柚子，芸香科柑橘属一个重要的商业品种，在我国南方各省均有栽培[1]。除了被当作鲜食水果，柚子目前还被加工成果酱[2]、果脯[3]、饮料[4]等，而约占柚果30%～50%的柚皮作为主要加工副产物则常被丢弃或掩埋，既浪费资源又造成环境污染。现代科学研究表明，柚皮里含有丰富的类黄酮、膳食纤维、精油等成分[5]，具有降血脂、降血糖、止咳平喘等功效[6-8]。泡菜是我国的传统食品，它主要以果蔬为原料，经乳酸菌发酵后，达到延长保藏时间、增进风味的效果[9-10]。将柚皮加工成泡菜，不仅能保留柚皮特有的香气和功能，而且还能提高柚皮的风味及口感，显著提高其附加价值。
目前，关于柚皮经发酵加工成食品已有部分研究报道：俞耀茹等[11]研究开发了柚子酸奶，最佳工艺条件下制备的酸奶颜色微黄、有独特的柚子风味；游剑等[12]研制的风味型柚子果醋口感酸爽、滋味纯正。然而，对于柚皮接种发酵的研究报道较少，将接种发酵技术运用于柚皮泡菜中还未见报道。传统泡菜制作多以小作坊或家庭式生产为主，自然发酵的模式常出现杂菌污染、风味不稳定、发酵周期过长等问题，严重限制了泡菜生产工业化标准化的进程[13]。有研究发现接种发酵可以保证泡菜质量的稳定性、缩短发酵周期、降低亚硝酸盐含量[14]。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是目前工业化泡菜生产使用和研究最普遍的菌株，其发酵以生成乳酸为主，在泡菜发酵的中后期占主导地位[10]；乳酸芽孢杆菌(Bacillus sp.)DU-106筛选自传统发酵奶酪，具有耐酸和产酸能力强的特点，目前已被广泛应用于各类发酵食品的制作，显示出良好的发酵性能[15-17]。因此研究比较不同发酵方式对柚皮发酵泡菜品质、亚硝酸盐含量控制和风味的影响具有非常重要的意义。
基于此，本研究通过比较不同发酵方式处理的柚皮泡菜发酵期间的pH、总酸、亚硝酸盐含量及发酵成熟后游离氨基酸组成及挥发性成分，为美味可口、品质安全稳定、风味特征明显的新型柚皮泡菜生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
白肉蜜柚皮，由广东省梅州市大埔县顺兴种养股份有限公司提供；乳酸芽孢杆菌DU-106和植物乳杆菌，菌粉浓度为1012 CFU/g，由华南农业大学新资源与功能性原料研究及评价中心鉴定及保藏；氢氧化钠、盐酸、亚铁氰化钾、乙酸锌、硼酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、5-磺基水杨酸(均为分析纯)，广州化学试剂厂；亚硝酸钠标准溶液(200 μg/mL)，上海麦克林生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
PHs-3C pH计，上海精密科学仪器有限公司；UV-1100紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；DHP600电热恒温培养箱，北京市永光明医疗仪器厂；L-8900全自动氨基酸分析仪，日本日立公司；QP2010 Ultra气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司。
1.3 实验方法
1.3.1 柚皮泡菜的制备
将柚皮洗净、切分后，按柚皮∶盐凉开水(4%质量分数)=1∶2的质量比装入泡菜坛，再添加2%(质量分数)白砂糖搅拌均匀，按柚皮质量的0.1%分别添加乳酸芽孢杆菌DU-106和植物乳杆菌，于25 ℃下密封发酵。对照组为未接种自然发酵，发酵工艺与接种发酵组相同。每种处理设3组平行，密封发酵168 h，每隔24 h采样测定相关指标。
1.3.2 pH和总酸的测定
使用pH计对泡菜液直接测定。泡菜液总酸参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》进行测定，折算系数以乳酸0.090计。
1.3.3 亚硝酸盐的测定
柚皮泡菜中亚硝酸盐的测定参照GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》，采用盐酸萘乙二胺法。
1.3.4 游离氨基酸的测定
取发酵第7天泡菜液1 mL于离心管中，加入3 mL体积分数为5%磺基水杨酸溶液，振荡混匀后静置1 h，于12 000 r/min离心10 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液采用日立L-8900全自动氨基酸分析仪进行测定。
1.3.5 挥发性风味物质的测定
称取5 g发酵第7天样品置于50 mL顶空瓶中，加盖密封，60 ℃水浴平衡10 min后将65 μm DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶中吸附40 min，萃取后将纤维头插入气相色谱系统解吸3 min，解吸温度250 ℃。
GC-MS条件：毛细管柱为HP-5MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；前进样口温度250 ℃；载气(He)流速1.0 mL/min；不分流模式进样；升温程序：初始柱温50 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升至260 ℃，再以10 ℃/min升至280 ℃并保持5 min。离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃；离子化方式EI；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z 30～450。
数据分析：将质谱数据经计算机在NIST 14谱库检索，结合手动检索校对，选取匹配度>800(最大值为1 000)的成分作为定性结果。
1.3.6 感官评定
由通过感官分析培训的食品专业人员20名(男10名，女10名)组成感官评价小组对柚皮泡菜进行感官评定，分别从色泽、香气、滋味和总体可接受度进行评价，感官评分标准如表1所示。
表1 柚皮泡菜感官评定表
Table 1 Sensory evaluation standards of pomelo peel pickles
感官项目标准评分/分色泽均匀、有光泽16～25色泽(25分)色泽一般、少量光泽6～15色泽暗淡、无光泽1～5具有浓郁的发酵和柚皮香味,无异味16～25香气(25分)发酵、柚皮香味一般,无异味6～15无发酵、柚皮香味,有酸腐异味1～5滋味协调、酸咸适中16～25滋味(25分)滋味协调一般、酸咸度不够6～15滋味不协调、过酸或酸度不够1～5组织致密、液汁清亮、入口性好16～25体态(25分)组织一般、液汁较清亮、入口性一般6～15组织松散、液汁浑浊、入口性差1～5
2 结果与分析
2.1 泡菜发酵过程中pH和总酸的变化
pH和总酸的变化与泡菜的品质密切相关，是泡菜发酵过程中重要的理化指标[18]，柚皮泡菜发酵过程中的pH和总酸变化如图1所示。由图1-A可知，自然发酵组与接种组的pH变化趋势一致，所有组的柚皮泡菜在发酵前期pH迅速下降，后期逐渐稳定在3.5～4.0，接种组的下降速率比自然发酵组快，其中DU-106组在发酵24 h后pH已下降至4.0左右。这是因为接种组初始乳酸菌含量丰富，在发酵初期就能大量产酸，导致pH迅速下降；到达发酵后期时，进入稳定期，pH逐渐稳定，这与任亭等[19]的研究结果一致。由图1-B可知，各组总酸变化趋势相同，其中DU-106组的总酸在整个发酵过程中均明显高于自然发酵组和植物乳杆菌组，并在第7天达到最大值1.98 g/kg，表明乳酸芽孢杆菌DU-106能更快的适应此发酵体系，产酸能力更强。
A-泡菜发酵过程中pH的变化;B-泡菜发酵过程中 总酸的变化
图1 柚皮泡菜发酵过程中pH和总酸的变化
Fig.1 Changes of pH and titratable acidity in pomelo peel pickles during the fermentation
注：图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
2.2 泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量的变化
亚硝酸盐是一种广泛存在于泡菜中的致癌物质，其含量高低是判断泡菜是否能安全食用的一个重要指标[20]。柚皮泡菜发酵过程中的亚硝酸盐含量变化如图2所示。
由图2可知，接种组泡菜在整个发酵过程中亚硝酸盐含量均低于自然发酵组；3种发酵方式的泡菜在48或72 h时达到“亚硝峰”，其中自然发酵组的“亚硝峰”最高，含量达到7.7 mg/kg；DU-106组的“亚硝峰”最低，含量为2.7 mg/kg。在发酵初期，自然发酵组中的乳酸菌少而pH高，黄杆菌和革兰氏阴性菌等杂菌将柚皮体内的硝酸盐还原成亚硝酸盐，形成“亚硝峰”[21]；随着发酵进行乳酸菌成为优势菌群，其产生亚硝酸盐降解酶从而使亚硝酸盐含量下降。而接种组在发酵初期就含有大量乳酸菌，同时较低的pH也有利于亚硝酸盐的降解和抑制杂菌生长[22]。这表明接种乳酸菌有利于降低柚皮泡菜的亚硝酸盐含量，3种发酵方式的柚皮泡菜亚硝酸盐含量均低于国家标准限量(20 mg/kg)，满足泡菜食用安全性的要求。
图2 柚皮泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量的变化
Fig.2 Changes of nitrate in pomelo peel pickles during the fermentation
2.3 泡菜发酵终点时游离氨基酸含量变化分析
游离氨基酸是评价食品风味的一项重要指标，其含量高低会直接影响食品的风味和口感[23]。3种不同发酵方式的柚皮泡菜在发酵终点时，一共检测出了14种氨基酸，其中有6种必需氨基酸和8种非必需氨基酸，种类和含量具体如表2所示。
表2 柚皮泡菜发酵终点时的游离氨基酸含量 单位：μg/mL
Table 2 Free amino acid contents in pomelo peel pickles at the end of fermentation
氨基酸自然发酵DU-106发酵植物乳杆菌发酵天冬氨酸2.05±0.01b2.46±0.00a0.34±0.01c苏氨酸0.14±0.01a0.17±0.00a0.14±0.02a丝氨酸0.26±0.01a0.22±0.01b0.20±0.01b谷氨酸0.74±0.03c1.73±0.01a0.87±0.01b甘氨酸0.13±0.00b0.35±0.01a-丙氨酸0.91±0.02c2.74±0.03a1.34±0.01b缬氨酸 1.13±0.04b1.30±0.02a0.43±0.02c异亮氨酸0.05±0.00b0.08±0.01a0.03±0.00c亮氨酸0.12±0.01b0.18±0.02a0.09±0.01c酪氨酸0.15±0.00a0.14±0.01b0.08±0.00c苯丙氨酸0.31±0.02a0.21±0.01b0.15±0.00c赖氨酸0.09±0.01c0.27±0.01a0.12±0.00b组氨酸-0.28±0.01a0.21±0.00b精氨酸0.27±0.01a0.23±0.01b0.29±0.01a甜味氨基酸总量1.53±0.06c4.02±0.07a2.01±0.01b鲜味氨基酸总量2.79±0.02b4.19±0.01a1.21±0.02c苦味氨基酸总量2.02±0.05b2.13±0.04a1.07±0.02c游离氨基酸总量6.34±0.09b10.35±0.10a4.29±0.04c
注：“-”表示未检出；同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)(下同)
在发酵终点时，游离氨基酸总含量由高到低顺序为DU-106发酵>自然发酵>植物乳杆菌发酵；DU-106组的泡菜液中有14种氨基酸，且氨基酸总量达到了10.35 μg/mL，必需氨基酸总量达到了2.21 μg/mL，均显著高于其他2组；推测乳酸芽孢杆菌DU-106在发酵过程中产蛋白酶较为丰富[24]，促进了柚皮中蛋白质的降解，同时pH的迅速降低有利于抑制其他杂菌生长，减少杂菌利用氨基酸等营养物质繁殖，从而提高游离氨基酸的含量。依据氨基酸对滋味的贡献，本试验14种氨基酸中包括了6种甜味氨基酸(苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、组氨酸)、2种鲜味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)和6种苦味氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸)[25]，DU-106组的甜味氨基酸、鲜味氨基酸和苦味氨基酸含量均高于其他2组，且苦味氨基酸由于阈值较高，容易被泡菜的酸味和咸味所掩盖不易尝出，由此接种乳酸芽孢杆菌DU-106更有利于提升柚皮泡菜的感官品质和营养价值。
2.4 泡菜发酵终点时挥发性风味物质变化分析
挥发性香气是发酵食品的重要品质之一，是影响消费者接受程度和偏好的重要因素[26]。采用顶空固相微萃取-气质联用技术对3种不同发酵方式的柚皮泡菜进行分析，如表3所示，共测得74种挥发性物质，其中包括烯烃类43种，醇类16种，酯类5种，醛类7种及酮类3种。自然发酵、DU-106和植物乳杆菌发酵泡菜分别检测出香气物质56、52和49种，D-柠檬烯和月桂烯的相对含量最高，分别为52.170%、20.578%，52.925%、10.174%、53.739%和23.275%；这2种烯烃类具有柑橘和甜香味，是柚皮原料本身的特征香气。
表3 不同发酵方式对柚皮泡菜挥发性成分含量的影响
Table 3 Effects of different fermentation methods on volatile components of pomelo peel pickles
化合物名称气味描述相对含量/%自然发酵DU-106发酵植物乳杆菌发酵烯类D-柠檬烯甜味、柑橘味52.17052.97553.739月桂烯柑橘味、木香20.57810.17423.275吉马烯D木香3.5473.8843.645δ-榄香烯木香2.2572.3832.152β-衣兰烯1.2641.4681.176巴伦西亚橘烯柑橘味1.106--β-榄香烯甜味0.9720.9671.045β-胡椒烯0.8441.1801.565白菖烯0.816-0.731m-樟脑烯0.7840.8871.115γ-榄香烯油脂味0.6590.557-顺式-衣兰油-4(15),5-二烯0.5830.6100.469(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-十八烷三烯草香、花香0.557--顺-菖蒲烯香草味0.528--γ-衣兰油烯0.4820.744-g-杜松烯木香0.2791.4290.280β-蒎烯木香、薄荷味0.2649.6950.404α-荜澄茄烯蜡味0.2630.3010.3924-蒈烯0.2340.200-p-樟脑烯0.1880.2100.252d-杜松烯麝香草、木香0.1300.8990.721α-胡椒烯0.119--萜品油烯柠檬味、花香0.115-0.092a-杜松烯木香0.1040.1720.115四氢甲烷二烯0.0910.0650.029p-樟脑烯0.081--顺式-b-胡椒烯0.069--香橙烯木香0.066--荜澄茄油宁烯芒果味0.0650.115-m-樟脑烯0.058--1,3,8-p-薄荷烯木香0.057-0.063α-白菖考烯木香0.0530.0870.090γ-萜品烯柑橘味、柠檬味0.0490.0620.051衣兰烯0.0410.752-α-衣兰烯-1.0120.039罗勒烯热带水果-0.5100.548α-蒎烯蜂蜜味、木香-0.1960.188异松油烯-0.102-γ-萜品烯柑橘味、柠檬味-0.062-异长叶烯琥珀香--0.671ε-衣兰油烯--0.396α-考绕咖烯--0.042
续表3
化合物名称气味描述相对含量/%自然发酵DU-106发酵植物乳杆菌发酵环苜蓿烯--0.032总计89.47191.69793.319醇类香叶醇水果气味1.7150.4570.616D-香茅醇玫瑰花香0.9710.3580.465癸醇花香、橙香0.703--沉香醇柑橘味、木香0.4960.3320.2804-萜品醇0.2690.2390.165橙花叔醇花香0.1720.1490.182α-萜品醇酸橙味、花香0.1670.173-金合欢醇百合花香0.1370.0970.1161-壬醇蜡味、油脂味0.1050.0580.074新臭根子草醇0.092--t-依兰醇蜂蜜味0.0710.0390.0721-辛醇油脂味、柑橘味0.0690.0510.066异匙叶桉油烯醇0.0420.0360.055α-杜松醇木香-0.050-6-芹子烯-4醇--0.057总计5.0082.0372.148酯类乙酸香叶酯玫瑰香、薰衣草香0.5350.7800.534乙酸橙花酯玫瑰香、水果气味0.3720.3890.305辛酸己酯苹果味0.0720.0990.064乙酸辛酯蜡味-0.0340.030乙酸冰片酯木香、薄荷味--0.019总计0.9791.3030.951醛类癸醛油脂味0.3800.3530.384十二醛柑橘味0.2030.2010.194(2E,6Z)-2,6-十二碳二烯醛蜡味、草香0.1120.147-(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛柠檬味0.0570.2570.227 5,9,13-三甲基-4,8,12-十四碳三烯醛0.040--十一碳醛蜡味-0.0280.027总计0.7920.9850.832酮类诺卡酮柚子味1.2890.9350.5952-十三烷酮泥土味、坚果味-0.158-2-十一酮樱桃味-0.044-总计1.2891.1370.595
对于柚皮泡菜来说，虽然烯烃类是最丰富的成分，但由于醛、酯和醇等其他物质阈值较低，因而它们也是柚皮泡菜香气的重要贡献者。自然发酵组挥发性成分相对含量较高的有醇类，其相对含量达5.008%，主要原因是自然发酵过程中菌群结构复杂，酵母菌的代谢旺盛积累了大量醇类物质[27]。DU-106组和植物乳杆菌组中含量较高的是酯类和醛类；接种乳酸菌后其他类型微生物的生长繁殖被抑制，乳酸菌产生的中间产物如醛类较为丰富[28]；同时大量产生的酸可与醇类物质发生酯化反应使酯类物质的种类及含量增加，酯类物质具有的花香和果香有助于进一步丰富泡菜的风味。
2.5 泡菜发酵终点时感官分析
不同方式发酵的柚皮泡菜感官评定结果如表4所示。从色泽上来看，2组接种发酵的柚皮泡菜色泽均匀，呈柚皮独特的金黄色，自然发酵组呈白黄色，差异较为明显。3种发酵方式的柚皮泡菜在香气上得分差别不大，均有特有的柚皮和发酵香气，无其他异味。从滋味和体态来看，DU-106发酵组泡菜滋味协调、酸咸适中、无发软变质；自然发酵组发软严重，口感不佳。综合得分从高到低为DU-106发酵泡菜>植物乳杆菌发酵泡菜>自然发酵泡菜。DU-106发酵泡菜是3个发酵组中感官品质最好的；自然发酵组其色泽、滋味、体态感官品质较接种发酵组差。
表4 柚皮泡菜的感官评价 单位：分
Table 4 Sensory evaluation scores of pomelo peel pickles
感官指标自然发酵DU-106发酵植物乳杆菌发酵色泽19.0±1.63a21.7±1.89a22.0±0.82a香气20.5±1.22a20.3±1.70a17.6±0.90a滋味15.9±0.83b20.3±2.49a15.3±1.25b体态12.7±1.69b19.0±1.41a17.0±2.16b总分68.1±5.39c81.3±7.49a72.0±5.12b
3 结论
本实验探究了不同发酵方式对柚皮泡菜发酵过程中pH、总酸和亚硝酸盐的变化及对泡菜风味的影响。与自然发酵相比，接种乳酸芽孢杆菌和植物乳杆菌发酵能显著加快pH的下降速度，维持较高的总酸含量，降低泡菜中亚硝酸盐的含量，缩短发酵周期。
乳酸菌发酵后的泡菜香气成分种类及相对含量与自然发酵组差异不大，但从游离氨基酸含量和感官分析而言，接种乳酸芽孢杆菌DU-106组最优，其在游离氨基酸含量、滋味和体态方面都比其他2组有所改善。本研究为柚皮泡菜的生产研究和纯种发酵技术提高泡菜质量提供了前期的基础和理论依据。
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