联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)2020年的统计资料显示[1],2018年世界兔肉的总产量为140.0万t,而我国继续以87万t的兔肉总产量稳居世界前列,这与我国人民的饮食习惯及兔肉“四高”、“四低”的营养特性[2]相关,兔肉的发展空间极大。伴随着兔肉产量的增加,兔骨等加工副产品也随之增多。
目前,兔骨的加工利用研究尚处于起步阶段。利用干法球磨技术,可将兔骨加工成平均粒径(D0.5)0.5～21.9 μm的细骨粉[3-4];兔骨粉中灰分和钙含量约为鲜骨的2～3倍[5],这为兔骨粉作为优质钙源奠定了基础;随着粒径的减小,钙离子的释放度显著增加(P<0.05),这将提高骨粉的生物利用率[6-7]。此外,将兔骨细粉加入到肉糜中,可赋予肉制品高钙的营养特性及特殊的骨香味[8-9]。但球磨一般耗时长(>3 h),进样量小,生产效率低,较难实现工业生产。此外,兔骨微细粉在其余食品原料中的扩展应用、更全面的粉体特性等方面仍需进一步研究。
高频振动磨是生产中广泛应用的超微粉碎设备,目前在中药[10]、谷物[11]、食用菌等[12]原料上有较多应用。它的原理是通过筒体振动将能量传递给磨介,球或棒形磨介的自转和公转运动产生高频冲击、摩擦和剪切力等将物料粉碎[13]。振动磨粉碎无须进行初级粉碎,降低了生产成本,且具有能量消耗低、粉碎效率高、对物料适应性强等特点[12,14]。本研究选取兔骨为原料,采用一系列前处理工艺制备脱脂脱色兔骨粗粉,然后利用高频振动式微粉碎对骨粉进行细化,以小麦粉为对照,研究兔骨粉粉体特性的变化,为兔骨微细粉的工业化生产提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
伊拉兔四肢骨,购于重庆市阿兴记原种兔养殖基地。乙酸乙酯为色谱纯,美国霍尼韦尔;其余试剂均为分析纯;小麦粉,市售,福临门家宴牌。
1.2 仪器与设备
SYFM-8振动微粉碎机,济南松岳机器有限责任公司;XT-48BN白度测定仪,杭州研特科技有限公司;CM-2300 d分光测色计,日本柯尼卡美能达控股公司;ProX扫描电子显微镜,荷兰飞纳公司;Mastersizer 2000 激光粒度仪,英国马尔文公司;AVATAR 370傅里叶变换红外光谱仪(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR),美国赛默飞尼高力公司;iCAP 6000 电感耦合等离子体发射光谱仪,美国赛默飞公司;S-433D氨基酸分析仪,德国赛卡姆科学仪器有限公司;Milli-q reference超纯水系统,美国密理博公司。
1.3 试验方法
1.3.1 兔骨粗粉的制备
根据项目组前期[15]兔骨粉的制备工艺,对兔骨进行高温蒸煮软化、初步粉碎、乙酸乙酯脱脂、干燥后,用水洗的方式对兔骨进行脱色。超纯水与骨粉按照液料质量比3∶1混匀振荡1 min,静置2 min后倾倒上层液体及漂浮在骨渣表面的血红蛋白层,重复漂洗3次。剩余骨渣50 ℃干燥至恒重,研磨后过60目筛,得到脱色脱脂兔骨粗粉(new rabbit bone meal,N-RBM)。
1.3.2 微粉碎对兔骨粉粉体特性的影响
将N-RBM置于振动磨微粉碎机中制备兔骨微细粉(degreasing rabbit bone micro powder,DRBM),装样量不超过不锈钢桶的2/3,振动振幅5 mm,温度0 ℃,分别振动0 min(N-RBM),5 min(DRBM 1),10 min(DRBM 2),15 min(DRBM 3),每个时间点取样30 g。以小麦粉为对照(CK),测定N-RBM、DRBM 1、DRBM 2及DRBM 3的粉体特性,探究高频振动式微粉碎对兔骨粉粉体特性的影响。
1.3.2.1 色泽
粉体的色泽用色差及白度表示。色差:称取10 g样品放入透明自封袋中,置于经过校正后的分光测色计检测口进行色差测定,记录各个样品的L*,a*,b*值;白度(W):称取适量样品装满样品盒,置于经过校正后的白度测定仪检测口进行白度测定,记录各个样品的ISO白度值(R457)。
1.3.2.2 流动性
粉体的流动性用休止角及滑角表示[16]。将玻璃漏斗垂直固定于铁架台上,漏斗的最下端距离坐标纸的高度H为3 cm。将样品缓慢地倒入漏斗中,直至坐标纸上的粉末锥体的顶端刚好接触到漏斗的最下端,记录锥体半径R(cm)。休止角按公式(1)计算:
休止角
(1)
准确称取3 g样品,置于一长(L)为20 cm、宽(H)10 cm光滑干净的玻璃平板的末端上,缓慢举起平板直至粉体表面开始滑动,读取此时玻璃平板的垂直高度H(cm)。滑角按公式(2)计算:
滑角
(2)
1.3.2.3 持水力及膨胀力[16]
称取1 g样品放入50 mL离心管中,再加入20 mL蒸馏水,振荡均匀,在60 ℃下水浴30 min,冰水冷却20 min,再以4 000 r/min离心10 min,小心地将上清液倒掉,称质量。持水力按公式(3)计算:
持水力
(3)
式中:m1,样品干质量,g;m2,空离心管质量,g;m3,样品残留物和离心管的质量,g。
称取1 g干燥后的样品粉末放入10 mL量筒中,充分摇匀,使粉体上表面保持水平,记录粉末的体积。缓慢加入10 mL蒸馏水,混匀后置于25 ℃水浴24 h,取出,记录湿粉的体积。膨胀力按公式(4)计算:
膨胀力
(4)
式中:m,样品质量,g;V1,干粉体积,mL;V2,湿粉体积,mL。
1.3.2.4 粒径及粒度分布[17]
粉体的粒度分布及平均粒径(中位粒径D0.5表示)用激光粒度仪分析测定。取适量粉末置于激光粒度仪中,以蒸馏水为分散剂,超声分散14 s,转速2 400 r/min,测定样品的粒度分布及D0.1、D0.5、D0.9及 D[4,3]值。
1.3.2.5 微观结构
用导电胶将少量骨粉粘在样品座上,将样品座置于离子溅射仪中喷金30 s后,用扫描电镜观察样品粉末的形态特征,并在10 kV的加速电压下摄取放大1 500倍的照片。
1.3.2.6 化学结构
骨粉化学键分析采用傅立叶变换红外吸收光谱仪(Fourier transform infrared spectromete,FTIR)进行测定。取3 mg骨粉,加入50倍质量的光谱纯KBr,用玛瑙研钵研磨混匀后,取30 mg混匀后的样品置于模具中压成透明薄片,波数扫描范围为500～4 000 cm-1,获得骨粉FTIR谱图。
1.3.2.7 钙离子释放度[18]
称取骨粉 0.25 g 左右到锥形瓶中,加入25 mL消化液(用0.1 mol/L盐酸调节pH为2),添加2 mg/mL胃蛋白酶(3 500 U/g 蛋白)用于模拟人体胃液消化环境。混匀封口后,置于37 ℃恒温摇床中,在100 r/min转速下振荡提取3 h。提取结束后,4 000 r/min离心30 min,取上清液过滤,加超纯水定容滤液到250 mL,最后用电感耦合等离子体发射光谱仪(inductively coupled plasma optical emission spectrometer,ICP-OES)测定钙的含量。钙离子释放度R按公式(5)计算:
(5)
式中:m1,上清液中钙的质量,mg;m2,骨粉中总钙质量,mg。
1.3.2.8 DRBM的化学组成分析
最优时间高频振动粉碎制备得到DRBM,与鲜兔骨对比,分析DRBM的化学组成。水分、灰分、蛋白质、脂肪、矿物质、氨基酸含量的测定均采用相应的食品安全国家标准。其中元素测定采用ICP-OES;氨基酸测定时样品前处理采用常规酸水解-厌氧管充氮密封水解法,略有改动[19],分析条件:流动相流速0.45 mL/min,茚三酮流速0.25 mL/min,柱温130 ℃。
1.3.3 数据处理
采用Excel 2010和SPSS 19.0进行数据统计及差异性分析,每组实验重复3次(n=3)。
2 结果与分析
2.1 微粉碎对兔骨粉色泽的影响
如表1所示,以小麦粉为对照,微粉碎对兔骨粉的色泽产生了显著的影响(P<0.05):骨粉白度提高,亮度增加,绿红值和蓝黄值降低,整体朝小麦粉的色泽靠近。由图1实物照片中也可以看出,经微粉碎处理后,兔骨粉色泽明显变化,最终制备得到的DRBM色泽与小麦粉较接近,这为DRBM在面制品中的应用奠定了基础。振动粉碎5 min后,粉碎时间对兔骨粉的亮度、绿红值及蓝黄值影响不显著(P>0.05),对兔骨粉的白度影响显著(P<0.05),呈现先降低后升高的趋势。
表1 微粉碎对兔骨粉色泽影响
Table 1 Effect of micro grinding on color of rabbit bone powder
样品WL*a*b*CK72.84±0.01a94.04±0.06a0.32±0.02b7.08±0.08cN-RBM44.45±0.15e83.50±0.48c0.60±0.10a16.79±0.55aDRBM164.87±0.05b91.94±0.01b-0.32±0.01c8.97±0.07bDRBM263.62±0.06d91.79±0.09b-0.33±0.02c9.10±0.06bDRBM364.40±0.04c91.68±0.10b-0.32±0.01c9.26±0.16b
注:组间不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
兔骨粉主要由白色的羟基磷灰石及少量残留的红褐色血红蛋白组成,微细化处理后,占多数的羟基磷灰石颗粒变小并均匀分散在粉体中,掩盖了血红蛋白的色泽,因而兔骨粉主要呈现羟基磷灰石的白色,而随着进一步细化,提高了血红蛋白在粉体中的分散,且羟基磷灰石可能出现团聚现象,这使得骨粉白度有所降低,因此,微粉碎时间不宜过长。
图1 小麦粉、N-RBM及DRBM实物图片
Fig.1 Picture of wheat flour,N-RBM and DRBM
2.2 微粉碎对兔骨粉流动性的影响
滑角和休止角是评价粉体流动性的有效参数,其值越小,粉体的流动性越好。由图2可知,兔骨粉的流动性优于小麦粉,这可能与兔骨粉低脂高矿物质的化学组成有关,而微粉碎提高了兔骨粉的休止角及滑角,粉体流动性降低,粉碎到10 min时,兔骨粉的流动性与小麦粉有接近的趋势,这可能是因为随着粒径的降低,骨粉颗粒的比表面积增大,颗粒间的表面聚合力也不断增加所致[20]。
图2 微粉碎对兔骨粉流动性的影响
Fig.2 Effect of micro grinding on fluidity of rabbit bone powder
注:不同大写字母表示休止角存在显著差异(P<0.05);
不同小写字母表示滑角存在显著差异(P<0.05)
2.3 微粉碎对兔骨粉持水力和膨胀力的影响
由图3可知,微粉碎5 min时,兔骨粉的膨胀力显著提高(P<0.05),继续细化,膨胀力则无显著变化(P>0.05);而随着进一步细化,兔骨粉的持水力呈下降趋势。
图3 微粉碎对兔骨粉膨胀力及持水力的影响
Fig.3 Effect of micro grinding on water holding capacity and swelling power of rabbit bone powder 注:不同大写字母表示膨胀存在显著差异(P<0.05);
不同小写字母表示持水力存在显著差异(P<0.05)
有研究报道称持水力、膨胀力与粒径无显著关系,但也有报道称两者与粒径之间呈正相关,目前仍无定论,持水力和膨胀力可能与原料的成分、粒径、粉体电荷密度、比表面积等均有关。与小麦粉对比可以看出,兔骨粉的持水力较低,微细化后,膨胀力提高但持水力会进一步下降,这可能会影响兔骨粉在面粉制品中的应用,因此微粉碎时间不宜过长。
2.4 微粉碎对兔骨粉粒度特性的影响
如图4所示,小麦粉的粒径主要分布在10～200 μm,而兔骨粉在微粉碎前,粒径较大,主要分布在60～300 μm,骨粉颗粒粒径<50 μm的分布较少;微粉碎5 min后,粒径分布曲线明显前移,大部分兔骨粉的粒径<100 μm;微粉碎10 min时,曲线进一步前移,粒度变小且更加集中;而粉碎至15 min时,有小部分颗粒粒径>100 μm,这与表2的结果一致。
图4 微粉碎对兔骨粉粒径分布的影响
Fig.4 Effect of micro grinding on size distribution of rabbit bone powder
微粉碎对兔骨粉粒度的影响如表2所示,其中D0.1、D0.5、D0.9分别表示在累积百分率曲线上占颗粒总量为10%、50%和90%时所对应的粒子直径,D[4,3]表示粉体的体积平均粒径,本研究以D0.5表示粉体的平均粒径,其值越小则表示粉体颗粒越小,粉体越细。由表2可知,小麦粉的平均粒径为(62.60±0.21) μm,兔骨粉经微粉碎后,平均粒径显著降低(P<0.05),由(131.21±1.95)μm降至21 μm以内,粉碎至10 min时,兔骨粉粒径进一步降低(P<0.05),平均粒径达到(16.92±0.15)μm,且90%的粒径分布在(53.32±0.42)μm以内,体积平均粒径达到(22.93±0.15)μm。随着粉碎时间的延长,兔骨粉在粉碎腔中被振动棒挤压、碰撞,振动微粉碎对兔骨粉的累计破坏程度逐渐增大,骨粉颗粒变小,而粉碎至10 min以后,可能达到了振动粉碎对兔骨粉原料的研磨极限,继续延长粉碎时间也无法进一步降低骨粉粒度,这可能是由于物料粒度的逐步降低导致范德华力显著增加,小颗粒粉体之间产生团聚现象,因而粉体颗粒随着粉碎时间的延长而增加[5],这与任灿等[4]在干法球磨兔骨粉中的研究结果一致。
表2 微粉碎对兔骨粉粒度影响 单位：μm
Table 2 Effect of micro grinding on rabbit bone powder size
样品D0.1D0.5D0.9D[4,3]CK12.59±0.05b62.60±0.21b156.76±0.48b74.53±0.23bN-RBM67.50±2.20a131.21±1.95a271.15±10.89a153.30±3.31aDRBM12.82±0.03c20.84±0.23c63.21±0.89d27.50±0.35dDRBM22.34±0.03c16.92±0.15d53.32±0.42d22.93±0.15eDRBM32.57±0.08c18.55±0.81d77.86±11.25c33.79±3.68c
2.5 微粉碎对兔骨粉微观结构的影响
扫描电镜结果(×1 500倍)如图5所示,骨粉颗粒结构致密,表面不光滑,且有团聚物的黏附,这可能是骨粉中残留的蛋白质,粉碎前的兔骨粉颗粒呈不规则的多角形,经过微细化处理后,羟基磷灰石和蛋白质组成的致密结构被打破,颗粒分散、变小,且颗粒形状朝球形变化,粉碎10 min后颗粒分布更均匀。
a-N-RBM;b-DRBM1;c-DRBM2;d-DRBM3
图5 不同粒径兔骨粉扫描电镜图(×1 500)
Fig.5 Scanning electron microstructure (×1 500) of rabbit bone powder with different size
2.6 红外光谱分析
利用FTIR可以测定动物骨粉中的官能团、化学键,主要用于物质的定性研究。几种不同粒径的兔骨粉的红外光谱图如图6所示,与李亚杰等[21]、刘建华等[22]的研究一致,兔骨粉都显示
官能团的5个特征吸收峰,分别位于567、602、961、1 043、1 094 cm-1,这与人工合成的羟基磷灰石结构相
官能团的3个特征吸收峰,分别位于872、1 418、1 456 cm-1;CH2基团是骨有机质的骨架振动峰,2个特征吸收峰分别位于2 850、2 920 cm-1;C
O基团是胶原蛋白多肽骨架伸缩振动峰,位于1 746;1 700～1 240 cm-1分别为酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ带峰,与胶原蛋白的结构密切相关[25];3 400 cm-1附近是骨粉中H2O的特征吸收峰。而不同粒径骨粉的谱图无明显变化,说明化学结构基本相同,微粉碎对骨粉的化学键、官能团等并未产生较大影响,这与文献[4-5,18]的研究结果一致。
图6 不同粒径兔骨粉FTIR图
Fig.6 FTIR spectra of rabbit bone powder with different size
2.7 钙离子释放度
研究中发现,降低粒径可显著提高鱼骨粉的溶解性和生物利用率,鱼骨中钙离子的溶解度随着研磨时间的增加而显著提高[6-7]。由图7可知,微粉碎5 min后,兔骨粉中的钙离子溶解度显著提高(P<0.05),这可能是由于振动微粉碎提高了兔骨粉的比表面积,破坏了羟基磷灰石结晶和胶原蛋白网络的结构,从而利于兔骨粉中钙离子的释放,而继续粉碎,钙离子溶解度有上升趋势,但差异不显著(P>0.05),这可能与振动微粉碎对兔骨粉的作用极限有关。
图7 微粉碎对兔骨粉钙离子释放度的影响
Fig.7 Effect of micro grinding on calcium ion solubility of rabbit bone powder
综上所述,微粉碎时间不宜过长,10 min为最佳,此时振动粉碎设备能耗适中,兔骨粉颗粒粒径小、粒度分布集中,钙离子释放度高,且色泽、流动性、持水力及膨胀力均达到一个较合适的程度。
2.8 DRBM的化学组分分析
不同粒径兔骨粉之间的营养成分差异并不大[5],因而仅对DRBM的化学组成进行分析。由表3可知,DRBM具有高矿物质(84.21±0.11)%、高蛋白质(9.85±0.13)%、低脂肪(1.73±0.04)%的营养特点,其中钙含量高达(17.55±0.11)%,且钙磷比值接近人体内吸收钙磷的最佳比例2∶1,尤其适于婴幼儿补钙[26]。DRBM中还含有镁、锌、铁等矿物质,值得一提的是,锌含量高达(22.09±0.10)mg/100 g,锌在人体生长发育、生殖遗传、免疫及内分泌等生理过程中起着重要的作用。由于骨盐主要由无定形CaHPO4和晶体羟磷灰石[Ca10(PO4)6·(OH)2]组成,而2种盐类表面上又吸附着
及柠檬酸根等离子[27],因此动物骨中无机盐含量极高,是一种廉价的天然矿物质来源。由表4可知,DRBM的氨基酸含量也较丰富(8.53±0.04)%,其中除含有32.38%代表胶原蛋白的甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸,27.46%呈味特性的谷氨酸(鲜味)、丙氨酸(甜味)、天冬氨酸(鲜味)等,还含有25.83%的成人及小儿必需的赖氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、组氨酸等,10.19%的早产儿必需的精氨酸、酪氨酸、胱氨酸。
兔骨经高温高压蒸煮、干燥、脱脂、脱色、振动微粉碎等一系列微细化加工后,制备得到DRBM,微细化处理后的兔骨的营养特性发生了较大的变化。兔骨的蛋白质含量、水分含量、脂肪含量、铁含量显著降低(P<0.01),这主要是由于加工工艺所致,高温高压蒸煮及水洗脱色,导致了胶原蛋白、血红蛋白等蛋白质的流失,干燥脱去了兔骨中大量的水分,超声辅助脱脂工艺脱去了兔骨中的大部分脂肪,而兔骨中的铁元素主要来源于血红蛋白中的血色素,血红蛋白的流失也导致了兔骨中铁元素的流失;蛋白质的流失,也导致兔骨中大部分氨基酸含量极显著降低(P<0.01),蛋氨酸含量显著降低(P<0.05);与此同时,由于水分和脂肪脱去带来的浓缩效应,兔骨中灰分含量、钙含量、磷含量、镁含量和锌含量显著提高(P<0.01),无机盐(灰分)含量提高约2.5倍、钙含量提高约0.6倍、镁含量提高约1.5倍、锌含量提高约1.2倍。
表3 DRBM的基本营养成分及矿物质组成
Table 3 Nutrients and mineral content of DRBM
基本及矿物质组成鲜兔骨DRBM蛋白质/[g·(100 g)-1]17.75±0.72**9.85±0.13水分/[g·(100 g)-1]47.82±0.03**3.21±0.10脂肪/[g·(100 g)-1]10.01±1.78**1.73±0.04灰分/[g·(100 g)-1]24.10±1.7284.21±0.11**钙/[g·(100 g)-1]10.91±0.3117.55±0.11**磷/[g·(100 g)-1]7.89±0.178.56±0.06**镁/[mg·(100 g)-1]220.19±5.53555.63±7.28**锌/[mg·(100 g)-1]9.87±0.8322.09±0.10**铁/[mg·(100 g)-1]6.77±0.23**3.26±0.04
注:同一行数据标有*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)(下同)
表4 DRBM的氨基酸组成
Table 4 Amino acids composition of DRBM
氨基酸组成/%鲜兔骨DRBM甘氨酸2.52±0.02**1.09±0.01脯氨酸1.50±0.02**1.19±0.02羟脯氨酸1.18±0.02**0.48±0.01谷氨酸1.97±0.01**1.22±0.01丙氨酸1.27±0.01**0.61±0.01天冬氨酸0.85±0.02**0.51±0.01丝氨酸0.64±0.02**0.35±0.00赖氨酸0.72±0.01**0.32±0.04亮氨酸0.88±0.01**0.55±0.01苯丙氨酸0.60±0.01**0.26±0.00缬氨酸0.65±0.01**0.38±0.00苏氨酸0.55±0.01**0.32±0.01异亮氨酸0.33±0.00**0.20±0.01蛋氨酸0.13±0.02*0.04±0.00组氨酸0.21±0.01**0.14±0.00精氨酸1.25±0.01**0.62±0.01酪氨酸0.28±0.00**0.21±0.00胱氨酸0.12±0.00**0.04±0.00氨基酸总量15.65±0.04**8.53±0.04
3 结论
本试验选取兔肉产业的加工副产物兔骨为原料,对兔骨经高频振动式微粉碎制备成兔骨微细粉DRBM,并对DRBM的粉体特性进行了详细分析,得出如下结论:
(1)微粉碎使兔骨粉白度提高,亮度增加,色泽朝小麦粉靠近,但过度粉碎会引起骨粉白度降低;微粉碎会降低粉体流动性、持水性,使粉体膨胀力先增高后不变;微粉碎会降低兔骨粉平均粒径,改善粉体颗粒的分布、均匀性及形状,且提高骨粉中钙离子的释放度,但粉碎至10 min以后,骨粉粒径不会进一步降低,钙离子溶解度有上升趋势;微粉碎对兔骨粉的化学键及官能团影响不大,不同粒径的兔骨粉红外光谱类似,均显示人工合成的羟基磷灰石及胶原蛋白结构密切相关的官能团。
(2)振动粉碎10 min,即可制备得到色泽白、无异味、粒径小、分散均匀且流动性好的兔骨微细粉DRBM,经一系列微细化加工后,兔骨的蛋白质含量、水分含量、脂肪含量、铁含量及氨基酸含量降低,但兔骨中灰分、钙、磷、镁和锌含量提高,DRBM仍然保留较多矿物质、蛋白质及种类丰富的氨基酸,具有低脂、高蛋白、高钙、高镁、高锌的特点,是一种营养价值较高的天然资源。
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