褐色发酵乳是以还原糖和生牛乳/脱脂乳粉为主要原料,辅以甜味剂和稳定剂,经高温褐变与乳酸菌发酵而成的一种风味发酵乳[1],在保留酸奶香甜气味的同时,增加了焦糖香气与棕色色泽,受到消费者的广泛喜爱[2]。但在高温下,褐色发酵乳产生独特风味的同时也会生成人体危害物——5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,5-HMF)[3-4],作为美拉德反应中间产物,5-HMF具有一定的神经毒性和遗传毒性,会刺激眼睛、上呼吸道、皮肤和黏膜,并增加患癌症的风险[5-7]。
不同食品中5-HMF含量差距较大,啤酒、威士忌等酒精饮料中5-HMF含量大约为5～50 mg/L,在饼干中其含量约为1.75～35.21 mg/kg,而在咖啡、黑蒜等食品中含量较高,可达100 mg/kg以上。由于5-HMF对人体有毒副作用,其在多种食物中已有明确限量标准,儿童果汁中5-HMF含量的强制性标准与建议性标准分别为20 mg/kg与5～10 mg/L[8],蜂蜜中的最大限量为40 mg/kg[9]。而褐色发酵乳作为新兴的液态乳,尚未出台5-HMF的限量标准。但由于其主要消费人群为青少年和儿童,安全性亦受到了研究人员的广泛关注[10-11]。在其生产过程中,5-HMF与风味物质均由美拉德反应生成[6],因此部分5-HMF调控手段会影响美拉德反应程度,这在一定程度上制约了褐色发酵乳的发展[12]。
本文分析了不同市售液态乳中5-HMF含量与理化指标之间的相关性,同时探究了主要相关反应物在褐色发酵乳生产中对于5-HMF积累的影响。在此基础上,形成了低还原糖、高氮的褐色发酵乳配方，以降低5-HMF含量并保证合适的美拉德反应程度。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
原料:液态乳(17种)、脱脂乳粉,均于当地超市购买。
5-HMF标准品,梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;蔗糖、酪蛋白酸钠、酪蛋白,上海麦克林生化科技有限公司;葡萄糖、半乳糖、乳糖、草酸(HPLC级)、醋酸锌、亚铁氰化钾、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等,中国医药集团化学试剂有限公司
高效液相色谱仪(chromaster),日本日立公司;超声波清洗仪(SB-4200DT),宁波新芝生物科技股份有限公司;电热恒温水槽(DK-8D),上海精宏实验设备有限公司;pH计(FE28),梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;台式高速离心机(TG 1850-WS),上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 褐色发酵乳制作工艺
褐色发酵乳的制作工艺如图1所示。将脱脂奶粉(用量为120 g/L)和葡萄糖(用量为60 g/L)溶解在40～45 ℃的温水中并搅拌。95 ℃下加热180 min,加热结束后水浴冷却。之后接种Lactobacillus acidophilus,37 ℃下发酵12 h,发酵结束后冷藏后熟,并与甜味剂和稳定剂混合,制成褐色发酵乳。
图1 褐色发酵乳制作工艺
Fig.1 Production process of brown fermented milk
1.2.2 液态乳中5-HMF及理化指标检测
赖氨酸的测定采用邻苯二甲醛法[13],褐变指数的测定采用高精度分光测色仪[14],酸度测定参照 GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》,蛋白质含量测定使用考马斯亮蓝法[15],5-HMF测定参照NY/T 1332—2007 《乳与乳制品中5-羟甲基糠醛含量的测定 高效液相色谱法》。
糖类物质的检测采用高效液相色谱法,样品的前处理使用Carrez试剂沉淀蛋白[16],处理后的样品按以下色谱条件进行进样分析:
色谱柱为Agilent Hi-Plex Ligand-Exchange 有机酸柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱温60 ℃,流速1.00 mL/min,进样量10 μL,检测器为示差检测器,流动相为超纯水。
1.2.3 不同美拉德反应底物对于褐色发酵乳中5-HMF的影响
糖含量的影响:分别将添加量为120 g/L脱脂乳粉与20～100 g/L的葡萄糖、乳糖、半乳糖、蔗糖混合,用1.2.1中的方法制作褐色发酵乳。
蛋白质与氨基酸影响:利用1.2.1中的方法制作褐色发酵乳,制作过程中分别添加0.1～2 g/L的赖氨酸、精氨酸、组氨酸或5～30 g/L的酪蛋白。
所有样品按1.2.2中方法检测5-HMF。
1.2.4 褐色发酵乳中5-HMF含量的控制
分别按照表1的工艺配方制作褐色发酵乳,除所列条件外,其余工艺与1.2.1中的方法相同。样品制作结束后按1.2.2中方法进行5-HMF含量与理化指标的检测。
表1 褐色发酵乳配方及编号
Table 1 Formula and serial number of brown fermented milk
工艺编号脱脂乳粉用量/(g·L-1)葡萄糖用量/(g·L-1)总糖含量/(g·L-1)酪蛋白酸钠用量/(g·L-1)褐变温度/℃11204092.1159521204092.1159831202072.11109541202072.1110985120052.1115956120052.1115987120052.1120958120052.112098
1.3 数据分析
每个实验重复3次,数据表示为平均值±标准误差。使用Origin 2016 软件进行绘图;使用SPSS 19.0 软件对5-HMF与理化指标(糖含量、pH、酸度、蛋白质和赖氨酸)和褐变指数进行相关性分析。
2 结果与分析
2.1 市售液态乳中5-HMF含量
本研究选取了17种不同类型市售液态乳,对其5-HMF含量进行分析(图2)。在市售液态乳中,5-HMF含量主要与液态乳的类型密切相关。褐色乳中5-HMF含量远大于普通牛乳,其中在褐色酸奶中5-HMF质量浓度为8.26～15.36 mg/L,在褐色乳饮料中较高,可以达到42.21～54.95 mg/L,而普通酸奶中仅为2.96～4.10 mg/L,纯牛奶与风味乳中未检测出5-HMF。儿童果汁中5-HMF强制性标准与建议性标准分别为20 mg/kg与5～10 mg/L,对比可知,普通牛乳中5-HMF含量较低,不存在安全风险。而褐色乳由于生产过程中经历了高温褐变过程,5-HMF含量已接近甚至超过强制性标准,因此主要研究褐色发酵乳中的5-HMF。
市售液态乳中理化指标检测结果如表2所示。纯牛奶中糖含量较低(53.16～55.37 g/L),大部分为乳糖,未经高温褐变与乳酸菌发酵,因而颜色纯白,pH偏中性(6.48～6.71)。而其余液态乳制品中添加了一定量糖,且均经乳酸菌发酵(一种风味乳除外),因此pH较低,糖含量较高。其中褐色乳饮料糖含量最高(150.02～158.03 g/L),pH最低(3.57～3.71),这可能是其5-HMF含量最高的主要原因。褐色酸奶中糖含量为118.31～143.67 g/L,普通酸奶多为95 g/L左右,2种酸奶pH为4.02～4.44。此外,褐色乳在制作过程中经历了高温褐变过程,颜色呈棕黄色,与其余液态乳相比,褐变指数较高(27.58～38.88)。
图2 不同类型牛乳中5-HMF浓度
Fig.2 5-HMF concentration in different types of milk
表2 不同类型牛乳中的理化指标
Table 2 Physicochemical parameters in different types of milk
样品类型褐变指数pH酸度/°T乳糖/(g·L-1)葡萄糖/(g·L-1)总糖/(g·L-1)赖氨酸/(g·L-1)蛋白质/(g·L-1)褐色酸奶36.674.447034.7956.91120.233.1732.1536.834.339025.1969.98127.983.0335.5337.984.206523.2081.73143.673.2436.2334.404.176528.3972.05125.663.4634.1137.984.226527.9970.70123.733.2334.8938.884.027530.8764.22123.103.0033.8737.054.158027.9970.97118.313.1630.97褐色乳饮料28.693.718017.2451.83154.611.4612.5128.223.578515.0476.51150.021.2310.8627.583.647510.9266.86158.031.369.26普通酸奶0.394.178539.2441.2698.432.6331.830.284.086034.2238.2995.652.9728.290.584.097032.0430.9195.882.9630.91风味乳及鲜奶0.316.892040.1339.7897.042.9831.780.596.482043.65-54.682.8132.120.796.711545.13-53.163.1435.170.296.542048.23-55.373.0434.20
对市售液态乳中5-HMF含量和理化指标进行相关性分析(Pearson),来探究不同因素与5-HMF含量之间的关系(图3)。糖含量、酸度、以及褐变指数与5-HMF含量呈正相关。其中,糖是5-HMF生成的主要前体,可通过美拉德反应,脱水缩合等反应生成5-HMF,两者呈极显著正相关(P<0.01)。酸度的升高可以显著降低pH,从而影响液态乳中5-HMF的生成,褐变指数作为美拉德反应标志之一,与5-HMF显著正相关(P<0.05)。此外,pH与5-HMF呈负相关,较低的pH会加快5-HMF的积累,在pH较高时,美拉德反应会遵循还原酮或羰基化合物路径,不再生成5-HMF。赖氨酸、蛋白质与5-HMF呈负相关,这是由于过多的氨基化合物可与5-HMF反应生成类黑素等。
图3 牛乳中5-HMF和理化指标的相关性分析
Fig.3 Correlation between 5-HMF and physicochemical parameters in milk
注:*表示在 0.05 水平(双侧)上显著相关;
**表示在0.01 水平(双侧)上显著相关
2.2 不同美拉德反应底物对于褐色发酵乳中5-HMF含量影响
通过相关性分析发现,糖、氨基酸以及蛋白质含量是影响褐色发酵乳中5-HMF重要因素,且均为美拉德反应重要底物,因此,分别探究了其对褐色发酵乳中5-HMF含量的影响。结果如图4-a所示,半乳糖与葡萄糖对于5-HMF含量的影响较为显著,乳糖的影响相比较小,蔗糖的影响最低。当半乳糖、葡萄糖、乳糖与蔗糖添加量为20 g/L时,褐色发酵乳中5-HMF质量浓度分别为8.84、4.51、2.46与2.18 mg/L。在添加量为增加至100 g/L时,5-HMF分别达到35.28、25.53、5.02与3.45 mg/L。由此可知,糖含量对褐色发酵乳中5-HMF的影响十分显著。而当褐色发酵乳制作过程中分别额外添加0.1～2 g/L的赖氨酸、精氨酸与组氨酸(美拉德反应能力较强的3种氨基酸)时,5-HMF质量浓度在10.48～13.07 mg/L无规律波动(图4-b),说明氨基酸对于褐色发酵乳中5-HMF含量无明显影响。在酪蛋白的添加量为10 g/L时,5-HMF质量浓度达到最大值14.06 mg/L,此后,随着酪蛋白含量的增加,5-HMF不断降低。这可能是过量的氨基化合物和5-HMF继续反应,使美拉德反应进行到高级阶段,生成类黑素等[17-18]。
图4 糖(a)、蛋白质(b)、氨基酸(c)含量对褐色发酵乳中5-HMF浓度的影响
Fig.4 Effect of sugar (a),protein (b),and amino acid (c) content on 5-HMF concentration in brown fermented milk
2.3 褐色发酵乳中5-羟甲基糠醛的控制
由于含糖量与5-HMF生成显著相关,可以通过降低含糖量来调控褐色发酵乳中5-HMF的含量,但这种方法也会显著抑制美拉德反应,从而影响产品的风味和颜色。蛋白质作为美拉德反应重要底物之一,不会造成5-HMF含量的剧烈增加。因此,在褐色发酵乳制作过程中添加酪蛋白酸钠以促进美拉德反应,从而建立新的生产工艺。不同工艺对于5-HMF与褐变指数的影响如图5所示,葡萄糖的减少与酪蛋白酸钠的添加能在现有工艺的基础上显著降低5-HMF含量,同时温度升高与酪蛋白酸钠的增加能保证褐变指数的基本不变。综上所述,当不添加葡萄糖,酪蛋白酸钠添加量为15 g/L,褐变温度为98 ℃时,对于褐变指数影响最小(40.99),且使5-HMF质量浓度降至1.86 mg/L。
图5 不同褐色发酵乳中5-羟甲基糠醛浓度(a)及褐变指数(b)的比较
Fig.5 Comparison of 5-HMF concentration (a) and browning index (b) of different brown fermented milk
注:红线为原有工艺的5-HMF浓度和褐变指数
不同工艺对于褐色发酵乳理化性质的影响如图6所示。几种褐色发酵乳的蛋白质与葡萄糖含量有一定差异,这主要是制作过程中不同添加量导致的,对于产品品质影响较小。但在乳糖含量及酸度方面差异较小,表明新工艺并未影响乳酸菌的生长与产酸,能保证褐色发酵乳的基本性质。新工艺制作过程中添加的酪蛋白酸钠是一种富含必需氨基酸(6.33 g/15 g)的优质蛋白质,因而更能满足人们的营养和健康需求。
图6 不同褐色发酵乳理化指标的比较
Fig.6 Comparison of physicochemical parameters of different brown fermented milk
3 结论
褐色发酵乳因其富含糖、蛋白质等美拉德反应底物,且在制作过程中经历长时间的高温加热处理,极易发生美拉德反应,生成5-HMF。本研究通过分析市售液态乳中5-HMF的含量,发现褐色发酵乳中5-HMF含量远高于其他种类液态乳;5-HMF与理化指标的相关性分析结果表明,糖、氨基酸、蛋白质美拉德反应底物等均与5-HMF显著相关。因而分析了底物对褐色发酵乳制作过程中5-HMF积累量的影响,发现糖含量可显著影响5-HMF的积累,而蛋白质与氨基酸影响较小。基于上述结论,确定了低还原糖、高氮的褐色发酵乳新配方,新配方可使5-HMF形成显著降低,且保留了适宜的酸度和褐变指数。
由于褐色发酵乳体系复杂,仅靠相关性分析难以完全阐明其中5-HMF的生成规律,今后的研究可以通过多级响应动力学等手段来解析乳制品以及其他热加工食品中美拉德反应与5-HMF的形成规律与机制,以期更好地平衡美拉德反应程度与危害物生成间的关系。
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