骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种骨代谢性疾病,以低骨量和骨组织微结构退行性改变为主要特征,临床多表现为骨脆性增加和易骨折,在中老年人群中十分常见,尤其是绝经后妇女[1-2]。骨质疏松作为一个日趋严峻的公共健康问题已成为大家关注的焦点[3]。补充钙质和维生素D能改善骨质疏松、避免骨质疏松及骨折的发生,但单纯补充钙质对改善骨密度(bone mineral density,BMD)及降低骨质疏松、骨折发生率的效果并不理想[4]。
氨基葡萄糖和硫酸软骨素是软骨组织的重要组成成分,是有助于提升骨关节健康的膳食成分,具有预防和治疗骨关节炎的作用[5-8],但两者联用治疗骨质疏松和提高绝经后女性骨密度时,存在起效较慢、用药剂量大、服用周期长等问题[9-10]。海洋鱼骨胶原低聚肽是以海洋鱼骨为原料的低聚肽产品,由2～6个氨基酸组成,可以直接被机体吸收利用,且鱼骨胶原蛋白肽可以促进卵巢切除大鼠的钙吸收,增加股骨中钙含量,起到增强骨密度的作用[11-12]。杜仲是我国的传统中药,杜仲能够促进成骨细胞增殖,激活骨重建,改善骨代谢,防治OP[13]。目前,关于海洋鱼骨胶原低聚肽和杜仲在骨相关疾病方面已有一定的研究基础和运用,但两者是否会对氨基葡萄糖-硫酸软骨素经典组合在增加骨密度和改善骨代谢方面起到协同增效的作用,尚未见文献报道。
本研究旨在评价海洋鱼骨胶原低聚肽与杜仲提取物联合氨基葡萄糖-硫酸软骨素复合物改善去卵巢大鼠的骨密度和骨代谢的作用,以期为防止骨质疏松相关产品的开发及临床应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试剂
盐酸氨基葡萄糖,江苏九寿堂生物制品有限公司;硫酸软骨素钠,嘉兴恒杰生物制药有限公司;海洋鱼骨胶原低聚肽,浙江海氏生物科技有限公司;杜仲,安徽佰顺堂中药饮片有限公司;戊巴比妥钠,山东西亚化学股份有限公司;抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)检测试剂盒,南京建成生物工程研究所;雌二醇(estradiol,E2)、骨钙素(bone gla-protein,BGP)、降钙素(calcitonin,CT)检测试剂盒,北京百奥莱博科技有限公司;生理盐水,江西科伦药业有限公司。
1.1.2 仪器与设备
双能 X射线QDR-4000型骨密度仪,美国Hologic公司;MK3型酶标仪,美国Thermo公司;罗氏Mdoular P型全自动生化分析仪,德国罗氏诊断有限公司;GS-6R型低温台式离心机,美国Beckman公司;DHG-9240A型电热鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;MDS-6G型微波消解/萃取合成系统,上海新仪微波化学科技有限公司。
1.1.3 实验动物
6～8周,体质量100～120 g的SPF级雌性SD大鼠60只,由北京大学医学部实验动物科学部提供,实验动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0010。动物饲养于屏障环境中,饲养环境温度为(23±2) ℃,湿度为40%～60%,明暗交替(12 h∶12 h)条件下适应性喂养1周后开始正式试验。
1.2 试验方法
1.2.1 杜仲提取物制备[14]
取杜仲1 kg,加入6倍量水浸泡30 min后煎煮1 h,过滤,保留滤液;残渣继续加入6倍量水煎煮1 h,过滤后合并2次滤液并进行减压浓缩,浓缩液经喷雾干燥后制得杜仲提取物55 g。
1.2.2 实验分组与造模
60只按照体重随机分成假手术对照组、去卵巢对照组、氨基葡萄糖-硫酸软骨素复合物组(受试物A组)、复合物+海洋鱼骨胶原低聚肽组(受试物B组)、复合物+杜仲提取物组(受试物C组)、复合物+海洋鱼骨胶原低聚肽+杜仲提取物组(受试物D组),每组10只。
各组大鼠手术[15-16]过程如下:①假手术对照组:腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液30 mg/(kg·bw)麻醉,腹位固定后于腹中线距阴道口3～4 cm处去毛并消毒,纵向切开皮肤,分离肌肉并用镊子提起脂肪团,露出与子宫相连的卵巢并观察,后逐层缝合切口并再次消毒;②去卵巢对照组及4个受试物组:麻醉及进入腹腔方法同上,露出与子宫相连的卵巢后,结扎并完整摘除双侧卵巢,余下组织送入腹腔内,后逐层缝合切口并再次消毒。
1.2.3 剂量设计
4个受试物组按照表1要求给予的受试物及剂量配制样品液灌胃;假手术对照组及去卵巢对照组大鼠以等体积的去离子水灌胃。所有药物给药量均按人体推荐剂量的10倍折算,所有动物灌胃量为10 mL/(kg·bw),每天1次,连续灌胃90 d,每周称重并结合体质量调整灌胃量。
表1 各试验组受试物给予情况
Table 1 Administration of test substance in each experimental group
组别给予受试物及剂量假手术对照组等体积去离子水去卵巢对照组等体积去离子水受试物A组盐酸氨基葡萄糖80 mg/(kg·bw)、硫酸软骨素钠40 mg/(kg·bw)受试物B组盐酸氨基葡萄糖80 mg/(kg·bw)、硫酸软骨素钠40 mg/(kg·bw)、海洋鱼骨胶原低聚肽70 mg/(kg·bw)受试物C组盐酸氨基葡萄糖80 mg/(kg·bw)、硫酸软骨素钠40 mg/(kg·bw)、杜仲提取物33 mg/(kg·bw)受试物D组盐酸氨基葡萄糖80 mg/(kg·bw)、硫酸软骨素钠40 mg/(kg·bw)、海洋鱼骨胶原低聚肽70 mg/(kg·bw)、杜仲提取物33 mg/(kg·bw)
1.2.4 观测指标及方法
90 d后,麻醉大鼠后腹主动脉采血,将其离心后取血清,于-80 ℃保存备用。后处死大鼠,取出双侧股骨,于105 ℃烘至恒重,称量左侧股骨质量,并采用原子吸收分光光度法测定其骨钙含量;测量大鼠右侧股骨全长,通过其中点,沿横截面方向画一直线,此为股骨中心点测量点(截面),测定此处的BMD;于大鼠右侧股骨远心端关节凹槽最下缘处确定测量点,通过此点划与上述股骨中点处标记平行的直线,此为股骨远心端测量点(截面),测定此处的BMD[17-18]。
试验采用全自动生化分析仪测定大鼠血清中Ca、P及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)含量[19],并根据各试剂盒中检测方法,测定血清中TRAP、E2、BGP、CT的含量[20]。
1.3 数据处理与分析
采用SPSS 22.0进行统计学分析及处理,多组样本间的差异采用单因素方差分析,t检验法,显著性水平为P<0.05。
2 结果与分析
2.1 一般观察指标及体质量的变化
所有组别大鼠均存活。试验期间,假手术对照组大鼠活动相对正常,毛色有光泽;去卵巢对照组大鼠活动力减弱,毛色光泽度下降,精神相对萎靡;与去卵巢对照组比较,各受试物组大鼠活跃度有所增强,毛色光泽度及精神状态有一定程度改善。
由表2可见,第4周开始,与假手术对照组相比,去卵巢对照组及各受试物组大鼠体质量均有增加趋势,但无显著性差异;试验第8周及试验末,与假手术对照组相比,去卵巢对照组及受试物A、B、C和D组大鼠体质量均显著增加(P<0.05),与去卵巢对照组相比,受试物A、B、C和D组大鼠体质量均有不同程度下降,但组间均无显著性差异。
表2 受试物对大鼠体质量的影响(n=10)
Table 2 Effects of test substance on the body weight of rats(n=10)
组别体质量/g试验前第4周第8周试验末假手术对照组108.1±5.6224.4±12.1272.5±18.3310.7±26.4去卵巢对照组107.8±5.4241.3±19.3310.8±23.4a383.1±29.0a受试物A组108.9±5.7240.2±14.0306.4±19.7a375.3±24.4a受试物B组107.0±5.7235.7±15.4302.0±20.2a373.5±26.3a受试物C组106.2±6.1232.5±17.9295.3±22.5a362.4±30.2a受试物D组108.2±6.3236.8±13.6292.6±18.9a358.0±24.6a
注:与假手术对照组比较,aP<0.05
2.2 受试物对大鼠股骨质量及骨钙的影响
由表3可见,与假手术对照组相比,去卵巢对照组大鼠股骨质量、骨钙含量及总钙量均显著降低(P<0.05),表明大鼠骨质疏松模型构建成功。
表3 受试物对大鼠股骨质量及骨钙的影响(n=10)
Table 3 Effects of test substance on femur quality and bone calcium content in rats(n=10)
组别股骨质量/g骨钙含量/(mg·g-1)总钙量/mg假手术对照组0.679 2±0.0293265.30±20.11181.20±14.13去卵巢对照组0.656 7±0.0240a223.54±18.42a145.23±11.67a受试物A组0.664 2±0.0327231.87±19.45a152.32±12.87a受试物B组0.668 5±0.0310242.26±21.14ab160.39±14.57ab受试物C组0.671 4±0.0335240.31±23.08ab159.77±15.30ab受试物D组0.676 0±0.0406251.27±21.44abc170.30±13.23abc
注:与假手术对照组比较:aP<0.05;与去卵巢对照组比较:bP<0.05;与受试物A组比较:cP<0.05(下同)
与假手术对照组相比,受试物A、B、C和D组大鼠骨钙含量及总钙量均显著降低(P<0.05);与去卵巢对照组相比,受试物B、C和D组大鼠骨钙含量及总钙量均显著增加(P<0.05),而受试物A组骨钙含量及总钙量增加但差异不显著;与受试物A组比较,受试物D组大鼠骨钙含量及总钙量均显著增加(P<0.05)。
2.3 受试物对大鼠股骨长度及骨密度的影响
由表4可见,各组大鼠股骨长度无显著性差异。与去卵巢对照组相比,受试物B、C和D组大鼠股骨中心骨密度及股骨远心端密度均显著增加(P<0.05),而受试物A组呈增加趋势但差异不显著;与受试物A组相比,受试物D组大鼠股骨中心骨密度及股骨远心端密度显著增加(P<0.05);结果表明4组受试组均能提高骨密度,受试物D组改善效果最好。
表4 受试物对大鼠股骨长度及骨密度的影响(n=10)
Table 4 Effects of test substance on femur length and bone mineral density in rats(n=10)
组别股骨长度/mm股骨中心骨密度/(g·cm-2)股骨远心端密度/(g·cm-2)假手术对照组36.44±1.700.238±0.0210.322±0.027去卵巢对照组34.23±1.550.186±0.012a0.267±0.019a受试物A组34.87±1.550.195±0.012a0.278±0.022a受试物B组35.21±1.680.211±0.020ab0.292±0.023ab受试物C组34.98±1.630.207±0.018ab0.284±0.020ab受试物D组35.76±1.790.221±0.027abc0.310±0.025abc
2.4 受试物对大鼠血清Ca、P及ALP含量的影响
血清ALP是常用的评价骨形成、骨转换的指标。由表5可见,各组大鼠血清Ca、P含量均无显著性差异;与假手术对照组比较,去卵巢对照组、受试物A、B和C组大鼠血清ALP含量均显著升高(P<0.05),而受试物D组血清ALP含量差异不显著;与去卵巢对照组比较,受试物B、C和D组大鼠血清ALP含量均显著性降低(P<0.05),而受试物A组大鼠血清ALP含量呈下降趋势但差异不显著;与受试物A组比较,受试物C、D组大鼠血清ALP含量显著降低(P<0.05)。
表5 受试物对大鼠血清Ca、P及ALP含量的影响(n=10)
Table 5 Effects of test substance on Ca,P and ALP content in rats(n=10)
组别血清Ca/(mmol·L-1)血清P/(mmol·L-1)ALP/(U·L-1)假手术对照组2.65±0.041.57±0.0592.52±8.41去卵巢对照组2.55±0.031.64±0.03163.34±12.62a受试物A组2.56±0.021.61±0.04155.67±12.08a受试物B组2.61±0.031.58±0.05138.60±11.22ab受试物C组2.58±0.031.59±0.03129.39±10.55abc受试物D组2.64±0.041.57±0.04101.87±9.80bc
2.5 受试物对大鼠血清TRAP、E2、BGP及CT含量的影响
血清TRAP水平的检测能反映破骨细胞的活性及骨吸收状态,而BGP是由成骨细胞分泌,其数值的高低可反映成骨细胞的活跃度,血清BGP可作为评估骨转换率及骨形成的特异性指标。因此由表6可知,与假手术对照组比较,去卵巢对照组大鼠血清TRAP及BGP含量均显著升高(P<0.05),血清E2含量显著降低(P<0.05);与去卵巢对照组比较,受试物B、C和D组大鼠血清TRAP及BGP含量均显著降低(P<0.05),受试物C、D组大鼠血清E2含量显著升高(P<0.05);与受试物A组比较,受试物D组大鼠血清TRAP和BGP含量均显著降低(P<0.05),血清E2含量显著升高(P<0.05),而受试物C组大鼠血清BGP含量显著降低(P<0.05);各组大鼠血清CT含量无显著性差异。
表6 受试物对大鼠血清TRAP、E2、BGP及CT含量的影响(n=10)
Table 6 Effects of test substance on TRAP,E2,BGP and CT content in rats(n=10)
组别TRAP/(mmol·L-1)E2/(ng·L-1)BGP/(ng·L-1)CT/(μg·L-1)假手术对照组0.11±0.0248.44±9.63513±6910.35±1.34去卵巢对照组0.17±0.05a22.87±5.20a622±107a9.64±1.02受试物A组0.15±0.04a26.30±5.93a597±96a9.78±1.10受试物B组0.13±0.03b29.62±6.65a569±87ab10.12±0.93受试物C组0.13±0.02b37.94±7.33b552±81abc9.91±0.96受试物D组0.11±0.02bc42.65±6.40bc536±74bc10.33±1.64
3 结论与展望
在本实验条件下,去卵巢对照组大鼠的骨钙含量、总钙量和骨密度均显著低于假手术对照组,其中骨密度是预测骨丢失的临床指标,因此表明利用去卵巢手术成功建立了大鼠骨质疏松模型。海洋鱼骨胶原低聚肽和杜仲提取物协同氨基葡萄糖-硫酸软骨素复合物具有明显的增加骨密度、改善骨代谢、提高雌激素水平的作用,且两者联合使用时,协同效果更加显著。且在本研究中采用去卵巢致大鼠骨质疏松模型模拟绝经后骨质疏松的病理状态,与去卵巢对照组相比,喂养添加杜仲提取物的大鼠体质量较其他组下降幅度大,且血清雌激素E2含量显著升高,这可能是受试物中的杜仲提取物刺激了大鼠体内雌激素水平上升,从而在一定程度上抑制由于雌激素降低而诱发的体质量代偿机制。
本研究首次探讨了海洋鱼骨胶原低聚肽及中药杜仲联合氨基葡萄糖-硫酸软骨素复合物对去卵巢大鼠骨密度及骨代谢的影响。在动物试验层面上,明确了其可增加骨密度、改善骨代谢等作用,为研究预防与骨质疏松相关疾病的功能性食品提供了理论基础。
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