奶疙瘩是新疆哈萨克族的传统乳品，由牛奶或羊(马)奶自然发酵后去水干燥而成，按制作工艺分可分为酸凝和酶凝两种，其气味独特、工艺简单且富含多种营养[1-2]。我国传统奶酪乳酸菌种类多样，已分离出植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)等具有良好益生特性和风味特征的菌株[3-7]。ZHENG等[8]对新疆哈萨克族传统奶酪研究，发现乳杆菌属(Lactobacillus)与乙醇、丁酸、乙酸和丙氨酸相关；链球菌属(Streptococcus)主要为乙偶姻、乳酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯的贡献菌属。GUARRASI等[9]对2种发酵型乳酸菌和9种非发酵乳酸菌产风味化合物研究发现，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)和 2-丁醇、丁酸、己酸及其相应的酯类物质有关；干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌主要产2,3-丁二酮、2-羟基-丁酮。除乳酸菌之外，乳制品中其他细菌如丙酸杆菌、肠杆菌、无氧芽胞杆菌属和酵母菌等也有助于风味和色泽的形成。目前，对于新疆不同原料奶疙瘩细菌多样性与气味特征的探究鲜有报道。
近年来，以Miseq为代表的第二代高通量测序技术具有通量高、取样量少和操作简单等优点，可对样品中不同微生物种群组成进行快速分析。固相微萃取-气相色谱-质谱(solid-phase microextraction-GC-MS，SPME-GC-MS)联用技术通常用来检测不同样品中挥发性物质，目前高通量测序结合SPME-GC-MS已广泛应用于奶酪[10-11]、发酵肉制品[12]、酒醅[13]、腌制品[14]等微生物群落多样性和挥发性物质的研究。本研究对新疆地区牛奶疙瘩、酸奶疙瘩和羊奶疙瘩样品，采用Miseq高通量测序技术分析其细菌群落，同时结合SPME-GC-MS分析不同奶疙瘩的挥发性物质差异，以期为后续挖掘奶疙瘩的优良菌种资源和提升奶疙瘩风味提供一定的依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
奶疙瘩样品于2019年3月和6月采集自新疆地区。每种奶疙瘩各采集10份，编号为牛奶疙瘩(NNL_1)、牛奶疙瘩(NNL_2)、羊奶疙瘩(YNL)和酸奶疙瘩(SNGD)。样品见图1。
主要试剂有TaqDNA polymerase、dNTPs、DL2000TM DNA Marker，大连宝生物有限公司；蛋白酶K，Merck集团；溶菌酶，Sigma集团。
1.2 仪器与设备
Illumina Miseq高通量测序平台，美国Illumina公司；R930机架式服务器，美国DELL公司；电子秤，永康市艾瑞贸易有限公司；7890-5977A气相色谱质谱联用仪，美国 Agilent 公司；探头PT100，东阳市三星温度仪表有限公司；手动SPME进样器、萃取纤维头50/30 μm，DVB/CAR/PDMS，美国Supelco公司；DF101S集热式恒温加热磁力搅拌，巩义予华仪器有限责任公司；DEN-400拍打式均质机，北京德世科技有限公司。
A-牛奶疙瘩(NNL_1);B-牛奶疙瘩(NNL_2); C-羊奶疙瘩(YNL);D-酸奶疙瘩(SNGD)
图1 新疆奶疙瘩样品
Fig.1 Samples of Xinjiang cheese
1.3 实验方法
1.3.1 细菌群落的高通量测序分析
参考尚雪娇等[15]的方法并做调整。每种样品分别取10份混匀后，使用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit试剂盒提取样品细菌DNA。共计4个DNA样本送至上海美吉生物医药科技有限公司，采用338F-806R引物扩增16S rDNA V3～V4区进行高通量测序分析。采用QIIME软件平台调用UPARSE进行两步对序列用于操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)进行分析，确定细菌OTU代表性序列的微生物分类水平并统计每个样本的群落组成、结构和组间差异的统计学和可视化分析。
1.3.2 奶疙瘩的SPME-GC-MS检测
样品的前处理：参考郑晓吉等[16]的方法并做调整。每种样品分别取10份混匀后，称取3种样品各25 g加入无菌均质袋(20 cm×27 cm)中，加入无菌生理盐水225 mL，均质3 min。称取样液15 g放于样品瓶中(27.5 mm×95 mm)，加盖密封60 ℃水浴平衡10 min，吸附提取50 min。结束后将SPME纤维插入GC进样口解吸5 min，检测挥发性组分。
GC-MS条件：起始温度30 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至120 ℃，以15 ℃/min升至250 ℃，保持3 min。进样口温度为250 ℃。离子源温度230 ℃，质谱扫描范围为50～350 m/z。
实验数据经计算机检索与NIST11库对照进行组分鉴定，对匹配度>800的物质予以分析。采用峰面积归一法确定挥发性组分的相对含量。
1.4 数据分析
采用上海美吉生物云平台、IBM SPSS Statistics 20软件对数据进行处理和Pearson相关性分析，采用Origin 6.0软件制图和Cytoscape软件进行网络可视化制图。
相对气味活度值(relative odor activity value,ROAV)的计算[17]：通常选阈值较低，但百分含量较高的化合物组分，首先定义对样品贡献最大的组分为ROAVmax=100，其他香气组分则按公式(1)计算：
(1)
式中：Ci和Ti分别为各挥发性物质的相对含量(%)和相对应的感觉阈值(μg/L)；Cmax和Tmax分别为对样品总体气味贡献最大组分的相对含量(%)和相对应的感觉阈值(μg/L)。所有组分ROAV≤100，而且ROAV越大的组分对样品总体气味的贡献也就越大。所有物质的计算结果需要满足0≤ROAV≤100，一般把ROAV≥1的化合物作为主要的贡献组分，0.1≤ROAV<1的组分对所测样品的总体气味具有重要修饰作用。
2 结果与分析
2.1 新疆奶疙瘩的细菌多样性分析
2.1.1 α多样性指数分析
本研究共采集了4种新疆奶疙瘩样品，对其进行高通量测序，根据微生物多样性分析结果，选取菌群差异较大的3个样品进行挥发性物质分析。
对不同样品在97%一致性阈值下的α多样性指数进行统计，结果见表1。所有样品的Coverage指数均>0.99，说明测序结果可信。SNGD的Shannon指数和Chao1指数均最高，其物种丰富度和群落多样性水平相对较高。
2.1.2 属水平群落结构分析
由图2可知，在属水平上NNL_1的主要群落组成为：Lactobacillus(16.03%)，Streptococcus(15.25%)，Lactococcus(乳球菌属，6.14%)，Kurthia(库特氏菌属，9.80%)，Enterococcus(肠球菌属，7.55%)，Leuconostoc(明串珠菌属，6.99%)，norank_f__Muribaculaceae(6.97%)和Klebsiella(克雷伯氏菌属，3.86%)。NNL_2主要群落组成为：Streptococcus(52.55%)，Lactococcus(13.30%)，Anoxybacillus(厌氧芽孢杆菌属，17.12%)，Thermus(栖热菌属，6.19%)。YNL的主要群落组成为：Streptococcus(58.20%)，Lactobacillus(13.97%)，Lactococcus(18.05%)。SNGD主要群落组成为：Acetobacter(醋酸杆菌属，22.78%)，Lactobacillus(9.95%)，norank_f__Muribaculaceae(9.1%)，Rhodococcus(红球菌属)和Acinetobacter(不动杆菌属)占比在4%～5%，Bacteroides(拟杆菌属)、Brevundimonas(短波单胞菌属)、Gluconobacter(葡糖杆菌属)和Arthrobacter(节杆菌属)占比都在2%～3%。
表1 新疆奶疙瘩中细菌α多样性
Table 1 α Diversity indexes of bacterial communities in Xinjiang cheeses
样品编号有效序列数OTU数Shannon指数Chao1指数Simpson指数Coverage指数NNL_142 6437383.90 747.08 0.06 0.99NNL_235 0082792.29 386.02 0.17 0.99SNGD47 5269524.64 954.47 0.06 0.99YNL36 8402661.57 359.40 0.38 0.99
图2 新疆奶疙瘩中属水平分布柱状图
Fig.2 Relative abundances of bacterial communities at the genus level in Xinjiang cheeses
2.2 新疆奶疙瘩样品挥发性物质分析
新疆奶疙瘩中主要挥发性物质包括酯类、醇类、酮类、醛类、酸类和其他类共8大类，总计68种。结果见表2。癸酸乙酯为3种奶疙瘩样品共有组分(ROAVmax=100)。癸醛为3种不同原料奶疙瘩中共有的关键挥发性物质(ROAV>1)。丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和2-十一酮对牛奶疙瘩(NNL_1)香气起重要修饰作用(0.1≤ROAV<1)；丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯为羊奶疙瘩(YNL)中关键挥发性物质(ROAV>1)；辛酸乙酯、庚醛、壬醛、3-甲基丁醛和1-辛烯-3-醇对羊奶疙瘩气味起重要修饰作用(0.1≤ROAV<1)；丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、十二酸乙酯、壬醛、1-辛烯-3-醇和3-甲基丁醇对酸奶疙瘩(SNGD)香气起重要修饰作用(0.1≤ROAV<1)。
奶疙瘩中酯类化合物主要有乙酸乙酯、乙酸己酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯等，与李露等[18]对新疆奶疙瘩挥发性研究结果较一致。这类C2～C8酯类化合物大多挥发性较强，阈值较低，能够赋予奶酪甜味、水果味及花香味，而且能够很好地掩盖奶酪中脂肪酸和胺类物质所产生不愉快的气味。3种共有醛类化合物为庚醛、壬醛、癸醛。庚醛赋予奶疙瘩水果味；癸醛赋予奶疙瘩油脂味和青草味；壬醛赋予奶疙瘩脂肪味。醛类化合物的形成途径通过脂肪酸代谢、氨基酸转氨基作用或Strecker降解，易被还原成相应的醇，因此在奶酪中含量较少。
醇类化合物的形成主要通过甲基酮和醛类还原、乳糖代谢、氨基酸代谢以及脂肪酸的降解。3-甲基丁醇是由奶酪成熟过程中蛋白质分解形成的亮氨酸通过Strecker降解，经转氨、脱羧、还原形成具有花香味和酒香味。苯乙醇是由苯丙氨酸经酵母菌代谢形成具有玫瑰花香味，仅在SNGD样品中被检出，可能与奶疙瘩发酵制作时酵母菌的作用有关。
2.3 微生物与挥发性物质的关系分析
通过计算丰度前7的优势菌属和ROAV≥0.01的挥发性物质相对含量之间的Pearson相关系数，选取相关性显著(P<0.05)的部分，构建了7个菌属与11种挥发性物质的相关网络图，如图3所示。Streptococcus、Lactobacillus和Lactococcus在牛奶疙瘩和羊奶疙瘩中占比较高，与癸酸乙酯、己酸乙酯和2-十一酮呈正相关。Acetobacter在酸奶疙瘩中占比最高，与壬醛、癸醛和1-辛烯-3-醇呈正相关，与2-十一酮、癸酸乙酯、己酸乙酯呈负相关，是造成酸奶疙瘩的风味与其他奶疙瘩的风味差异明显的原因。Streptococcus和Lactococcus与3-甲基丁醛呈正相关。Kurthia、Enterococcus、Leuconostoc等非发酵型细菌与辛酸乙酯、癸酸乙酯、庚醛、癸酸和2-十一酮正相关，参与了奶酪成熟过程中风味的形成。
表2 三种新疆奶疙瘩中挥发性物质
Table 2 Volatile compounds in three Xinjiang cheeses
序号中文名称气味描述[19-21]阈值[22-25]/(μg·L-1)NNL_1YNLSNGD相对含量/%ROAV相对含量/%ROAV相对含量/%ROAV1甲酸甲酯花香味5 000————1.75 <0.01 2乙酸乙酯橙子味50.51 0.02 0.34 0.06 1.25 0.07 3丁酸乙酯苹果味0.91.19 0.22 27.98 29.33 0.76 0.25 4己酸乙酯水果味,酒香味2.23.77 0.28 13.36 5.73 1.24 0.16 5辛酸乙酯脂香味,酒香味19.312.04 0.10 4.62 0.23 7.34 0.11 6癸酸乙酯椰子香味0.0212.24 100.00 2.12 100.00 6.84 100.00 7乙酸己酯甜香味,清香味2——5.92 2.79 ——8月桂酸乙酯花香味,果香味3.50.77 0.04 0.27 0.07 1.26 0.11 9十四烷酸乙酯0.28 ———0.19 —10十六烷酸乙酯奶油味,脂香味1.50.11 0.01 ——0.09 0.02 113-甲基丁酸乙酯——2.68 ———12丁烷硫酸-S-甲酯——9.94 ———13乙酸-2-苯乙基酯1.09 ———2.76 —14反式-4-癸烯酸乙酯————1.78 —153-甲基-1-丁醇乙酸酯0.37 —————16邻苯二甲酸丁基壬基酯0.17 ———0.40 —171-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己醇乙酸酯3.39 ———0.66 —18己醛青草味5————1.47 0.09 19庚醛水果味31.30 0.07 0.67 0.21 0.87 0.08 20壬醛脂肪味,微辛辣味81.42 0.03 3.03 0.36 3.61 0.13 21癸醛青草味0.14.07 6.65 0.71 6.70 2.87 8.39 222-庚醛——0.81 ———23苯甲醛苦杏仁味350——1.59 <0.01 1.23 <0.01 243-甲基丁醛恶臭味,辛辣味,坚果味1.10.07 0.01 0.35 0.30 ——252-戊酮2 1500.07 <0.01 ——0.21 <0.01 262-庚酮奶油味,青草味1402.57 <0.01 ——3.38 <0.01 272-壬酮热牛奶味,果香味20013.53 0.01 0.74 <0.01 4.13 0.01 282-十一酮奶香味,水果味5.53.95 0.12 ——1.32 0.07 292-十三酮椰子香味,坚果味5001.01 <0.01 ——1.43 <0.01 302-十五酮0.33 — ————318-壬烯-2-酮2.90 —————326-戊基-2H-四氢吡喃-2-酮300——3.03 0.01 0.08 <0.01 336-庚基-2H-四氢吡喃-2-酮0.17 —0.27 ———34正己醇2503.47 <0.01 ——0.81 <0.01 35庚醇410.63 <0.01 ——1.07 0.01 362-壬醇奶油味281.65 0.01 ——1.05 0.01 37苯甲醇——1.35 ———38苯乙醇花香味28.9————6.12 0.06 392-呋喃甲醇0.82 — ————401-辛烯-3-醇蘑菇味2.5——0.47 0.18 0.86 0.10 412-十六烷醇————0.25 —422-甲基-1-丁醇15.9————1.33 0.02 433-甲基丁醇酒香味,花香味4————1.57 0.11 442-乙基己醇75.2————1.11 <0.01 452-甲基-1-十六烷醇————0.31 —463,7,11-三甲基-1-十二烷醇————0.05 —47α,α-4-三甲基-3-环己烯-1-甲醇5.09 —————48己酸甜香味,刺激味4201.55 <0.01 ——4.89 <0.01 49辛酸奶香味5001.66 <0.01 ——5.32 <0.01 50壬酸4 6000.80 <0.01 ——1.24 <0.01 51正癸酸酸腐味,奶香味1302.56 <0.01 2.18 0.02 6.53 0.0152十二酸5.04 ———0.58 —53十四酸4.00 — ——0.09 — 54(Z)-9-十八烯酸0.48 —————55正十六酸3.65 —————56癸烷————1.49 —57十三烷0.27 —0.87 —0.84 —58十四烷——0.56 —1.76 —59十五烷————0.57 —60十六烷————0.55 —61十八烷————0.58 —
续表2
序号中文名称气味描述[19-21]阈值[22-25]/(μg·L-1)NNL_1YNLSNGD相对含量/%ROAV相对含量/%ROAV相对含量/%ROAV62苯乙烯—— — —0.46 —631,3,5-环戊二烯——0.54 ———64对二甲苯坚果味4 900——0.33 <0.01 0.16 <0.01 65丁基羟基甲苯杏仁味,苦涩味0.17 —10.70 —1.83 —661,2,4-三甲基苯——2.08 —1.47 —67甲基4,6-癸二烯基醚————0.21 —683-叔丁基-4-羟基苯甲醚——1.19 ———
注：—表示未检出
图3 新疆奶疙瘩中优势细菌属与挥发性物质相关性分析
Fig.3 Correlation network analysis between dominant bacterial communities and key volatile compounds in Xinjiang cheeses
注：绿色和黄色节点分布代表微生物和风味物质；节点间连线 的颜色深浅表示两者Pearson相关系数的大小，红色线表示正相关， 蓝色表示负相关
3 结论
本研究应用Illumina Miseq高通量测序平台对4个奶疙瘩样品中的细菌多样性进行测序，4个奶疙瘩样品中牛奶疙瘩和羊奶疙瘩中主要优势菌属为乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属，酸奶疙瘩中主要优势菌属为醋酸杆菌属和乳杆菌属。利用SPME-GC-MS联用技术鉴定出奶疙瘩的挥发性物质共有酯类、醇类、酮类等化合物68种。牛奶疙瘩中以酯类和酮类化合物为主，具有酒香味、果香味和青草味；羊奶疙瘩中以酯类和芳香及杂环类化合物为主，具有酒香味、果香味、甜香味和青草味；酸奶疙瘩中以酯类化合物为主，具有酒香味、果香味、青草味和奶香味。乳杆菌属、链球菌属和醋酸杆菌属等可能影响奶疙瘩中酯类、酸类和醛类化合物含量，从而影响奶疙瘩的整体气味。本研究为深入了解奶疙瘩中优势细菌种群结构，发掘传统奶疙瘩中的优良乳酸菌资源、开发奶疙瘩发酵剂提供参考。
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