其中中性蛋白酶酶解4 h的酶解产物(neutral protease-glycomacropeptide hydrolysates,N-GMPH)具有较强的自由基清除能力;同时N-GMPH可显著提高H2O2诱导的RAW 264.7细胞存活率并降低ROS生成量。研究显示,N-GMPH具有缓解细胞氧化损伤的作用,该研究可为GMP酶解产物进一步开发功能食品配料提供研究依据。摘 要 采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶制备酪蛋白糖巨肽(glycomacropeptide,GMP)酶解产物,基于自由基清除能力确定适宜的蛋白酶种类与酶解时间,进而评价其对H2O2诱导RAW 264.7细胞存活率和活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成量的影响。结果表明,不同蛋白酶制备的GMP酶解产物均可显著清除ABTS阳离子自由基、DPPH自由基和其中中性蛋白酶酶解4 h的酶解产物(neutral protease-glycomacropeptide hydrolysates,N-GMPH)具有较强的自由基清除能力;同时N-GMPH可显著提高H2O2诱导的RAW 264.7细胞存活率并降低ROS生成量。研究显示,N-GMPH具有缓解细胞氧化损伤的作用,该研究可为GMP酶解产物进一步开发功能食品配料提供研究依据。
氧化应激是生物体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态,可造成脂质、蛋白质和DNA等氧化损伤而引起细胞凋亡,其已被证实与多种慢性疾病、衰老有着密切关系[1]。为此,应用抗氧化活性物质成为了降低生物体氧化损伤的一种策略。抗氧化肽源于食品蛋白质,由于具有资源丰富、稳定性好、安全性高等优势,逐渐备受关注。
酪蛋白糖巨肽(glycomacropeptide,GMP)是一种具有64个氨基酸残基的糖肽,富含缬氨酸、亮氨酸等支链氨基酸,但几乎不含苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸[2];其主要糖基为唾液酸[3]。正因为GMP独特的氨基酸构成,其酶解产物在结构与功能活性方面可能不同于其他蛋白酶解产物。近年来科研工作者开始关注GMP酶解产物,发现其具有益生、抗炎等功能活性,如GMP酶解产物可促进保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的生长[4];可通过阻断NF-κb信号通路,抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的巨噬细胞中一氧化氮(nitric oxide,NO)产生和炎症因子mRNA表达,发挥抗炎作用[5]。
目前国内外关于GMP酶解产物的抗氧化性研究报道较少,仅CHENG等[6]采用木瓜蛋白酶酶解GMP,发现其酶解产物对RAW 264.7小鼠巨噬细胞的氧化损伤有保护作用。基于此,本文拟采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶等商业酶制剂对GMP进行降解,比较其酶解产物的自由基清除能力与抗氧化损伤能力,为GMP酶解产物功能食品配料开发提供研究依据。
GMP,丹麦Arla公司;中性蛋白酶、木瓜蛋白酶,上海瑞永生物科技有限公司;碱性蛋白酶,上海麦克林生化科技有限公司;RAW 264.7(小鼠巨噬细胞),中国科学院生物化学与细胞生物学研究所上海细胞库;2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-benzenesulfonic acid,TNBS)、2,2，-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS))、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)等试剂均为分析纯,美国sigma公司;焦性没食子酸,国药集团化学试剂有限公司。
MCO-17AC型二氧化碳培养箱,日本Sanyo 公司;CKX41型倒置光学显微镜、IX53型倒置荧光显微镜,日本Olympus公司;Synergy H1多功能酶标仪,美国Bio-TEK公司;ACB-4A1超净工作台,南京非同科学仪器有限公司。
1.3.1 GMP酶解产物的制备
采用不同pH的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液配制30 g/L GMP溶液,按100 U/g添加量分别加入中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶,酶解条件见表1,酶解0.5、1、2、4、6 h后取样,快速置于85 ℃下热处理20 min使酶失活;而后快速冷却至室温,离心(10 000 r/min,20 min),上清液冷冻干燥,备用;酶解产物分别命名为N-GMPH、P-GMPH和A-GMPH。
表1 GMP的酶解参数
Table 1 Enzymatic parameters of GMP
蛋白酶pH温度/℃酶添加量/(U·g-1)GMP质量浓度/(g·L-1)酶解时间/h碱性蛋白酶9.050100300～6中性蛋白酶7.055100300～6木瓜蛋白酶6.050100300～6
1.3.2 水解度
参考ADLER-NISSEN等的方法[7]。0.1 mL样液中依次加入1 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.2)和1 mL 0.1% TNBS溶液,混匀,50 ℃下避光反应60 min,而后加入2 mL 0.1 mol/L HCl溶液以终止反应,快速冷却至室温,340 nm处测定吸光度。以L-亮氨酸为标准品做标准曲线,根据公式(1)计算水解度:
水解度
(1)
式中:ω1,水解前的氨基氮质量分数,mg/g (蛋白);ω2,水解后的氨基氮质量分数,mg/g (蛋白);ω3,GMP完全水解后的氮质量分数,mg/g (蛋白)。
1.3.3 抗氧化活性测定
1.3.3.1 ABTS阳离子自由基清除能力
参考WANG等[8]的方法。取0.1 mL样液与3.9 mL ABTS工作液混匀,室温下避光反应10 min,734 nm处测定吸光度。以蒸馏水为阴性对照,以维生素C为阳性对照。根据公式(2)计算其ABTS阳离子自由基清除活性,且以维生素C当量/mL来表示:
ABTS阳离子自由基清除率
(2)
式中:A1,阴性对照吸光度;A2,样液或阳性对照吸光度。
1.3.3.2 DPPH自由基清除能力
采用NIE等[9]的方法测定。2 mL样液与2 mL DPPH自由基溶液(0.1 mmol/L,95%乙醇配制)混合均匀,室温下避光反应30 min,以蒸馏水为阴性对照,维生素C为阳性对照,517 nm处记录吸光度。根据公式(3)计算其DPPH自由基清除能力,且以维生素C当量/mL来表示:
DPPH自由基清除率
(3)
式中:A1,阴性对照吸光度;A2,样液或阳性对照吸光度。
1.3.3.3 
清除能力
采用HOMAYOUNI-TABRIZI等[10]的方法。0.1 mL样液与2.8 mL 1 mmol/L Tris缓冲液(pH 8.2)混合,加入0.1 mL 30 mmol/L焦性没食子酸引发反应,室温下反应4 min。以蒸馏水为阴性对照,维生素C为阳性对照,320 nm处每30 s测定其吸光度。
根据吸光度随时间变化的曲线计算斜率，即得到氧化速率。根据公式(4)计算其清除活性如下:
清除率
(4)
式中： V1,阴性对照氧化速率，Abs/min；V2,样液或阳性对照氧化速率，Abs/min。
1.3.4 对H2O2诱导RAW 264.7细胞氧化损伤的保护作用
1.3.4.1 细胞培养
RAW 264.7 细胞以RPIM1640(含10%胎牛血清,1%青霉素-链霉素双抗)为培养基,置于37 ℃、5% CO2的培养箱中进行培养。
1.3.4.2 细胞存活率的测定
将对数生长期的RAW 264.7细胞接种到96孔板(1×104/孔),在培养箱中37 ℃培养24 h后,分别加入100 μL样液使其终质量浓度为0.05、0.1、0.5、1 mg/mL,继续培养12 h,再加入100 μL 400 μmol/L H2O2共培养6 h。采用MTT法[11]测定细胞活力。对照组中未加H2O2和样液,其细胞存活率计为100%;双氧水组未加样液。
1.3.4.3 活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成量的测定
将对数生长期的RAW 264.7细胞分别接种到96孔板(1×104/孔)和6孔板中(5×105/孔),在培养箱中37 ℃培养24 h后,加入样液使终质量浓度为0.5 mg/mL,培养12 h,然后加入100 μL 400 μmol/L H2O2共培养6 h。采用DCFH-DA法[12]测定细胞ROS生成量,同时使用倒置荧光显微镜观察细胞ROS荧光强度。对照组中未加H2O2和样液;双氧水组未加样液,其ROS生成量计为100%。
所有实验至少重复3次,结果表示为平均值±标准差(SD)。采用GraphPad Prism 7.0软件对实验数据进行单因素方差检验(analysis of variance,ANOVA)及Tukey检验;P<0.05说明统计学上存在显著性差异。
蛋白酶种类对GMP酶解程度的影响如图1所示。随着酶解时间的增加,GMP酶解程度逐渐增加而后趋于平缓,其中中性蛋白酶对GMP的酶解作用明显优于木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶,后二者之间并无明显差异。这可能是因为:(1)GMP分子中苏氨酸、谷氨酸、脯氨酸等氨基酸残基所占比例较高,基本不含酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸残基[2];(2)蛋白酶作用位点不同,其中碱性蛋白酶作用位点主要为酪氨酸、苯丙氨酸、色丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等氨基酸残基,木瓜蛋白酶作用位点主要为赖氨酸、精氨酸、甘氨酸和半胱氨酸等氨基酸残基,而中性蛋白酶作用位点相对广泛,并可酶切苏氨酸残基[13]。
当酶解至4 h时,水解度基本趋于平缓,中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶等对GMP的酶解程度分别为(11.82±0.58)%、(9.77±0.92)%和(9.01±0.58)%。该水解度低于已有的研究,如O’SULLIVAN等[14]采用碱性蛋白酶酶解酪蛋白,水解度可达(18.01±1.59)%,这是源于GMP独特的氨基酸组成,其可供蛋白酶的作用位点较少。结果表明,中性蛋白酶对GMP的酶解程度较大。
图1 蛋白酶种类对GMP酶解程度的影响
Fig.1 Effects of protease type on enzymolysis degree of GMP
ABTS阳离子自由基、DPPH自由基和常用于体外抗氧化评价[15]。GMP经不同蛋白酶酶解后,其酶解产物对ABTS自由基、DPPH自由基和的清除作用如图2所示。
a-ABTS阳离子自由基;b-DPPH自由基;
图2 蛋白酶种类对GMP酶解产物清除自由基能力的影响
Fig.2 Effects of protease type on free radical scavenging ability of GMP hydrolysate
与GMP相比,GMP酶解产物(N-GMPH,P-GMPH和A-GMPH)均表现出较强的ABTS阳离子自由基、DPPH自由基和清除能力,且随着酶解时间的延长,总体上呈现增加而后趋于平缓的趋势。一般来说,蛋白质酶解程度增加,肽段携带的电子数量增加,这有利于肽段与自由基结合,从而阻断自由基反应[16]。但酶解1～2 h所得到的P-GMPH,其ABTS阳离子自由基和清除能力发生下降,而后呈现上升趋势,这可能与其酶解产物组成有关,推测是初期产生的某些大分子肽段具有较好的抗氧化活性,但随着酶解时间增加,该肽段发生降解,导致抗氧化活性降低;随着GMP进一步降解形成大量的小分子肽段,其抗氧化活性增加。
当酶解至4 h后,GMP酶解产物对ABTS阳离子自由基和的清除能力达到平缓,N-GMPH的效果均优于P-GMPH和A-GMPH,其清除ABTS阳离子自由基的能力可达到(73.32±2.93)mg维生素C当量/mL,远高于白肛海地瓜多肽(44.92 mg维生素C当量/mL)[17],且清除率达到(12.00±1.17)%。当酶解1 h后,GMP酶解产物对DPPH自由基的清除能力达到平缓,但P-GMPH[(1.57±0.11)mg维生素C当量/mL]的效果略高于N-GMPH[(1.23±0.17)mg 维生素C当量/mL],明显高于A-GMPH[(0.84±0.1)mg维生素C当量/mL]。上述结果说明,GMP酶解产物清除各自由基的能力与水解度之间并不完全符合对应关系;包斐等[18]得到相似的结果。究其原因是蛋白酶种类不同,GMP酶解产物中的肽段在结构和含量上存在很大的差异。综合比较,选用中性蛋白酶对GMP酶解4 h制备N-GMPH,进行细胞抗氧化损伤研究。
2.3.1 氧化模型的建立
H2O2进入细胞后可转化为·OH,具有较强的氧化能力,故常用H2O2建立细胞氧化应激模型。H2O2处理对RAW 264.7细胞存活率的影响如图3所示。结果表明,随着H2O2浓度的增加,细胞存活率下降,说明其诱导了细胞的氧化损伤。其中400 μmol/L H2O2可降低细胞存活率降至(54.72±0.45)%,因此选择400 μmol/L浓度进行实验。
图3 H2O2处理对RAW 264.7细胞存活率的影响
Fig.3 Effect of H2O2 treatment on RAW 264.7 cell viability
2.3.2 N-GMPH对H2O2诱导RAW 264.7细胞存活率的影响
GMP经中性蛋白酶酶解4 h后,其酶解产物N-GMPH对RAW 264.7细胞存活率的影响如图4所示。结果表明,GMP预处理对RAW267.4细胞存活率影响较弱,说明其对细胞氧化损伤基本无保护作用;而N-GMPH预处理可显著提高RAW 264.7细胞存活率(P<0.05),这是因为:(1)与GMP相比,N-GMPH本身具有更高的自由基清除能力(图2);(2)N-GMPH含有较多的小分子肽,其容易发生跨膜转运进入细胞内,淬灭H2O2在细胞内经代谢产生的ROS[19],从而发挥抗氧化损伤作用。凌玉芳[20]亦发现,使用双酶(胃蛋白酶-胰蛋白酶)对乳清蛋白进行酶解,其酶解产物显著提高细胞存活率,可改善H2O2所致的PC12细胞氧化损伤。
此外,N-PMPH对RAW 267.4细胞氧化损伤的保护作用呈现浓度正相关;当酶解产物质量浓度为0.5和1 mg/mL时,可将RAW 267.4细胞存活率提高至(79.32±1.85)%和(80.70±1.23)%,二者之间无显著性差异。因此,选用质量浓度为0.5 mg/mL N-GMPH进行后续实验。
图4 N-GMPH对H2O2诱导RAW 264.7细胞存活率的影响
Fig.4 Effects of N-GMPH on H2O2-induced RAW 264.7 cells viability
注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.3.3 N-GMPH对H2O2诱导RAW 264.7细胞内ROS生成量的影响
过量ROS会破坏细胞内氧化和抗氧化系统之间的平衡,导致氧化应激,从而进一步破坏细胞的结构和功能[21],所以ROS水平可用于反映细胞氧化损伤程度。GMP经中性蛋白酶酶解4 h后,其酶解产物N-GMPH对H2O2诱导RAW 264.7细胞内ROS生成量的影响如图5所示。H2O2显著提高了RAW 264.7细胞中ROS生成量,说明细胞氧化损伤主要源于ROS的大量增加。GMP可降低ROS生成量,但下降程度仅为(6.29±0.76)%,这在一定程度上可解释GMP对细胞氧化损伤无保护作用(图4);而N-GMPH显著减少细胞中ROS生成量至(44.50±2.29)%,该结果验证了其具有良好的抗氧化活性。
同时,荧光倒置显微镜可观察到(图6),对照组细胞呈现弱绿色荧光,H2O2处理后则显示出强烈的绿色荧光,意味着细胞中ROS水平明显增加,进一步证明H2O2诱导了细胞的氧化应激;与H2O2组相比,0.5 mg/mL GMP与N-GMPH预处理后细胞的绿色荧光强度均发生了不同程度的减弱,尤其是后者荧光强度显著降低,该结果与细胞内ROS生成量(图5)基本一致。杜梦霞[22]、马萍等[23] 亦发现,豆类蛋白酶解产物可显著降低细胞内的ROS水平。由此推测,N-GMPH可通过消除细胞中ROS恢复胞内氧化还原平衡,从而减轻胞内脂质、蛋白质和DNA等生命物质的损伤,达到缓解H2O2诱导细胞氧化损伤的作用。
图5 N-GMPH对 H2O2诱导RAW 264.7细胞内ROS生成量的影响
Fig.5 Effects of N-GMPH on ROS production of H2O2-induced RAW 264.7 cells
a-空白组;b-H2O2组;c-GMP;d-N-GMPH
图6 N-GMPH对H2O2诱导RAW 264.7细胞内ROS水平的影响(200×)
Fig.6 Effects of N-GMPH on ROS levels in H2O2-induced RAW 264.7 cells
本文主要探究了GMP酶解产物清除自由基能力及其对细胞氧化损伤的保护作用。研究发现,GMP酶解产物的自由基清除能力明显高于GMP,且与蛋白酶种类有关;与P-GMPH和A-GMPH相比,N-GMPH 表现出较强的ABTS阳离子自由基和清除能力,而DPPH自由基清除能力略低于P-GMPH。酶解4 h所得到的N-GMPH可有效降低H2O2诱导的RAW 246.7细胞ROS水平,提高细胞活力,说明其能有效保护细胞免受氧化损伤。综上所述,N-GMPH是一种潜在的高效抗氧化肽,可作为功能配料应用于食品加工中;后期可进一步研究N-GMPH在氧化应激相关信号通路的调节作用。
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Abstract Glycomacropeptide (GMP) hydrolysates from casein were prepared by hydrolysis with neutral protease, papain and alkaline protease. The suitable protease types and enzymolysis time were determined based on free radical scavenging activity. Then, the protect effect of GMP hydrolysates on cell line RAW 264.7 were investigated. The results showed that all the GMP hydrolysates could scavenge free radicals including ABTS cation ion, DPPH and 
The hydrolysate obtained by neutral protease for 4 h (N-GMPH) exerted strong free radical scavenging activity, and markedly increased the viability of RAW 264.7 cells along with the obvious decrease in ROS production. In conclusion, N-GMPH could alleviate oxidative damage in cells. The results provide supports for N-GMPH as a functional food ingredient.