牛肉富含多种营养物质，且脂肪含量低，受到广大消费者青睐，同时营养物质也给微生物生长繁殖提供了良好的环境，导致牛肉极易腐败变质，使牛肉在贮藏、销售过程中货架期较短[1]。目前，冷鲜肉的贮藏运输主要是传统的冷藏和冻藏，分别存在货架期短和解冻时牛肉品质下降的问题[2]。冰温保鲜是将食物贮藏在0 ℃到冰点以上的温度，这样既不会破坏食物本身的组织结构和代谢活动，又能抑制微生物的生长，而且减缓了营养物质的损失，尽可能保持食物原有的品质[3]。MURASE[4]研究表明在冰温下保存食物可以防止细胞的破坏，抑制有害微生物的活动并延长保存期。关文强等[5]研究指出冰温条件贮藏(-2.5 ℃)牛肉保鲜期时长是冷藏(4 ℃)条件下的2倍，能将保鲜期延长至24 d。
可食性复合膜能够有效减少冷鲜肉汁液流失和微生物污染，且易于降解，不会造成环境污染，符合当今人们对环保的要求[6-7]。添加天然保鲜剂的薄膜不仅具有良好的保鲜效果，还具有缓释作用，减少了对牛肉气味的影响[8]。OJAGH等[9]制备了含有肉桂精油的壳聚糖抗菌膜，提高了其抗菌性能。郑玉玺等[10]研究发现添加荔枝木精油的可食膜可有效延长冷鲜鸡肉的货架期。可食膜包装和冰温保鲜作为近几年冷鲜肉及果蔬保鲜的新技术已有报道，但2种保鲜技术结合对冷鲜肉类保鲜效果的研究却鲜有报道。
本研究以牛背最长肌为试验材料，将复合膜与冰温贮藏技术相结合，通过测定牛肉在不同贮藏期pH，肉色，菌落总数，挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen, TVB-N)及硫代巴比妥酸反应物(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)值的变化，并结合感官评价，探究不同浓度迷迭香精油复合膜协同冰温保鲜对牛肉的保鲜效果。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
牛肉采自甘肃康美现代农牧产业集团有限公司，选取生长发育良好、健康无病、年龄3～4岁的西门塔尔牛。屠宰经4 ℃排酸72 h后取牛胴体中部背最长肌包装后冷藏运回实验室测定。果胶，北京索莱宝科技有限公司；迷迭香叶，泰州市美食佳食品有限公司；氧化镁、硼酸、氯化钠、2-硫代巴比妥酸、盐酸、三氯乙酸等，均为分析纯，天津市光复科技发展有限公司。
1.2 仪器与设备
QL-HWHS-100L可程式恒温恒湿试验箱，合肥安科环境试验设备有限公司；Testo-205pH计，上海德图仪器有限公司；Konica CR-10色差计，柯尼卡美能达光电股份有限公司；鑫思特HT-9815便携式数显温度计，东莞鑫泰仪器仪表有限公司；SP-756P紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；K9840自动凯氏定氮仪，济南海能仪器股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 迷迭香精油制备
称取迷迭香叶100 g粉碎后过80目筛，置于3 000 mL蒸馏烧瓶中，加入1 000 mL蒸馏水微沸蒸馏2 h，分离收集得到迷迭精油。
1.3.2 果胶-迷迭香精油复合膜制备
称取3 g果胶溶于100 mL去离子水中，在50 ℃水浴条件下搅拌至果胶完全溶解，甘油含量为2%(质量分数)，分别加入1.5%，2.0%，2.5%(体积分数，以果胶溶液体积为准)迷迭香精油乳化10 min，静置达到自然脱气，用流延法将膜液倒入20 cm×20 cm平板模具中，室温放置72 h成膜，揭膜得到不同精油含量复合膜。
1.3.3 肉样处理
在超净工作台无菌条件下剔除肉样可见筋膜及脂肪，并将肉样分割成约5 cm×5 cm×3 cm的肉块。
1.3.4 试验设计
对照组肉样冰温贮藏：[(-1.3±0.1) ℃，ice temperature storage, ITS]; 处理组用复合膜将肉样包裹后冰温贮藏: 冰温贮藏+1.5%复合膜(ice temperature storage & 1.5%composite film, 1.5% ICF)、冰温贮藏+2.0%复合膜(2.0% ICF)、冰温贮藏+2.5%复合膜(2.5% ICF)。具体如图1所示。测定其0、3、6、9、12、15、18、21、24、27 d的pH值、色度、菌落总数、TBARS值、TVB-N含量并进行感官评价。
a-包裹后肉样；b-冰温贮藏
图1 包裹后肉样及其冰温贮藏
Fig.1 Meat samples of wrapped and storage at ice temperature
1.3.5 测定指标
1.3.5.1 牛肉冰点温度测定
参照孙天利[3]的方法，采用冻结法测定肉样冰点。将肉样切割成约5 cm×5 cm×3 cm大小，将便携式数显温度计探头插入肉样中心并置于-18 ℃冷柜，从0 ℃开始记录肉样中心温度变化，每分钟记录1次数据。
1.3.5.2 pH测定
用便携式pH计对肉样进行测定。将探头插入到肉样中，使其电极与肌肉组织充分接触，待pH计读数稳定后记录。
1.3.5.3 色度测定
参照杨斌等[1]的方法，并稍作修改。将肉样横断面在室温条件下自然氧合30 min，校准色差计后垂直于肉样横断面测定L*(亮度)、a*(红度)和b*(黄度)。
1.3.5.4 菌落总数测定
参照GB/T 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定》[11]，肉样选取合适的稀释倍数进行培养计数。
1.3.5.5 TBARS值测定
参照GB/T 5009.181—2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》[12]分光光度法测定。
1.3.6.6 TVB-N含量测定
参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[13]半微量定氮法测定。
1.3.5.7 感官评价
参考关文强等[5]的方法，并略作修改。选择本实验室经过感官评价训练的15名人员，对肉样色泽，气味，弹性及黏性进行评分，每项指标满分为10分，见表1，综合得分为4项指标平均得分。
表1 感官评分标准
Table 1 Sensory scoring standards
评分评价指标色泽气味弹性黏性10切面鲜红均匀,有光泽具有新鲜牛肉的气味,无异味弹性好,用指按压后能立即恢复无渗水,表面不发黏8切面较鲜红均匀,有光泽具有牛肉气味,无异味弹性较好,用指按压后能恢复略有渗水,表面不发黏6切面较暗红,无光泽稍有异味,但不明显弹性较差,用指按压后略有恢复渗水较多,表面不发黏4切面暗红,无光泽有异味,比较明显弹性差,用指按压后不能恢复渗水较多,表面发黏2切面灰褐色,无光泽有异味,不可接受无弹性,用指按压后存在凹陷渗水较多,表面严重发黏
1.4 数据统计分析
试验平行次数为3～5次，数据用Excel软件进行统计与分析，SPSS 22.0 Duncan′s多重比较分析显著性(P<0.05)，结果用平均值±标准差表示，Origin 9.0绘图。
2 结果与分析
2.1 牛肉冰点温度的确定
冰温是指从0 ℃到食物初始结冰点的温度范围，大多数食物的初始结冰点范围在-0.5～-2.8 ℃[3]。牛肉冰点是牛肉进行冰温试验的关键参数，图2为牛肉冻结温度曲线，牛肉中心温度在前23 min内迅速下降至-1.4 ℃，达到牛肉的过冷点，随后在-1.4 ℃维持 5 min 后回复到-1.3 ℃，这一过程称为过冷现象[14]，此时样品放出潜热达到牛肉的冻结点。随后33 min在-1.4～-1.3 ℃波动，之后温度迅速下降，肉样开始冻结。因此，将-1.3 ℃作为牛肉冰温贮藏温度。
图2 牛肉中心温度变化曲线图
Fig.2 The center temperature change curve of beef
注：图中大写字母不同表示同一贮藏时间不同处理间 差异显著(P<0.05)(下同)
2.2 牛肉贮藏期间pH值的变化
pH的变化可以反映牛肉品质的变化[15]。不同处理组牛肉随贮藏时间pH变化如图3所示，牛肉初始pH值为5.56，随着贮藏时间延长pH逐渐上升，可能是微生物代谢和蛋白质降解产生碱性物质导致[16]。ICF组pH上升慢于ITS组，可能是迷迭香精油中酚类等物质抑制了微生物的代谢和蛋白质分解[17]。第27天时ICF和ITS组pH值分别为6.30和6.48，存在显著性差异(P<0.05)。随着迷迭香精油浓度的增大，延缓牛肉pH上升作用明显，HUSSAIN等[18]发现用不同浓度肉桂精油处理对藏羔羊pH上升也有抑制作用，表明复合膜协同冰温贮藏对延缓牛肉pH上升具有良好的效果。
2.3 牛肉贮藏期间色度的变化
肉色是牛肉品质的重要指标之一，直接影响消费者的嗜好程度，良好的肉色可以增加消费者的购买欲望[19]。不同处理组牛肉在不同贮藏时间色度变化如表2所示，L*和a*贮藏期间均呈现先上升后下降的趋势。ICF组在贮藏过程中L*变化较小，显著(P<0.05)低于ITS组，可能原因是迷迭香精油中酚类物质延缓了蛋白质的变性，导致肌肉中自由水扩散减少，对光的反射能力减弱，使L*变化较小[2]。贮藏前期，肌红蛋白会与氧气结合生成氧合肌红蛋白(oxymyoglobin，MbO2)，使a*不断上升，贮藏后期由于微生物代谢和脂质氧化产生自由基破坏高铁肌红蛋白(metmyoglobin，MetMb)还原酶，致使肉中MbO2逐步转变为MetMb，导致a*值呈不断下降的趋势[1]。ICF组在整个贮藏期间，a*变化小于ITS组，且存在显著差异(P<0.05)，可能原因是迷迭香精油酚类物质可以抑制MbO2的自动氧化，从而提高肉色的稳定性[20]，说明复合膜协同冰温贮藏能够有效减缓a*的变化。b*的变化整体呈现升高趋势的，ICF组b*变化小于ITS组，这与TBARS值的变化具有一致性，可能是肌肉中脂肪发生氧化所致，与陈景宜等[21]研究牛肉肉色稳定性的结果一致。综上，复合膜协同冰温贮藏对牛肉肉色变化具有良好的抑制作用，且精油浓度越大，对肉色劣变抑制作用越好。
图3 不同贮藏时间牛肉pH变化
Fig.3 Changes of beef pH in different storage times
2.4 牛肉贮藏期间菌落总数的变化
微生物的大量繁殖不仅会造成食物腐败变质，而且微生物代谢可能会产生毒素等有害物质，对身体健康造成影响[22]。牛肉在不同贮藏条件下菌落总数变化如图4所示，牛肉初始菌落总数为2.90 lgCFU/g，随着贮藏时间的延长菌落总数均出现上升趋势。ICF组较ITS组增长缓慢，可能是迷迭香精油中多酚类物质抑制了微生物的生长繁殖[23]。第27天时ICF组菌落总数为5.63 lgCFU/g，ITS组菌落总数为6.21 lgCFU/g，ICF组显著低于ITS组(P<0.05)，这与秦丹丹等[24]研究发现黑木耳多糖/壳聚糖可食性复合膜对牛肉菌落总数的抑制具有类似的结果，且精油浓度越大对微生物生长抑制作用越强，说明该复合膜协同冰温贮藏对微生物的生长繁殖有一定的抑制效果。
表2 不同贮藏时间牛肉色度变化
Table 2 Changes of color of beef at different storage times
组别贮藏时间/d0369121518212427L∗39.03±0.67A43.37±0.45A44.36±0.42A49.26±0.41A52.03±0.42A50.40±0.36A50.20±0.66A50.10±0.10A48.27±0.29A46.80±0.26AITSa∗10.53±0.49A11.80±0.72A13.33±0.35A13.83±0.31A15.33±0.23A13.27±0.25A10.27±0.85A10.43±0.40A8.83±0.75A7.97±0.35Ab∗5.85±0.19A8.03±0.38A12.80±0.30A12.10±0.20A14.43±0.61A13.60±0.70A12.73±0.67A12.10±0.50A14.43±0.55A14.73±0.21AL∗39.03±0.67A41.57±0.55B42.66±0.65B46.43±0.21B50.83±0.61B47.53±0.29B45.40±0.30C48.20±0.50B46.87±0.41C45.20±0.20BC1.5% ICFa∗10.53±0.49A10.10±0.66B12.63±0.31B14.47±0.29A12.30±0.40B9.80±0.46B9.43±0.38A8.83±0.68A7.27±0.65AB7.93±0.75Ab∗5.85±0.19A7.84±0.22A12.87±0.76A12.33±0.32A13.13±0.29AB11.53±0.49B10.57±0.35C11.33±0.50AB13.06±0.32BC13.23±0.90BL∗39.03±0.67A42.07±0.38B43.27±0.75B45.57±0.21C50.43±0.64B47.26±0.40B47.40±0.26C47.23±0.32C47.73±0.25B45.27±0.15B2.0% ICFa∗10.53±0.49A10.8±0.66AB12.8±0.50B14.23±0.15A12.30±0.26C9.30±0.36B10.23±0.45A7.53±0.38A8.17±0.64AB6.57±0.47BCb∗5.85±0.19A7.23±1.23AB11.37±0.50B12.10±0.53A13.53±0.51B11.30±0.56B11.67±0.55B11.00±0.10B13.57±0.55AB13.20±0.66BL∗39.03±0.66A41.60±0.36B41.66±0.40C45.73±0.57BC48.67±0.40C47.83±0.60B48.63±0.21AB47.00±0.36C48.37±0.23A44.80±0.36C2.5% ICFa∗10.53±0.49A10.77±0.86AB11.47±0.15C14.13±0.42B13.70±0.56C9.20±0.46B8.17±0.31B8.06±0.42A8.10±0.26C7.50±0.72Cb∗5.85±0.19A6.18±0.24B11.93±0.67AB12.30±0.45A13.20±0.66B11.33±0.21B10.60±0.17C11.57±0.68AB12.03±0.65C12.87±0.55C
注：表中肩标大写字母不同表示同一贮藏时间不同处理间差异显著(P<0.05)
图4 不同贮藏时间牛肉菌落总数变化
Fig.4 Changes in the total bacteria of beef during different storage times
2.5 牛肉贮藏期间TBARS值的变化
脂质过氧化是贮藏食品质量恶化主要因素之一，是决定牛肉感官、功能和营养品质的主要因素[25]。肉中油脂发生氧化产生次级氧化产物丙二醛，其含量可以评价脂质氧化的程度[26]。牛肉不同贮藏时间TBARS值变化曲线如图5所示，随着贮藏的时间延长，牛肉TBARS值均呈现上升趋势。在贮藏至第27天时ITS组从0.12 mg/kg增长到0.79 mg/kg，而ICF组从0.12 mg/kg增长到0.65 mg/kg，显著低于ITS组(P<0.05)，可能原因是迷迭香精油中酚类物质的抗氧化性减缓了脂质氧化，且浓度越高抑制作用越强，这与姜蕾等[27]发现迷迭香提取物可以有效减轻萨拉米脂肪过氧化的结果一致，表明复合膜协同冰温贮藏优于冰温贮藏，减缓脂质氧化。
图5 不同贮藏时间牛肉硫代巴比妥酸反应物值变化
Fig.5 Changes in beef TBARS value during different storage times
2.6 牛肉贮藏期间TVB-N含量的变化
TVB-N含量是检验肉及肉制品新鲜度的重要指标[28]。参照GB 2707—2016肉的新鲜度可划分为3个等级：TVB-N<15 mg/100g为一级鲜度，15≤TVB-N≤20 mg/100g为二级鲜度，TVB-N>20 mg/100g为腐败肉。不同贮藏时间牛肉TVB-N变化如图6所示，初始TVB-N含量为5.36 mg/100g，ICF组较ITS组上升缓慢。贮藏至27 d时，ITS组TVB-N含量达到25.6 mg/100g，1.5%ICF组为21.08 mg/100g，已经达到腐败变质肉标准，而2.0%ICF和2.5%ICF组为分别为19.59、18.39 mg/100g，仍然保持在二级鲜肉范围内，且存显著性差异(P<0.05)。这可能是复合膜中迷迭香精油抑制了蛋白氧化和微生物代谢，导致TVB-N含量较低[29]，且随着精油添加量的增大，抑制效果越明显，表明复合膜协同冰温贮藏能够有效抑制蛋白氧化和微生物代谢，对牛肉有良好的保鲜效果。
图6 不同贮藏时间牛肉总挥发性盐基氮含量变化
Fig.6 Changes in the TVB-N content of beef during different storage times
2.7 牛肉贮藏期间感官得分的变化
感官评价是权衡鲜肉品质最直接、最直观的指标。不同贮藏时间牛肉感官得分变化如图7所示，随贮藏时间的延长感官得分均逐渐降低。由于微生物及脂质氧化等作用导致牛肉色泽、气味及组织状态逐渐发生劣变。在第27天时ITS组感官得分为1.39，而ICF组感官得分为2.07，但存在迷迭香精油的气味，影响牛肉原有的气味。第27天时ICF组组内1.5%ICF感官得分为2.33，2.0%ICF感官得分为1.97，2.5%ICF感官得分为1.91，这与胡云峰等[30]研究较高浓度肉桂精油处理会影响大鲵本身的气味的结果具有一致性，考虑到对牛肉气味的影响，选取1.5%ICF时感官得分最高。
图7 不同贮藏时间牛肉感官得分变化
Fig.7 Changes of sensory scores of beef at different storage times
3 结论
本试验将复合膜与冰温贮藏相结合，探究了牛肉在不同贮藏时间新鲜度变化。测定出本试验牛肉冰点温度为-1.3 ℃，随着贮藏时间的延长，ICF组pH、色度、菌落总数、TBARS及TVB-N均显著低于ITS组(P<0.05)。综合感官得分，1.5%ICF组在第24天时仍保持在二级鲜肉标准，此时ITS组已经腐败变质。因此，果胶-迷迭香精油复合膜协同冰温贮藏对牛肉具有良好的保鲜效果和延长货架期作用。
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