粥是中国独特的饮食之一，历史悠久，传统的粥大多由五谷杂粮熬制而成。研究表明,有色米及杂粮比普通白色大米及浅色品种杂粮的营养成分尤其是多酚类化合物更加丰富[1]，如黑米平均的黄酮含量为0.305 g/100g，分别比红米和白米高17倍和33倍[2]，黑米还富含矢车菊素类和芍药素类活性成分[3-4]，使黑米具有抗氧化、抑菌、防治贫血[5]、抗衰老、抑制动脉粥样硬化[6]等多种生理功能。目前，人们对熬粥的食材种类搭配和口感关注较多，而忽略了不同原料之间的配比对粥营养成分的影响，且目前的研究大多局限于对粥原材料的分析，缺乏对原材料加工成粥之后、经过人体消化后的影响的研究。有研究表明，复合谷类粥比普通米粥有更强的自由基清除能力，复合米粥更具营养价值和研究价值[7]。APEA-BAH等[8]对高粱豇豆粥和玉米大豆粥研究发现体外模拟胃肠消化提高了其总酚和类黄酮的含量及抗氧化活性。为了使日常米粥可以最大限度在人体内发挥营养保健作用，需要进一步研究不同比例不同原料中的活性物质在加工过程中是否具有相互作用以及人体消化过程对其生物活性的影响。
因此，本实验以黑米为基本原料，与高营养价值、有一定抗氧化能力的黑麦、黑豆、紫米、红米这4种作物分别熬制复配营养米粥。采用胃肠体外模拟消化，研究消化前后不同种营养米粥中多酚、黄酮及花青素的含量、抗氧化活性的变化，以及不同原材料再加工过程中的相互影响，为今后有色米粥的开发利用提供一定的借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑米、紫米、红米产地均为陕西汉中洋县，黑麦产地为山东临沂，黑豆产地为贵州安顺。胃蛋白酶(800～2 500 U/mg)、猪胰酶、胆盐，美国Sigma公司；福林酚试剂，上海源叶股份有限公司；没食子酸、儿茶素，国药集团化学试剂有限公司；DPPH，日本TIC有限公司。
1.2 仪器与设备
JRC-2000超声波清洗机，济宁市润通超声电子有限公司；JP-150A-8高速多功能粉碎机，永康式久品工贸有限公司；101-2AB电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；UV1800紫外可见分光光度计，日本岛津公司。
1.3 实验方法
1.3.1 米粥的熬制
黑米、黑麦、黑豆、紫米、红米在水中浸泡2 h，按配方搭配混合(每份粥原料总重80 g，以质量比1∶1、3∶1、5∶1将黑米分别与黑麦、黑豆、紫米、红米混合)，每份加入400 mL水，用电饭锅熬粥功能煮开后再熬制1 h，冷却后的成品粥在-50 ℃下冷冻干燥72 h后装于样品袋置于-20 ℃保存待用。
1.3.2 米粥的模拟胃肠消化
参考陆俊等[9]的方法，称取10 g冻干样品，加入去离子水使总重达到110 g并搅拌均匀，用1 mol/L HCl将样品悬浊液pH值调至2.0，再加入0.5 mL模拟胃液(0.5 g胃蛋白酶溶于5 mL 0.01 mol/L HCl)，用锡纸将锥形瓶包好以避光，充入氮气后在37 ℃的恒温水浴摇床中模拟胃消化2 h。第二阶段是模拟肠消化，向悬浊液中加入1 mol/L NaHCO3至pH值为7.0，加入1 mL模拟肠液(4 g胰酶、25 g胆汁提取物溶于1 L 0.1 mol/L NaHCO3缓冲溶液)，包好锡纸，充入氮气后在37 ℃的恒温水浴摇床中消化2 h，4 000 r/min离心10 min，取上清液备用。
1.3.3 米粉和米粥提取液的制备
米粉和米粥提取液的制备参考SUN等[10]的方法并适当修改。首先按实验设计的配比进行各种样品的混合，其中原料米粉进行粉碎并过40目筛。再取1 g粉碎好的米粉或米粥样品放入锥形瓶中，加入20 mL含0.1% HCl的70%(体积分数)甲醇溶液超声40 min(功率500 W，40 kHz)，以4 000 r/min离心15 min，取上清液，沉淀加10 mL酸化甲醇重复上述步骤，合并2次所得提取液备用。
1.3.4 总酚、总黄酮和花青素的测定
1.3.4.1 多酚的测定
多酚含量的测定采用福林-酚试剂比色法，参照BURSAL等[11]的方法。取250 μL样品提取液置于25 mL的比色管中，用蒸馏水定容至23 mL，再加入500 μL 的福林酚试剂和300 μL 10%(质量分数)的碳酸钠溶液，静置30 min，在760 nm处用紫外分光光度计测定其吸光度。以100 g干样品中的毫克没食子酸当量(gallic acid equivalent,GAE)(mg GAE/100g DW)表示样品中多酚的含量。
1.3.4.2 黄酮的测定
参照ZIELINSKI等[12]采用的亚硝酸钠-氯化铝法测定黄酮并稍作修改。取250 μL样品提取液置于5 mL的离心管中，加2 720 μL的30%(体积分数)乙醇，再加120 μL亚硝酸钠溶液(0.5 mol/L)，摇匀，反应5 min后，加120 μL氯化铝(10%,质量分数)反应5 min，再加800 μL 1 mol/L NaOH溶液，在510 nm处测吸光度，30%乙醇空白调零，以100 g干样品中毫克儿茶素当量(catechin equivalent)(mg CE/100g DW)计算黄酮含量。
1.3.4.3 花青素的测定
参考LEE等[13]的方法，采用pH示差法测定花青素的含量。分别用pH 1.0的HCl-KCl缓冲液和pH 4.5的CH3COOH-CH3COONa缓冲溶液适当稀释。在20～50 min内，分别在520、700 nm处测吸光度值，以蒸馏水做空白对照。花青素含量计算如公式(1)所示：
总花青素
(1)
式中：A=(A520nm-A700nm)pH1.0-(A520nm-A700nm)pH 4.5；MW(分子质量)=449.2 g/mol，矢车菊-3-葡萄糖苷的分子质量；DF=稀释倍数；ε=26 900 L/(mol·cm)，矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数。
1.3.5 协同抗氧化活性的研究
1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的测定
DPPH自由基清除能力参照周玮婧等[14]的方法进行测定。
1.3.5.2 等辐射分析图的绘制
参考刘瑾等[15]的方法绘制等辐射分析图，将单一食材粥清除DPPH自由基的IC50标于横、纵坐标，用A、B表示；连接2个IC50值即得相加效应线；依据剂量-效应回归方程得出95%的置信区间，并使之相连；根据公式(2)计算理论复配值(IC50 add)将实际测量值(IC50 mix)与理论值进行统计学比较分析，利用等效线图解法对复配米粥食材之间的相互作用进行分析。
(2)
式中：R为A、B 2种原料单独应用时的效价比，即R=IC50 A/IC50 B；P1为原料A在复配组中所占的比例；P2为原料B在复配组中所占的比例，P2=1-P1。
1.3.5.3 相互作用指数(γ)
参考丁煌等[16]的方法，用γ来评价2种原料间协同或拮抗作用的程度，计算如公式(3)所示：
(3)
式中：IC50 Amix、IC50 Bmix分别为复配组中A、B 2种粥中的IC50值；IC50 A、IC50 B分别为A、B 2种粥单独作用时的IC50值。若γ=1，表示相互作用为相加；若γ<1，表示相互作用为协同；γ值越小说明协同作用越强；若γ>1，表示相互作用为拮抗。
1.3.6 数据分析
利用GraphPad Prism7.0进行IC50值的计算，利用SPSS 20软件进行统计分析。P<0.05则认为有显著性差异，P<0.01则认为有极显著性差异。
2 结果与分析
2.1 米粥原材料中多酚、黄酮和花青素含量
单一的5种食品原料和12种复配的米粥原料粉碎后经酸化甲醇提取，原料粉提取液中多酚、黄酮和花青素的含量如图1所示。大部分不同配方的原料在抗氧化成分含量上存在显著性差异(P<0.05)。复配前的5种原料粉中，以黑米的多酚和黄酮含量最高。与陆俊等[9]的研究结果一致。复配后的多酚和黄酮含量大于2种单一原料而小于2种原料相加(除黑米黑豆以质量比为3∶1的多酚含量最多外)。此外，黑米紫米、黑米黑麦和黑米红米配方中3个比例的多酚含量均随着黑米比例占比的增加而增多。对于花青素含量，则是黑米紫米质量比为1∶1的配方最高(图1-c)，这与紫米中含有较丰富的花青素含量有一定关系。
a-多酚含量；b-黄酮含量；c-花青素含量
图1 不同原料粉中多酚、黄酮和花青素含量
Fig.1 The cotent of phenolics, flavonoids and anthocyanin in different material powder
注：图中同一柱形图的不同字母表示有显著性差异(P<0.05)， 相同字母表示无显著性差异(P>0.05)(下同)
2.2 有色米粥模拟体外消化前后多酚、黄酮和花青素含量
如图2～图4所示，经过熬制成粥后，3种活性成分含量均明显低于未熬制前的含量，这可能是由于熬制过程中高温破坏了部分活性成分所致。熬制成粥后再经过模拟体外消化，17种粥的3种抗氧化活性成分多酚、黄酮含量相对于未消化均显著提高。对于单一原料熬制的5种粥，以黑米粥多酚含量最高[(324.38±2.245) mg/100g DW]。对于复配米粥，以黑米黑豆粥的多酚含量增长最多，且在4种复配粥中不同质量比的米粥消化后多酚含量提升的程度也明显不同，除黑米黑麦粥消化后多酚含量最多的质量比为1∶1外，其余的黑米紫米粥、黑米黑豆粥和黑米红米粥消化后多酚含量均为质量比3∶1的最高。对于体外模拟消化后各样品的黄酮含量，4种原料单独熬制的米粥也以黑米最高。复配后黑米紫米粥和黑米黑豆粥消化后黄酮含量接近于组成原料中黄酮含量的加和。其中以黑米紫米质量比3∶1的配方黄酮含量最高[(1 409.97±2.648) mg/100g DW]，显著高于黑米和紫米单独熬制的粥中的黄酮含量。而黑米黑麦粥和黑米红米粥2种粥的3个配方中的黄酮含量均低于各自组成原料中黄酮含量的加和。原因可能是消化环境使多酚和黄酮的的存在形式发生改变，从而使其进一步释放[17]。这与APEA-BAH等[8]的研究结果相似，经过体外胃肠道消化的粥，总酚和类黄酮的含量能显著提高，自由基清除活性等抗氧化能力增强。就花青素含量而言，5种原料单独熬制的米粥和12组复配米粥模拟体外消化后，花青素含量与各自未消化组别相比均呈下降趋势。王月华等[18]对蓝靛果模拟体外消化后花青素含量降低了67.6%，而总酚含量增加了48.2%，变化趋势与本实验相似。出现此现象的原因可能是肠消化过程的碱性环境使得花青素不稳定而被降解。但值得注意的是复配的黑米黑麦粥和黑米红米粥无论消化与否，与其单一原料的花青素相比，复配后花青素含量呈显著增加趋势。其原因有待进一步研究。
2.3 复配米粥消化前后DPPH自由基清除能力
5种单一食材及不同复配粥消化后清除DPPH自由基活性见表1。17种粥经过模拟消化后，其清除DPPH自由基的活性均比消化前有了显著的提升。消化前的单食材粥中，以红米粥的活性最强(IC50=3.12 mg/mL)，经过模拟人体胃肠消化后黑麦粥的活性最强。而消化前的复配粥中，分别以黑米红米粥活性最好，经过模拟消化后，以黑米黑麦质量比1∶1的活性最高。这可能是由于很多活性成分在酶或酸碱性环境下被释放出来，如消化酶也可能将部分多酚分解或转化，从而提高抗氧化性，产生了更好的抗氧化活性[19]，使其IC50值显著小于模拟体化消化前的IC50值。
A-黑米紫米；B-黑米黑麦；C-黑米黑豆；D-黑米红米
图2 不同配方米粥模拟体外消化前后多酚含量
Fig.2 The content of polyphenolics of different composite rice porridge before(after) simulated digestion in vitro
A-黑米紫米；B-黑米黑麦；C-黑米黑豆；D-黑米红米
图3 不同配方米粥模拟体外消化前后黄酮含量
Fig.3 The content of flavonoids of different composite rice porridge before(after) simulated in vitro
A-黑米紫米；B-黑米黑麦；C-黑米黑豆；D-黑米红米
图4 不同配方米粥模拟体外消化前后花青素含量
Fig.4 The content of anthocyanin of different composite rice porridge before(after) simulated digestion in vitro
表1 单一和复配粥模拟体外消化前后清除DPPH 自由基的IC50值
Table 1 The IC50 value of DPPH radical scavenging ability of single(composite) porridge before and after simulated digestion in vitro
样品IC50/(mg·mL-1)单一粥或复配粥复配中的黑米组分复配中的其他组分黑米粥8.49(1.22)//紫米粥13.23(1.30) //黑麦粥44.42(0.30) //黑豆粥17.62(0.48) //红米粥3.12(1.13)//黑米紫米粥1∶13.60(1.61)1.80(0.81)1.80(0.81)黑米紫米粥3∶15.23(0.96)3.92(0.72)1.31(0.24)黑米紫米粥5∶13.70(1.02)3.08(0.85)0.62(0.24)黑米黑麦粥1∶19.89(0.62)4.94(0.31)4.94(0.31)黑米黑麦粥3∶18.59(0.48)6.44(0.36)2.15(0.12)黑米黑麦粥5∶111.07(1.38)9.42(1.15)1.85(0.23)黑米黑豆粥1∶113.68(1.14)6.84(0.57)6.84(0.57)黑米黑豆粥3∶112.20(1.08)9.15(0.81)3.05(0.27)黑米黑豆粥5∶113.76(1.14)11.46(0.95)2.30(0.19)黑米红米粥1∶12.53(1.46)1.27(0.73)1.27(0.73)黑米红米粥3∶12.33(1.00)1.75(0.75)0.59(0.25)黑米红米粥5∶12.20(1.36)1.83(1.13)0.37(0.23)
注：括号内为模拟消化后IC50值
2.4 Isobologram法分析复配黑米粥评价不同食材之间的相互作用
根据表1所得的IC50值绘制复配黑米粥消化前后的等辐射分析图，结果见图5、图6。消化前，黑米紫米粥和黑米红米粥的2种配方的效应点均落在相加线的95%可信限下方(左侧)，表明这2种食材搭配熬制的粥所含的抗氧化成分有较强的协同抗氧化作用。与之相反，黑米黑豆粥的效应点均落在相加线的95%可信限的上方(右侧)，表明这两者之间是拮抗作用。黑米黑麦粥在质量比为1∶1和3∶1时有协同抗氧化作用，5∶1时则表现为拮抗作用。这些差异可能是由各食材中的不同抗氧化活性物质发挥协同或拮抗作用所导致的。盛雪飞[20]研究了6种黄酮类化合物在不同浓度下的协同抗氧化作用，发现一些类黄酮单体单独作用时具有很好的抗氧化活性，与其他类黄酮单体组合时，则具有良好的协同效应，因此，推测本实验中出现的协同抗氧化作用也可能是由于不同原料中包含黄酮在内的多酚类化合物相互作用的结果。
模拟体外消化后，呈现协同抗氧化作用的营养米粥种类减少，只有黑米紫米粥3∶1、黑米紫米粥5∶1、黑米黑麦粥3∶1仍然呈现协同抗氧化作用、而模拟消化前为拮抗作用的黑米红米粥3∶1消化后则呈现协同抗氧化作用。其他组的仍为拮抗作用，由此可见，体外模拟消化处理对复配米粥的相互作用效果产生了显著的影响。
2.5 复配米粥的相互作用指数γ
按照上述方法及相应公式计算复配组理论上的IC50 add值和γ，对理论IC50 add值和实验IC50 mix值在95%置信区间进行t检验，结果见表2。
表2 四种复配米粥体外模拟消化前后相互作用指数
Table 2 The interaction index of four kinds of composite black rice porridge before and after simulated digestion in vitro
复配粥质量比IC50 mix/(mg·mL-1)IC50 add/(mg·mL-1)γ1∶13.59(1.61)10.44(0.81)0.34(1.29)黑米紫米粥3∶15.23(1.12)9.37(1.24)0.56(0.78)5∶13.69(1.17)9.06(1.23)0.41(0.83)1∶19.89(0.62)14.26(0.49)0.69(1.28)黑米黑麦粥3∶18.59(0.62)10.65(0.69)0.81(0.81)5∶111.07(1.38)9.82(0.81)1.15(1.70)1∶113.68(1.14)11.46(0.69)1.19(1.66)黑米黑豆粥3∶112.19(1.08)9.76(0.88)1.25(1.23)5∶113.76(1.14)9.30(0.97)1.48(1.18)1∶12.53(1.26)4.57(1.00)0.55(1.25)黑米红米粥3∶12.33(1.00)5.94(1.44)0.39(0.84)5∶12.20(1.36)6.60(1.36)0.33(1.13)
注：括号内为模拟消化后相关数据
消化前复配米粥的统计学分析结果如表2所示，经过t检验证明理论IC50 add值和实验值IC50 mix值有显著性差异。黑米紫米粥和黑米红米粥的γ都<1，横向比较发现IC50 mix值均小于IC50 add值，表明黑米紫米粥和黑米红米粥都是协同抗氧化作用。黑米紫米粥质量比为1∶1时γ最小，协同抗氧化作用最强，黑米红米粥的配比为5∶1时γ最小，协同作用最强。黑米黑麦粥为1∶1、3∶1时的IC50 mix值小于IC50 add值，呈现协同作用。黑米黑豆粥的IC50 mix值均大于IC50 add值，且质量比为1∶1时拮抗作用最强。经过消化处理后，呈现抗氧化协同作用的米粥配方为黑米紫米粥3∶1、5∶1，黑米黑麦粥3∶1及黑米红米粥3∶1的IC50 mix值小于IC50 add值，且γ<1。营养米粥的抗氧化成分相互作用的等辐射分析与相互作用指数分析结果是一致的。
a-黑米紫米复配粥；b-黑米黑麦复配粥；c-黑米黑豆复配粥；d-黑米红米复配粥；
图5 体外模拟消化前4种复配米粥的Isobologram分析图
Fig.5 Isobologram analysis of four kinds of composite rice porridge before simulated digestion in vitro
注：相加线上的矩形(
)代表理论IC50 add值，实心点(
)代表实验IC50 mix值(下同)
a-黑米紫米复配粥；b-黑米黑麦复配粥；c-黑米黑豆复配粥；d-黑米红米复配粥
图6 体外模拟消化后4种复配米粥的Isobologram分析图
Fig.6 Isobologram analysis of four kinds of composite black rice porridge after simulated digestion in vitro
对比消化后4种复配米粥，当黑米紫米粥、黑米黑麦粥、黑米红米粥的质量比为3∶1时γ最小，协同作用最强。由此可得出，消化前黑米红米粥的协同作用最为显著，消化后黑米紫米粥的协同作用更好，尤其是质量比为3∶1时最好。因此在熬制这4种复配米粥时以黑米与其他食材质量比为3∶1时可呈现更好的抗氧化作用。
3 结论
体外模拟消化对5种单一原料的粥和12种不同配方的复配黑米粥的抗氧化活性成分及抗氧化活性产生了显著影响。熬制成粥后会导致活性成分含量的下降，但经过体外消化处理后，米粥的多酚、黄酮的含量均较消化前显著提高，花青素含量则有所下降，清除DPPH自由基的IC50值均明显减小，抗氧化活性增强。等辐射分析图和相互作用指数的结果都表明按质量比进行配比得到的复配米粥的协同抗氧化程度有明显差异。经过消化处理后，复配米粥的抗氧化协同作用均有减弱趋势，但黑米紫米粥、黑米黑麦粥和黑米红米粥均在质量比为3∶1时表现出较强的协同抗氧化作用，黑米黑豆粥在3种比例下均表现为拮抗作用。因此在熬制复配米粥时以黑米与紫米、黑麦、红米质量比为3∶1复配时可呈现更好的抗氧化作用，不建议将黑米与黑豆搭配食用。米粥中产生协同抗氧化作用的物质尚不明确，体外模拟与人体真实的消化吸收也存在一定差异，有待进一步研究探索。
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