过程中的代谢产物,如苯乳酸、乳酸链球菌素等均有抑菌保鲜的功能[24]。试验中联合使用可显著提高减菌效果,从单独使用2 mL/100 g体积分数为75% EG溶液的减菌率(75%)到联用91.29%的减菌效果。因此,综合考虑,可将联合使用方法应用于减菌工艺中。

2.1.5 减菌工艺单因素结合顺序的确定

由图8可知,紫外与2种减菌剂相结合都能够提高减菌率效果,紫外与乳酸相结合的减菌率比紫外与EG溶液相结合的减菌率高,这与图7单因素结果趋势相同。通过对乳酸抑菌液、EG溶液与紫外结合的顺序相比较,如图8所示,紫外+乳酸+EG溶液的(D组)减菌率要优于紫外+EG溶液+乳酸(C组)。因此,在实际生产应用中,可采用D组联合减菌模式的顺序。

2.1.6 减菌工艺对原料肉品质的影响

原料肉的初始品质往往是影响销售的主要因素[25]。颜色不仅仅能够反映所购买肉在胴体的部位,也能在一定程度上增强消费者购买意识[26];pH值的变化反映了原料肉的新鲜度,还与肉色度变化程度有关;肉的嫩度与肉的保水性(包括水分含量、离心损失率等)成正相关[27]。通过测定原料肉的品质指标直观反映出减菌工艺对原料肉品质的影响,结果见表3。该方法总体上不会对原料肉初始品质造成影响,L*和a*值有显著性变化,一方面酒精的使用会影响肉的颜色[28],另一方面甘油本身具有亮度,会提高肉的亮度和红度。总体来说,该减菌方法对于原料肉的初始品质影响较小。

2.2 响应面优化实验结果

在上述单因素最佳条件的基础上,应用Box-Behnken试验,分别考察影响减菌率(%)的3个主要因素:紫外照射时长(min)、EG溶液体积分数(%)、乳酸使用量(mL/100 g),设计三因素三水平的响应面优化实验。以抑菌率为响应值,采用Design-Expert 8.06进行优化分析。

2.2.1 试验方案及结果

由表4结果可知,利用Design Expert 10.0软件对数据进行分析,得出减菌率对紫外照射时长、EG溶液体积分数、乳酸使用量的二次多项回归方程为:

R=93.28+0.050A-1.32B-1.99C-1.12AB+1.02AC+3.11BC-3.86A2-16.15C2

2.2.2 回归方差分析

由表5可知,响应面模型的F=29.90、P<0.000 1(极显著)、失拟项P=0.960 9>0.05(不显著),这表明该模型具有较高的显著水平,此试验方法具有较高可靠性,其他非试验因素对抑菌率影响不大;模型的相关系数R2=0.974 6,说明响应面值的变化有97.46%来源于所选的变量;校正相关系数这表明此模型能较好地模拟各因素与抑菌率的关系且准确性较高;结合P 值及F 值可以看出,影响因子的主效应大小为:C(乳酸使用量)>B(EG溶液体积分数)>A(紫外照射时长)。其中试验因素B2、C2达到极显著水平,BC相互作用的P值为0.063 1,F值为4.87,其P值和F值均优于AC、AB[29]。失拟项各项数据分析表明该模型失拟不显著(P=0.960 9>0.05),说明此模型与试验实际拟合度良好,因此可用该回归方程替代试验真实点来进行结果分析。模型确定的最佳工艺为紫外照射时长25.11 min,EG溶液体积分数为74.59%,乳酸使用量为4.71 mL/100 g。

2.3 验证实验结果

考虑到实际生产中的可操作性,将经响应面优化得到的工艺参数修正为紫外照射时长30 min、EG溶液体积分数为75%、体积分数为2%的乳酸使用量是5 mL/100 g进行验证实验,进行3次重复试验,减菌率达到94.82%,与理论值的相对误差为2.64%,且重复性较好,证明该减菌工艺模型具有可靠性。

3 结论

本实验以猪后腿肉为原料,利用Box-Behnken试验对影响减菌率的单因素进行回归分析和优化,根据实际情况进行修整,绿色减菌工艺最佳工艺参数为紫外照射时长30 min、EG溶液体积分数为75%、体积分数为2%的乳酸使用量5 mL/100 g。该绿色减菌工艺可在较低资金投入的前提下,较大程度上保持原料肉本身的品质、感官等特性,因此,该技术在实际生产中具有一定的推广价值,可满足中小企业提高产品质量的需求。但该技术目前仍处于初期探讨阶段,有待利用现代分子学等技术研究其减菌机理,从而进行更深层次地剖析。

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Combination and optimization of green bacteria reduction methods in pork hind leg muscle

BAI Jing1,2,ZHU Qiujin1,2*,HUANG Xiaoyan1,2,CHEN Xiuli1,2,LI Zhongbai3,YANG Ruiying1,2,CHEN Yuqin1,2

1(School of Liquor & Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China) 2(Guizhou Province Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Storage and Processing,Guiyang 550025,China) 3(Panzhou Agricultural Bureau,Guizhou 561601,China)

Abstract To weaken the positive correlation between the quality of meat products and the initial bacterial count of raw meat, it is of great significance to effectively reduce the initial bacteria with minimum effect on sensorial properties of meat products. This study combined the modern green bacteria reduction method with Baijiu(Chinese liquor). The results showed that the concentration of lactic acid, ethanol and Baogu wine, edible alcohol and food grade glycerin (EG) had significant effects on the antibacterial rate. The optimal conditions of bacteria reduction as follows: under normal temperature, 30 min of ultraviolet irradiation, 2 mL/100 g of EG (75%) and 5 mL/100 g of lactic acid (2%) applied on meat. The antibacterial rate reached 94.82% with the relative error of 3.35% to the theoretical value. This process plays a guiding role and practical potential for application, and provides a reference for food industry to effectively improve economic benefits.

Key words green bacteria reduction technique; Baijiu; lactic acid; response surface optimization; microbe-reducing rate

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.026406

引用格式:白晶,朱秋劲,黄小艳,等.基于猪后腿肉的绿色减菌方法组合与配方优化[J].食品与发酵工业,2021,47(19):201-207.BAI Jing,ZHU Qiujin,HUANG Xiaoyan,et al.Combination and optimization of green bacteria reduction methods in pork hind leg muscle[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(19):201-207.

第一作者:硕士研究生(朱秋劲教授为通讯作者，E-mail：ls.qjzhu@gzu.edu.cn)

基金项目:贵州省科技计划项目(黔科合支撑[2019]2374 号)；贵州省生态特色肉制品科技创新人才团队(黔科合平台人才[2020]5004 )；朱秋劲-百层次创新型人才项目(黔科合平台人才[2016]5662)

收稿日期:2020-12-08,改回日期:2021-01-13