三文鱼也称大西洋鲑(Salmo salar)，是一种具有重要经济价值的优质水产品，其肉质鲜美、口感良好，且富含蛋白质与多不饱和脂肪酸等营养成分，已越来越受到人们的青睐。联合国粮食与农业组织的统计结果表明，2019年，世界三文鱼产量已接近260万t，其中我国进口三文鱼达10万t。为了延长水产品的货架期以及抑制由微生物生长、蛋白质降解以及脂肪氧化引起的腐败[1]，冷藏是在运输过程以及贮存中一种重要的方式，是保持食品新鲜度最常用的方法之一，因为低温可以减缓化学反应和微生物反应，从而减缓食物腐败和变质[2]。但是在实际冷链运输过程中，很难保持温度恒定。所以，近年来越来越多的科学家们开始关注温度波动对水产品质量的影响[3]。

现如今，在冷藏的基础上已有多种延长水产品保质期的方法，例如高压处理、真空包装、气调包装等，其中，使用保鲜剂是保持水产品质量并延长其货架期的有效方法之一[4]。姜黄素，是一种从植物根茎(姜黄)中提取的天然酚类食品添加剂，在亚洲的许多国家传统用作香料和食品着色剂[5]，但是近年来的研究表明，姜黄素本身也具有抑制微生物生长的作用，应用到水产品中可以起到抗菌和抗氧化等作用[6]。GONG等[7]利用姜黄素的生物活性将其运用在延长鲟鱼的货架期中；MERAL等[8]也通过实验证明姜黄素由于其抗菌作用可以用于虹鳟鱼中，以保证虹鳟鱼的品质。胡椒碱，是从天然植物黑胡椒中提取的活性成分，能够提高一些药物和植物化学物质的生物利用度[9]。梁晓明等[10]研究了胡椒碱对豇豆的保鲜作用，证明胡椒碱可以延长豇豆的保藏期。

大量研究表明，与使用单一保鲜剂相比，使用复合保鲜剂具有更好的保鲜效果，因为其协同作用得到增强[4]。目前，姜黄素与胡椒碱在水产品保鲜中的应用尚在起步阶段，对三文鱼的保鲜效果尚不清楚。本研究将姜黄素、胡椒碱及其复合保鲜剂分别应用在模拟冷链运输过程中的三文鱼中，通过对三文鱼片进行各理化指标的测定，并结合低场核磁共振和核磁成像技术，来分析姜黄素与胡椒碱对冷链运输过程中三文鱼的保鲜作用，为研究天然植物提取物在水产品中的保鲜方法提供思路和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冰鲜挪威三文鱼(从挪威运往上海市浦东新区泥城大润发，约3 d左右)，后置于铺满碎冰的0 ℃冷藏箱内运至实验室。

平板计数琼脂 (plate count agar, PCA)、铁琼脂培养基、假单胞菌CFC选择性培养基、MRS琼脂选择培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；氧化镁、硼酸、氯化钠、2-硫代巴比妥酸、吖啶橙(acridine orange，AO)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色剂，生工生物工程上海(股份)有限公司；三氯乙酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

PQ 001纽迈台式脉冲核磁共振分析仪，上海纽迈公司；CR-400型 色差计日本尼康公司；UV-2100 紫外-可见分光光度计，美国尤尼柯仪器有限公司；TA.XT Plus 质构仪，英国Stable Micro System 公司；Kjeltec8400 凯氏定氮仪，丹麦FOSS公司；H-2050R 台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；VS-1300L-U型超净台，苏净安泰集团。

1.3 原料预处理

将冰鲜三文鱼去头、去尾、去皮，分割后随机分成4组(每份约200 g)。参考王一鑫等[11]及前期预实验的实验效果，设置分别以0.5 mg/mL的姜黄素、0.5 mg/mL的胡椒碱以及0.5 mg/mL姜黄素+0.5 mg/mL胡椒碱复合保鲜液的保鲜剂组，以用5%的乙醇溶液浸泡处理作为对照组，将4组样品分别在保鲜液中浸泡处理30 s后沥水，装入聚乙烯保鲜袋(约200 g/袋)，分别放在模拟冷链物流过程中(具体温度波动如图1所示)，分别于0、2、4、5、6、7 d进行相关指标测定。

1.4 试验方法

1.4.1 质构

参考张新林等[12]的方法进行测定。将三文鱼切成约3 cm×3 cm×3 cm均一大小的鱼块，测试条件：测试前速率：3 mm/s；测试速率：1 mm/s；测试后速率：1 mm/s；压缩程度：50%；停留间隔5 s；探头类型：Auto-5 g；数据收集率：200。

1.4.2 持水力(water holding capacity, WHC)

参照WANG等[13]的方法进行测定。

1.4.3 挥发性盐基氮(total volatile base nitrogen，TVB-N)含量的测定

取鱼样5 g左右，根据GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[14]，根据半微量定氮原理，利用设定好程序的全自动凯氏定氮仪测定鱼样TVB-N值，做3次平行，取平均值。

1.4.4 硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)值的测定

参照WANG等[15]的方法。

1.4.5 游离氨基酸的测定

参照谭明堂等[16]的方法进行。

1.4.6 菌落总数及嗜冷菌总数的测定

每组取25 g样品，参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[17]检测方法，将所得PCA培养基分别于30 ℃和4 ℃温度条件下培养48 h和7 d后计数。

1.4.7 产H2S菌菌落数的测定

参照ZHU等[18]的方法进行实验，在铁琼脂培养基30 ℃培养3 d后计数。

1.4.8 假单胞菌菌落数的测定

参照LI等[19]的方法进行实验。

1.4.9 乳酸菌菌落数的测定

参照SALLAM等[20]的方法进行实验。

1.4.10 激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscop, CLSM)分析

参考WICKRAMASINGHE等[21]的方法，用无菌手术刀将鱼肉样本切成薄片。通过在1 mL去离子水中添加5 μL AO和5 μL PI来制备荧光染料。将100 μL的混合染料混合物添加到每个肌肉切片中。将染色的样品在黑暗中于25 ℃的室温下孵育15～20 min。然后使用无菌钳取出样品，并将其放在干净的载玻片上。将玻璃盖玻片轻轻放在每个肌肉切片的顶部，并对样品成像并将样品在63×油镜下成像。

1.4.11 低场核磁共振(low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)与核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)分析

参照王硕等[22]的方法进行测定。

1.5 数据处理

使用Excel 2010软件和SPSS 20对数据进行处理, 并用Origin 2018软件绘制图像。

2 结果与分析

2.1 质构

硬度值为第1次压缩的最大力，弹性表示样品在第1次压缩过程中变形后物理回弹的程度[23]。图2显示了冷链物流过程中三文鱼在不同处理条件下的质构(硬度、弹性)变化。新鲜三文鱼肉质坚实，弹性较好。在冷链物流过程中，4组样品三文鱼的硬度和弹性呈现下降趋势，但复合保鲜剂处理的样品与对照组相比品质保持较好，在第7天时，对照组的硬度及弹性较另外3组更低，尤其是硬度在冷链物流过程中明显下降得较处理组更快。鱼肉硬度和弹性的下降可能与肌原纤维降解有关[12]。实验结果表明，温度波动会显著影响三文鱼的质地，这一结果与王硕等[22]的研究结果一致。而姜黄素与胡椒碱在一定程度上可以延缓三文鱼在温度波动条件下的品质下降，尤其是复合保鲜剂可以保持鱼肉较好的质地。

2.2 持水力

持水力反映鱼肉在受到外力作用时保持原有水分以及防止水分流失的能力[24]。不同处理方式对冷链物流过程中的三文鱼片的影响如图3所示。由图3可以看出，经过保鲜剂处理的三文鱼肉的持水力更高，复合保鲜组的持水力达到了83.74%，姜黄素处理组与胡椒碱处理组分别为82.53%、82.62%，而对照组仅有80.75%。在冷链物流过程中4组三文鱼的持水力均下降，这可能是由蛋白质的氧化分解造成的[25]。在第7天时，对照组、姜黄素处理组、胡椒碱处理组及复合处理组的持水力分别为74.58%，78.60%，76.59%与80.64%，表明姜黄素与胡椒碱均能抑制三文鱼肉中持水力的降低，而复合保鲜剂处理效果更为明显。

2.3 TVB-N

TVB-N值是评估水产品腐败变质和新鲜度的重要指标之一[26]，其增加主要是与腐败微生物和内源酶的活性有关[27]。如图4所示，在冷链物流过程中所有处理组的TVB-N值呈上升的趋势，对照组的TVB-N值在贮藏过程中始终上升较其他3组处理组更快，尤其是在第7天时，已达到了23.05 mg N/100g，而复合保鲜剂处理组在第7天仅达到15.1 mg N/100g，姜黄素与胡椒碱处理组的TVB-N值达到了15.99和17.63 mg N/100g，说明保鲜剂的保鲜效果显著，并且2种保鲜剂的复合保鲜剂的效果更加明显，保鲜剂能通过抑制微生物分解鱼肉进而抑制挥发性碱性氮化合物(例如三甲胺，二甲胺和氨等)的产生[7]。

2.4 TBA值

TBA值是评估脂质氧化程度的重要指标之一[28]。由于三文鱼富含脂肪和多不饱和脂肪酸，因此三文鱼容易发生脂质氧化，并且产生难闻的气味[1]。如图5所示，在冷链物流过程中4种不同处理组的TBA值在前期呈明显上升趋势，对照组的TBA值从0.29 mg/100g上升至0.54 mg/100g，而复合保鲜组仅从0.22 mg/100g上升至0.33 mg/100g，表明保鲜剂处理可以通过抑制鱼肉发生自动氧化和水解作用，延缓鱼肉的品质劣变[29]。在第6天时TBA值开始下降，TBA值的降低可能是由于丙二醛与其他化合物反应，产生不与硫代巴比妥酸反应的产物[30]。

2.5 游离氨基酸

游离氨基酸是对加工或贮存期间的水产品风味产生重大影响的物质之一[31]。图6显示了在冷链物流过程中三文鱼在不同处理方式下总游离氨基酸含量的变化。第0天各组样品中，经保鲜剂处理的三文鱼总游离氨基酸含量更高，但在贮藏过程中基本保持稳定，在贮藏末期时复合保鲜剂组的含量为415.44 mg/100g，单一姜黄素与胡椒碱处理组的含量分别为467.68、423.84 mg/100g，而对照组在贮藏过程中总游离氨基酸含量呈明显上升趋势，贮藏7 d后达到了520.39 mg/100g。游离氨基酸是蛋白质逐级结构改变进而发生降解的产物[32]，但同时也是可被微生物利用分解产生氨、小分子胺类以及含硫化合物等小分子气味物质的前体物质[33]，因此其消长变化主要是内源蛋白酶和微生物共同作用的结果。

表1显示为各游离氨基酸具体变化情况。结果显示，三文鱼中含量最高的游离氨基酸为赖氨酸，其次为半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸，其中赖氨酸是尸胺的前体物质[33]，而谷氨酸和甘氨酸是鲜味氨基酸，对三文鱼的风味有重要影响[7]，在贮藏末期，对照组中的谷氨酸和甘氨酸含量明显增多，而保鲜剂处理组的含量上升较少，尤其是复合保鲜剂处理组，结合后文的微生物菌落总数的变化，说明保鲜剂处理能够抑制微生物的生长，进而抑制其对蛋白质的降解利用，使游离氨基酸的累积放缓[32]。

2.6 菌落总数及嗜冷菌总数

图7为冷链物流过程中三文鱼在不同处理方式下对菌落总数及嗜冷菌总数的变化。新鲜三文鱼样品对照组以及经过不同保鲜剂处理后的菌落总数分别为3.79、3.17、3.42、2.92 lgCFU/g，可以看出经过保鲜剂处理的三文鱼菌落总数稍有下降，并且可以看出三文鱼的初始值较低，表明鱼肉具有良好的品质。贮藏到第4天时，三文鱼的菌落总数开始增长迅速，并且对照组的样品要高于另外3组样品，在第6天时就达到了7.79 lgCFU/g，已经超过了国际食品微生物委员会规定的微生物限值(7 lgCFU/g)，而复合保鲜剂处理组在贮藏末期仅达到6.96 lgCFU/g。嗜冷菌的增长趋势与菌落总数类似，对照组在贮藏末期达到了7.78 lgCFU/g，姜黄素、胡椒碱以及复合处理组分别为7.41、7.75、6.87 lgCFU/g。这表明嗜冷菌为三文鱼中的主要微生物之一，单一保鲜剂组中姜黄素与胡椒碱均能在一定程度上抑制微生物的生长繁殖，其中姜黄素的抑制效果略高于胡椒碱。复合保鲜剂处理的抑制效果最好，能在一定程度上延长三文鱼的货架期。

2.7 产H2S菌总数的测定

产H2S菌是海水鱼类中最重要的腐败微生物之一，主要包括希瓦氏菌属、沙雷氏菌属、气单胞菌属等，它们可以产生三甲胺和H2S，并且具有较强的蛋白质水解活性[34]。如图8所示，产H2S菌数在贮藏过程中的变化趋势与菌落总数类似，对照组的新鲜三文鱼样品中的产H2S菌数为1.92 lgCFU/g，而在贮藏末期，其增长到了7.02 lgCFU/g(约占菌落总数的16.52%)。相比之下，姜黄素、胡椒碱及复合保鲜剂处理组在贮藏末期的产H2S菌数较低，分别为5.92 lgCFU/g(约占菌落总数的3.90%)、6.7 lgCFU/g(约占菌落总数的11.38%)与5.80 lgCFU/g(约占菌落总数的6.97%)，说明保鲜剂在一定程度上能够抑制产H2S菌的生长。

2.8 假单胞菌总数的测定

如图9所示，新鲜三文鱼样品中假单胞菌菌落数(3.62 lgCFU/g)约占菌落总数的66.99%，随着贮藏时间的延长，对照组假单胞菌菌落数不断增加，至贮藏末期其占到菌落总数的142.89%，表明假单胞菌是三文鱼的优势腐败菌之一，这与SALLAM[20]和李婷婷等[35]的研究结果一致。在贮藏末期，不同处理方式下(对照、姜黄素、胡椒碱、复合)的假单胞菌总数分别为7.95、7.44、7.79、7.02 lgCFU/g，即通过保鲜剂处理的三文鱼样品的假单胞菌总数明显减少，说明保鲜剂对假单胞菌也同样具有一定的抑制作用。姜黄素是一种酚类物质，主要通过作用于细菌的酶系统和生物膜系统来抑制微生物[36]，而在早期的研究结果表明胡椒碱具有提高姜黄素的抑菌活性的能力，将其复配使用可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等微生物生长[11, 36]。

2.9 乳酸菌总数的测定

图10为三文鱼中乳酸菌菌落数的变化，乳酸菌的致腐能力较弱，但是在同型发酵过程中会产生大量乳酸，在异型发酵过程中产生CO2，可导致水产品的pH下降，产生酸臭味[37]。初始样品中未经处理的新鲜样品中的乳酸菌总数为2.74 lgCFU/g，保鲜剂处理组的总数分别为2.22、2.52、2.14 lgCFU/g。在贮藏期间的整个过程中可以看出，经过保鲜剂处理的乳酸菌总数明显低于对照组，说明保鲜剂对乳酸菌的抑制有明显效果，并且复合保鲜剂的抑制效果最好，在贮存末期仅达到3.77 lgCFU/g，而对照组达到了5.80 lgCFU/g。

2.10 CLSM

CLSM是一种使用一对针孔孔径从光学切片过程中获取聚焦图像的技术，可以通过对连续体积进行采样以生成三维图像[38]。根据染色原理，AO发出绿色荧光，可以对活细胞和死细胞进行染色，PI发出红色荧光，可以对死细胞进行染色[39]。图11的CLSM图像表明，三文鱼样品的肌肉组织被染为红色，由于三文鱼肉的表面存在微生物，所以样品表面被AO染成绿色。由图11可以看出，贮藏初期的三文鱼样品表面的绿色分布较少，而到贮藏末期样品表面的绿色分布变多，并且向肌肉组织内部延伸，这种现象表明在贮藏过程中微生物的生长繁殖。通过保鲜剂处理的样品表面的绿色更少，这也说明保鲜剂处理抑制了微生物的生长繁殖，与前面的微生物计数得到的结果相符。

2.11 LF-NMR和MRI

LF-NMR和MRI技术可以用来分析冷链物流过程中三文鱼的水分分布及其迁移变化规律。三文鱼在冷链物流过程中不同处理方式下的水分迁移情况如图12所示，各组的弛豫时间(T2)均显示出3个峰，这与王蒙等[40]的研究结果相类似，3个峰对应了三文鱼样品中的3种水分状态：T21(0～1 ms)为强结合水，主要是与三文鱼中的大分子紧密结合，故在贮藏过程中该部分水分变化不明显；T22(44～52 ms)为不易流动水，主要是存在于肌原纤维和膜之间的水，这一部分的水分会随着贮藏时间的延长而降低，这可能主要是由于肌原纤维结构的破坏，不易流动水在贮藏过程中向自由水(T23)转变；T23(412～720 ms)为存在于肌原纤维结构之外的自由水，具有最长弛豫时间。在贮藏过程中，复合保鲜剂处理组的T22的初始信号强度高于另外3组，但随着贮藏时间的延长也同样呈下降趋势。这可能也与保鲜剂抑制了微生物对蛋白质的分解有关。

MRI如图13所示，其中水分子密度较高的区域具有较红较亮的颜色，而水分子密度较低的区域具有较蓝较暗的颜色[41]。可以看出随着贮藏时间的延长，4组样品的颜色均从较红的颜色向蓝色转变，说明三文鱼的水分含量在逐渐减少，并且在贮存末期对照组的颜色最蓝，说明在贮藏末期对照组的水分流失最多，而复合保鲜组样品的颜色在贮藏过程中明显较另外3组更鲜艳，说明其中的水分流失最少，有可能是由于三文鱼肉组织结构破坏最少，从而保证了三文鱼的新鲜度。

3 结论

本实验研究了姜黄素保鲜剂、胡椒碱保鲜剂以及2种物质的复合保鲜剂对冷链物流过程中的三文鱼的品质影响、微生物变化及水分迁移变化。结果表明，随着时间的延长，不同处理组的硬度、弹性以及持水力均有不同程度的下降，而TVB-N、TBA、游离氨基酸以及菌落总数、嗜冷菌总数、产H2S菌数、假单胞菌数和乳酸菌数均有不同程度的上升，但都显示出保鲜剂处理组的保鲜效果优于对照组。根据CKSM的图像也同样可以看出复合保鲜剂处理组可以较好地抑制微生物的生长繁殖。从LF-NMR 横向弛豫时间T2和核磁成像图中可以看出，不易流动水T22在贮藏过程中逐渐降低，而自由水T23逐渐上升，其中对照组的变化最为明显，而复合保鲜剂处理组变化相对较小。综合上述评价结果，姜黄素与胡椒碱的复合保鲜剂可以较好地保证三文鱼的品质，延缓三文鱼的品质劣变。

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The effect of curcumin combined with piperine on quality of salmon (Salmo salar) in cold chain logistics

YU Yingjie1,LIN Ting1,YANG Shengping1,2,3,4,QIU Weiqiang1,2,3,4, XIE Jing1,2,3,4*,QIAN Yunfang1,2,3,4*

1(College of Food Science and Technology Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China) 2(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing & Preservation, Shanghai 201306, China) 3(Shanghai Professional Technology Service Platform on Cold Chain Equipment Performance and Energy Saving Evaluation, Shanghai 201306, China) 4(National Experimental Teaching Demonstration Center for Food Science and Engineering (Shanghai Ocean University), Shanghai 201306, China)

ABSTRACT In order to investigate the effects of curcumin and piperine on salmon (Salmo salar) quality during cold chain logistics transportation, physiochemical indicators (hardness, springiness, water holding capacity (WHC), total volatile basic nitrogen (TVB-N), thiobarbituric acid reactive substances (TBA), free amino acids), microbial indicators (total mesophilic bacteria count, total psychrotrophic bacteria count, H2S-producing bacteria count, Pseudomonas count and lactic acid bacteria count) were measured in this study. The confocal laser scanning microscope (CLSM) and low-field nuclear magnetic resonance (LF-NMR) were used to study the spread mode of bacteria and water migration of salmon fillets. The results showed that the total mesophilic bacteria count in the untreated control sample reached 7.80 lgCFU/g after storage for 7 d, while the curcumin combined piperine treatment group only reached 6.96 lgCFU/g. The CLSM image also showed that the composite preservative could inhibit the growth of microorganisms in the salmon sample, and the decrease of texture and WHC were also been inhibited during storage. Moreover, the results of LF-NMR revealed that the two preservatives could maintain the freshness of salmon samples, and the effect of composite preservative was the best which including 0.5 mg/mL curcumin + 0.5 mg/mL piperine.

Key words salmon; curcumin; piperine; confocal laser scanning microscope (CLSM); low-field nuclear magnetic resonance (LF-NMR); cold chain logistics

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.026357

引用格式:俞滢洁，林婷，杨胜平，等.姜黄素结合胡椒碱对冷链物流运输过程中三文鱼保鲜效果的影响[J].食品与发酵工业,2021,47(20):152-160.YU Yingjie,LIN Ting,YANG Shengping, et al.The effect of curcumin combined with piperine on quality of salmon (Salmo salar) in cold chain logistics[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(20):152-160.

第一作者：硕士研究生(谢晶教授和钱韻芳讲师为共同通讯作者，E-mail：jxie@shou.edu.cn；yfqian@shou.edu.cn)

基金项目：国家“十三五”重点研发课题项目(2016YFD0400106)；农业部海水鱼产业体系(CARS-47)；2016年上海市科技兴农重点攻关项目[沪农科攻字(2016)第1-1号]；上海市科委平台能力建设项目(16DZ2280300)；上海市科委公共服务平台建设项目(17DZ2293400)

收稿日期：2020-12-08，改回日期：2020-12-17