弱酸性电位水结合艾叶-石榴皮提取物对板栗涂膜保鲜效果的影响

板栗(Castanea mollissima Blume)属壳斗科(Fagaceae)栗属(Castanea)，原产于我国且年产量高居世界首位[1]。果实富含微量元素、多种生物活性物质、人体必需氨基酸和不饱和脂肪酸等营养功能成分，对血压、血糖、动脉硬化和冠心病有很好的预防作用，还具有清除自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳和延缓衰老等功效。由于板栗采摘秋初，温高潮湿，板栗本身含水量多、酶活跃、代谢旺，同时栗苞内寄生象鼻虫虫卵，贮藏期间如保鲜措施不当，易遭微生物浸染、虫害，发生失水、果仁干缩和发芽等现象，造成采后烂果达总产量30%以上[1]，严重制约了板栗产业持续健康发展。因此，突破板栗保鲜技术，最大限度避免板栗采后贮藏的品质劣变和损失，减少资源浪费和环境污染，对促进乡村振兴具有深远意义。

目前采后板栗贮藏在实际生产中大多采用带苞贮藏法、沙藏法、冷藏法和化学杀菌防腐处理法。带苞贮藏法和沙藏法受贮藏环境温度和湿度的变化影响较大，控制不当易导致板栗在贮藏期间发芽、石灰化、失水和霉烂等。板栗难以适应低温环境且栗壳保水性弱，单一冷藏易使板栗发生冻害、失水和干缩等，长时间贮藏难。板栗化学处理常使用苯甲酸钠、水杨酸和山梨酸等，虽有效阻止板栗霉腐和维持板栗的良好品质，但长期使用易导致果实致病菌抗药性大增，药效减弱；过量使用造成板栗药物残留超标，同时对人体造成潜在的毒副作用风险。随着生活水平逐渐提高，迫切需要一种绿色、环保、安全和高效的保鲜技术。

弱酸性电位水 (slightly acidicelectrolyzed water, SAEW)具有强杀菌能力、含低浓度有效氯、安全和无毒副作用等特性，被广泛应用于医疗卫生、食品等领域。已有研究表明SAEW对蓝莓[2]、银耳[3]和杨梅[4]等果蔬表面具有显著的清洗除菌防腐效果，且在贮藏过程中均可抑制微生物生长繁殖。壳聚糖(chitosan，CTS)具有抑菌、抗氧化和无毒等特性，有良好的生物兼容性和成膜性，已应用在西番莲果实[5]、椪柑[6]和桃果实[7]等涂膜贮藏，为降低其生理活性而达到保鲜目标。单独使用CTS涂膜保鲜效果不佳，将CTS与天然生物提取物复配涂膜使用，可拓宽抗菌菌谱，发挥协同作用，增强保鲜能力。石榴皮提取物(pomegranate peel extract，PPE)富含大量的绿原酸、安石榴苷和儿茶素等物质，具有较好的抑菌和抗氧化功效[8]，但对其副产物的再利用研究不足，在保鲜应用方面开发前景巨大。艾蒿(Artemisia argyi)为多年生，大量生长于林下，艾蒿提取物(Artemisia argyi aqueous extract, AAE)含有多种精油、多糖、黄酮和三萜类等生物活性物质，对10余种植物病原菌具有抑菌和抗氧化作用[9]。墙梦捷等[10]研究发现，用艾叶提取物对樱桃涂膜，可降低呼吸作用和抑制其表面微生物繁殖与生长，延长货架期。目前，国内外关于SAEW对板栗贮前预处理技术结合艾叶-石榴皮提取物涂膜的贮藏保鲜研究鲜有报道。本文以板栗为研究对象，采用SAEW对板栗浸泡后晾干，以CTS为基质，结合艾叶-石榴皮提取物对板栗涂膜，探究其对采后板栗的保鲜效果，为板栗产业持续健康发展提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

板栗：金寨早栗子，采摘自安徽金寨斑竹园镇映山红家庭农场，完熟，栗蓬呈黄色，顶开裂成“一、T、十”字形，采摘后3 h内运到实验室，选取单粒质量为6.25～12.5 g、褐红色有光泽、无虫眼、损伤和腐烂的饱满果实，放避光通风处摊薄“发汗” 3～4 d，释放田间热；艾蒿：2018年5月采自安徽霍山太平畈乡仰天窝山林的野生种；A5(1.5 L)方形PP白色塑料保鲜盒及PVC保鲜膜，东莞铭星塑料制品有限公司；抗坏血酸(维生素C)测试盒、过氧化物酶(peroxidase,POD)测定试剂盒，北京索莱宝生物科技有限公司；PPE[CSLP-A-708089，食品级，总多酚含量以没食子酸计为(612.69±11.71) mg/g，实验测得总酚含量为(95.58±7.63) mg/g，总黄酮含量为(193.96±5.32) mg/g]，西安海佳生物科技有限公司；CTS(食品级，分子质量282 kDa、脱乙酰度>90%，黏度800,水溶性>99%),山东奥康科技有限股份公司；乙酸、氢氧化钠、草酸、氯化钡、酚酞指示剂、乙醚、盐酸、甲基红、醋酸铅、硫酸钠、菲林试剂、次甲基蓝、乙酸锌、亚铁氰化钾，三氯乙酸、石英砂、2-硫代巴比妥酸,分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SAEW-4000型微酸性电解水生成器，西安信点科技有限公司；DK-98-1型数显电热恒温水浴锅，北京海天仪表科技有限公司；CTS-04型温湿度自动记录仪，深圳市鸿睿物联发展有限公司；JJ-1型搅拌器，上海坤诚科学仪器公司；BD/BC-150 KEV触屏智控保鲜箱，Midea集团有限公司；DV214C型电子天平，美国OHAUS公司；Alpha-1860Plus型紫外分光光度计，上海谱元仪器科技公司。

1.3 试验方法

1.3.1 板栗SAEW预处理

用自来水将“发汗”处理后的板栗洗净晾干，随机分成5组，用蒸馏水浸泡5 min为对照组(control treatment，CK)、4个处理组(每个处理重复3次)，每组6 kg；将各处理组板栗放入相应大烧杯里, 加SAEW(SAEW-4000型)微酸性电解水生成器制备，氧化电位(1 063±10.21) mV，pH(3.46±0.04)，有效氯质量浓度(55±1.27) mg/L，充分浸泡2、5、8、11 min后取出晾干，测定板栗果实的菌落总数，分析SAEW的杀菌效果，确定板栗果实浸泡时间。

参考王珊珊等[11]方法提取方法略作修改。用粉碎机将干燥艾叶粉碎过40目筛，取1 000 g过筛粉末加90%(体积分数)食用酒精1 000 mL，于80 ℃、60 kHz超声浸提60 min后，用5 000 r/min离心10 min获提取液，滤渣再提取1次，将2次获得提取液混匀并浓缩至500 mL，得到2 g/mL的AAE倒入干热灭菌过的茶色广口瓶中密封，置于0～4 ℃保鲜箱中保藏。

1.3.3 板栗果实处理

先将板栗用SAEW浸泡一定时间后取出沥干，随机分组，每组重复3次，每平行3 kg，各组的板栗样品分别充分浸泡在单一的CTS、PPE和AAE保鲜液与不同配比艾叶-石榴皮复合的保鲜液中5 min后取出晾干；置于对应PP白色塑料保鲜盒中, 用PVC保鲜膜蒙上置于(0±1) ℃，相对湿度为(90±2)%的保鲜箱冷藏，每处理组样品定期随机抽取36粒测定相应值, 重复3次取均值。

1.3.4 保鲜液配制

准确称取(量取)一定量的CTS、PPE和AAE 3种物质，用0.1%(体积分数)的乙酸为溶剂配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/100mL的CTS保鲜液，以无菌蒸馏水为溶剂分别配制成艾叶提取物质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/100mL，PPE质量浓度为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 g/100mL。

1.3.5 不同浓度的单一保鲜液对板栗贮藏失重率和腐烂指数影响

按1.3.3处理方法，以板栗果实保鲜第90天的失重率和腐烂指数为衡量标准，分析不同质量浓度的CTS、PPE提取物和AAE提取物的保鲜液对板栗样品贮期效果，筛选其较佳浓度。

1.3.6 复合保鲜处理的优化

在1.3.1和1.3.5试验的基础上，选取SAEW适当浸泡时间，CTS、PPE和AAE较佳的浓度水平，进行4因素3水平的正交试验，处理和保鲜方法同1.3.3。每30 d测定板栗果实样品的失重率、腐烂指数、呼吸强度和维生素C含量，分析影响板栗贮藏的因子，同时以150 d测定数据作为评定依据，获得复合保鲜液最佳保鲜配方，再进行验证实验，即最优条件与正交试验的9个实验组的贮藏效果比较。

1.3.7 最优配比复合保鲜效果的验证

按1.3.6获得最佳复合保鲜处理，并用1.3.3的方法处理贮藏板栗，以板栗不经任何处理为对照组(CK)、经SAEW处理为SAEW组、经SAEW处理+艾叶-石榴皮提取物为SAEW+复合保鲜剂组，每30 d对板栗果实样品丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和POD活力进行测定，并进行感官品质评价，分析对板栗保鲜的影响。

1.3.8 板栗保鲜指标的测定

菌落总数(colony forming units，CFU)：新鲜板栗经SAEW预处理后，CFU按照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》规定计数。

失重率(loss rate，LR)：按照GB 27401—2008《实验室质量控制规范动物检疫》，每30 d用电子天平分别称各处理组板栗的质量，m0、mt分别表示贮前和贮藏t天处理组板栗的质量。按公式(1)计算：

腐烂指数(decay index，DI)：参照杨雅景等[12]的测定方法略作修改。板栗腐烂级别按板栗腐烂面积大小分为：0级(无腐烂)、1级(≤20%)、2级(20%～50%)、3级(50%～75%)、4级(>75%)。按公式(2)计算：

呼吸强度。参照LYU等[13]采用气相色谱法测定。用CO2生成量表示，单位为mg/(kg·h)。

维生素C含量测定:参照 GB 5009.86—2016《食品安全国家标准食品中抗坏血酸的测定》执行，严格按照维生素C含量测试盒说明书步骤操作，以100 g贮藏板栗样品中所含维生素C的毫克数(mg/100g)表示。

MDA含量:按照LIU等 [14]的方法测定，结果以μmol/g表示。

POD活性测定：采用愈创木酚分光光度法，板栗样品在1 min波长470 nm处吸光度变化0.01时，计1个酶活力单位；单位以U/(g·min)表示。

板栗感官综合评价：筛选10名具有食品感官知识、无生理障碍且有板栗评价经验的师生，参考略改进的兰霜等[15]评价标准(表1)，对板栗的色泽、质地和风味进行综合评价。板栗感官品质的因素集U={U1，U2，U3}={色泽，质地，风味}，权重集X=(a1，a2，a3)=(0.2，0.4,0.4)，感官综合得分Yi=Xi×Ui取均值，Yi<3为板栗丧失商品食用价值。

1.4 数据分析

采用 SPSS 22.0对处理组间、处理组和CK组间的试验数据差异显著性t检验分析(数据均为3次重复试验的均值；差异不显著、显著和极显著分别用P>0.05、P<0.05和P<0.01表示)，Excel 2017进行统计、分析和图像绘制。

2 结果与分析

2.1 SAEW对板栗不同浸泡时间的杀菌的效果

微生物浸染是导致板栗货架期缩短的首要因子。由图1发现，随着SAEW对板栗处理时间的延长，板栗的CFU下降，当浸泡5 min时，SAEW使板栗表面初始的CFU显著减少了3.951 lgCFU/g(P<0.05)；浸泡5 min后板栗表面的菌落总数基本趋于稳定，去除菌量效果并不显著(P>0.05)，可能是板栗浸泡时间过长导致果实角质层的蜡质溶解，破坏板栗表面微形态结构，抵抗微生物能力下降；其次，板栗果实生物活性物质的活性随浸泡时间延长而减弱，导致板栗正常生理功能渐趋紊乱，自身抗逆境和抗菌能力下降，丁甜等[16]利用SAEW对圣女果浸泡除菌得到同样结论。

2.2 不同浓度单一保鲜液对板栗果实贮藏期间LR和DI的影响

板栗果实在(0±1) ℃，相对湿度(90±2)%的贮藏条件下，以90 d的LR和DI为判定标准，分析不同质量浓度的CTS、PPE和AAE等保鲜液对板栗浸泡5 min后的贮藏效果。

板栗采后贮藏期间，生命活动旺盛，极易发生本身底物过度消耗，水分蒸发，果实软化、萎蔫和腐烂等现象，故失重率和腐烂指数是评价果实品质劣变的直观表征。由图2可知，90 d时，冷藏板栗果实的LR和DI均随CTS、PPE和AAE的浓度提高而降低，与CK组显示极显著差异(P<0.01)；CTS抑制板栗果实失水率显著优于PPE和AAE(P<0.05)，可能是CTS在板栗表面形成选择性膜，阻止了果实内部水分散失又可减弱呼吸作用，降低有机物质分解，但抑菌效果较弱，可能是由于CTS成膜后不稳定，结构易龟裂，一旦涂膜破坏，抗氧化效果下降，抑菌能力下降。另外由于CTS的抑菌活性原理是其抗菌成分在H+条件下形成阳离子[18]，造成涂膜后酸性降低，抗菌效果减弱。由图2-A可知，当CTS质量浓度为1.5 g/100mL时，LR和BI分别为7.32%、4.74%，分别与1.0、2.0 g/100mL的CTS质量浓度处理组相比，差异分别为显著(P<0.05)和不显著(P>0.05)，可能是CTS质量浓度提高到一定程度，多余CTS亲水基团显露膜外，增强了亲水性，导致CTS膜结构破坏，低O2和高CO2的微环境破坏。故CTS对板栗果实在(0±1) ℃，相对湿度(90±2)%的条件下，适当质量浓度为1.0 g/100mL。由图2-B可知，AAE质量浓度为1.5 g/100mL时，LR和DI分别为8.36%、4.54%，与低于1.5 g/100mL处理相比LR和和DI显示差异显著(P<0.05)，与高于1.5 g/100mL处理比较，差异不明显(P>0.05)，说明1.5 g/100mL的AAE对板栗果实在(0±1) ℃，相对湿度(90±2)%条件下贮藏效果较佳；由图2-C可知，PPE组在0.3～0.9 g/100mL随浓度提高LR和DI快速下降(P<0.05)，当PPE处理组质量浓度高于0.9 g/100mL时，LR和DI下降幅度缓慢(P>0.05)。说明PPE浸泡板栗果实均有效维持采后板栗的水分流失和减少腐烂，较佳质量浓度为0.9 g/100mL。

2.3 板栗果实复合保鲜液配方的优化

依据2.1和2.2试验结论，按表2板栗保鲜液配方进行L9(34)正交试验，筛选板栗复合保鲜液的适宜配方。

由表3可知，壳聚糖、艾叶提取物、石榴皮提取物和SAEW均影响板栗冷藏期间的LR、DI、呼吸强度和维生素C含量。由极差和平均值发现，壳聚糖是影响板栗贮藏失重率的主要因素，说明一定质量浓度CTS在板栗果实形成选择性膜，有效降低果实贮藏失水率；优水平:A2B1C3D3。PPE是控制板栗贮藏DI的主要因素，其次是SAEW，可能PPE具有强抑菌和抗氧化性，谢贞建等[17]在大豆油贮藏研究中得到同样结果；同时PPE中的多酚类和生物碱类物质可愈合果实表面的伤口防止感染[18]，增强抗感染能力；优组合：A2B3C3D1。呼吸强度受影响最主要因素是CTS，可能是CTS的艾叶-石榴皮提取物复合膜具有选择透过性，板栗内部构建了低O2浓度和高CO2浓度的微环境，降低板栗呼吸作用又抑制酶活性；最佳水平：A2B3C3D3。SAEW是影响维生素C含量主要因素，可能是由于SAEW杀死了板栗表面的病原腐败菌，增强板栗果肉还原酶活性，清除氧化物质，导致维生素C氧化减少；适宜组合：A2B2C3D1。综合判断发现，板栗果实在(0±1) ℃，相对湿度(90±2)%的条件下，SAEW结合艾叶-石榴皮提取物对板栗涂膜最优组合：A2B2C3D1，即壳聚糖质量浓度1.0 g/100mL、艾叶提取物1.5 g/100mL、石榴皮1.2 g/100mL、SAEW浸泡4 min。为检验L9(34) 该组合的可靠性，用该配方对板栗3份样品进行验证贮藏保鲜试验，第150天测定LR、DI、呼吸强度和维生素C含量分别6.24%、4.69%、23.97 CO2 mg/(kg·h)和22.03 mg/100g，此值优于表2中任一处理组(P<0.05)。证实A2B2C3D1组合对板栗果实涂膜具有良好抑制板栗失重、降低腐烂指数、减弱呼吸强度和减少维生素C损失的作用。

2.4 不同处理对板栗MDA含量、POD活力及感官品质的比较

为了进一步探究弱酸性电位水结合艾叶-石榴皮提取物保鲜液对板栗涂膜的冷藏效果，在(0±1) ℃，相对湿度(90±2)%的环境下，选择上述优化组合与CK组和SAEW组对照，测定MDA含量、POD活力及感官品质对板栗保鲜的影响，结果见图3。

MDA为果实内活性氧生成的膜脂过氧化产物，是表征膜系统受损伤大小的量化指数。由图3-A可知，3组板栗果实MDA含量曲线为上升趋势。0～30 d，3组MDA含量呈缓慢上升阶段(P>0.05)；30 d后，3组MDA含量上升速度开始分化，CK组MDA含量第90 天达到2.72 μmol/g，SAEW组和SAEW+复合保鲜剂两处理组含量分别比CK组下调了40.01%、33.23%，CK组与两处理组差异显著(P<0.05)，而两处理组间差异不显著(P>0.05)；两处理组的MDA含量第120天达3.31、2.09 μmol/g，可能是休眠打破，板栗进入后熟衰老期，呼吸旺盛造成板栗过多自由基聚集，大量物质被过氧化，DNA、RNA和蛋白质等物质发生交联，果实的胶体结构和生物膜系统受到损伤，正常生理功能受到影响，但SAEW结合艾叶-石榴皮提取物组在保鲜过程始终处于最低的水平。由于SAEW结合艾叶-石榴皮提取物有效降低MDA的积累且减轻对板栗原生质和细胞膜的损伤，推迟板栗衰老。余易琳等[19]通过壳聚糖/纳米纤维素复合保鲜液对红桔涂膜保鲜研究，获得同样结论。POD为植物体细胞内的抗氧化酶，具有去除果体内

和H+等毒性物质，防止膜脂遭受伤害的功能。由图3-B可知，板栗在整个冷藏过程中，POD活性整体为先升后降态势。在0～60 d, CK组POD活性呈快速上升趋势, SAEW组和SAEW+复合保鲜剂组的板栗POD活性缓慢增强；60～90 d，POD活性相对稳定；SAEW+复合保鲜剂组峰值出现最晚，比CK组和SAEW组推迟30 d；SAEW处理组和SAEW+复合保鲜剂处理组的POD始终低于CK组，SAEW+复合保鲜剂组与CK组间呈极显著差异 (P<0.01)。由于板栗贮藏初期生理活动较旺，生成了过多的自由基积聚在机体内，在底物的诱导下提高了POD活性；CK组板栗贮前未经除菌处理，同时贮中又感染了一些病原腐败菌, 导致果内生成过多H2O2，板栗果实防御系统为保护自身而增强POD活性，而SAEW和SAEW+复合保鲜剂对板栗处理减弱了板栗新陈代谢，有效控制H2O2生成，导致POD活性降低。郑炯等[20]应用复合茶多酚和纳他霉素保鲜剂对麻竹笋涂膜贮藏试验也得同样结论。所以, SAEW结合艾叶-石榴皮提取物可有效控制POD活性, 促使板栗老化延迟。CK组感官评分随贮藏时间延长呈下降趋势，与两处理组差异极显著(P<0.01)。60 d内，3组感官得分在5分以上，表明板栗果实的栗壳和果仁无质的变化，只是水分失去部分，甜度增加；60～90 d，CK处理组感官品质迅速下降，果壳一半有黄色斑纹，果仁略有异味，感官得分2.71分，失去商品性；180 d, SAEW处理组和SAEW+复合保鲜剂处理组感官得分分别为4.12和6.53分，仍在商品价值范围内，但SAEW+复合保鲜剂处理组感官特征明显优于SAEW处理组。说明SAEW和复合保鲜剂具有协调效应，维持了板栗较低生理活性，控制了感官品质下降。该研究与葛枝等[21]采用SAEW处理草莓的结论相一致。

3 讨论与结论

本试验得出SAEW能有效地杀灭板栗表面微生物，浸泡5 min使CFU稳定在0.809 lgCFU/g的水平。SAEW浸泡时间过长可能溶解果实表面的蜡层[16]，破坏果实胶体结构和生物酶的活性，抑菌和抗氧化能力减弱；板栗果实通过SAEW浸泡除菌后结合复合生物保鲜液涂膜，显著提高其贮藏性能。

研究发现壳聚糖、艾叶提取物和石榴皮提取物在冷藏中均可有效减缓板栗果实的DI上升和LR下降，但DI和LR的变化与浓度变化不成正相关，因为板栗品质变化受其贮藏微环境、微生物感染程度和生理活性强弱等综合因素影响。

本试验在(0±1) ℃，相对湿度(90±2)%环境下进行，板栗先经过SAEW浸泡，再进行单因素试验、L9(34)正交试验和最优配比保鲜涂膜液贮藏效果验证试验。筛选获得板栗果实SAEW浸泡处理下结合复合生物保鲜液涂膜的最优配方为壳聚糖1.0 g/100mL、艾叶提取物1.5 g/100mL、石榴皮1.2 g/100mL、SAEW浸泡4 min。该涂膜保鲜液可有效降低果实失重率、抑制腐烂、显著减弱呼吸强度、有效降低板栗贮藏期间维生素C损失和MDA积累，稳定POD活性，推迟POD活性峰值30 d，货架期达180 d以上，有效延缓板栗衰老并维持较好感官品质。

本试验发现板栗在SAEW浸泡后，以CTS为基质，结合艾叶-石榴皮提取物对其涂膜冷藏中，形成板栗贮藏的低O2高CO2的微环境，降低板栗生理活性和改善感官品质。因此，将SAEW处理和生物提取物冷藏结合贮藏板栗的技术进行推广，从而减少板栗的损失，带动板栗产业链持续健康发展。

目前对于SAEW浸泡后结合天然生物保鲜剂对板栗衰老和抗菌机理的研究深度尚不够，后续将进一步探讨，将其与气调、微冻和辐射等保鲜技术结合，以期为板栗采后贮藏提供高效、绿色和安全新途径。

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