随着有害食品微生物对化学合成抑菌剂抗药性的不断增强，使得研发绿色环保的新型替代性抗菌物质成为了食品研究领域的热点问题之一。精油存在于植物的根、茎、叶、树皮、花和果实中[1]。精油最初的用途仅在制备香熏，化妆品等方面，但近年许多研究发现精油具有良好的抗菌活性，如丁香精油[2]、牛至精油[3]、百里香精油[4]等。由于精油具有的一些理化特性优势，使它能够很好的与熏蒸处理结合，让处理方式变得更加简单有效，而且能够有效的解决合成抑菌剂在使用过程中引发的危害人体健康、污染环境和微生物抗药性等问题。
柏科类植物资源丰富，组织富含精油，其精油在工业中多被用作调香原料，还可以应用于多个领域[5]。祁连圆柏(Sabina przewalskii Kom.)为柏科(Cupress aceae)圆柏属(Sabina)高大常绿针叶乔木，是我国特有的绿化树种[6]。该树种生长于海拔2 600～4 300 m的阳坡、半阳坡，生态适应幅度宽，抗逆性强，极耐高寒、干旱和土壤贫瘠，主要分布在青藏高原东北部和黄土高原的西部边缘地带[7-8]。许多在比较极端苛刻环境下生长的生物反而能够为人类提供具有重要应用价值的代谢物质。周宝石[9]从祁连圆柏成熟果实的甲醇提取物中分离得到二萜类化合物，结果表明祁连圆柏果实可以作为二萜类化合物的天然资源宝库。王文蜀等[10]从祁连圆柏的种子中分离出结构为3α-hinokiol的二萜且该物质对人卵巢癌细胞(HO-8910)具有一定抑制作用。刘喜梅等[6]和刘林芳[7]研究发现海拔高度的变化对祁连圆柏叶挥发油成分及其质量分数有一定规律性的影响。但有关祁连圆柏精油抑菌(细菌和真菌)活性的研究鲜见报道。
本文采用水蒸馏法提取祁连圆柏精油，并用GC-MS分析了祁连圆柏精油的主要化学成分；对该精油对多种食品腐败真菌和细菌的抑菌活性进行研究评价，旨在为柏科类植物天然抑菌剂的开发提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
祁连圆柏(野生)，采自甘肃省天祝藏族自治县祁连山区；4种采后果蔬腐败真菌[互隔交链孢(Alternaria alternate) 、扩展青霉(Penicillium expansum) 、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum) 、粉红单端孢(Trichosporon roseum)]、2种革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)〗和2种革兰氏阴性菌[粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)]均由甘肃农业大学食品科学与工程学院微生物实验室提供。
1.2 仪器与设备
CN69M/FW80高效植物样品粉碎机，北京中西远大科技有限公司；BS200S型电子天平，北京赛多利斯天平有限公司；7890B GC-MS联用仪，美国安捷伦科技有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；DHP-9272B型恒温培养箱，上海一恒科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品前处理
将祁连圆柏枝叶去除较粗枝干，然后将枝叶剪为约0.5 cm的短枝，烘干(40 ℃、5 h)备用。
1.3.2 祁连圆柏精油的提取
取干燥后的祁连圆柏枝叶400 g，采用水蒸馏法提取精油。物料比为6∶1(g∶g)，蒸馏4 h，停止加热，油水分离后油相用无水硫酸钠脱水干燥，收集精油于棕色瓶内4 ℃保存待用。计算精油提取得率，计算公式(1)如下：
精油得率
(1)
1.3.3 精油成分分析
采用GC-MS计算机联机分析得到检出成分，经计算机检索谱库，人工分析质谱图，结合相关文献资料对检出成分进行筛选鉴定，通过峰面积归一法确定各组分的相对含量。
(1)样品处理：液体直接进样，进样量2.0 μL。
(2)气相色谱条件：色谱柱DB-17MS (30 m×250 mm，0.25 μm)，柱温：50～250 ℃程序升温。初始温度为50 ℃，保持1 min，以4 ℃/min升至220 ℃，保持8 min，再以20 ℃/min升至250 ℃，保持2 min。进样口温度为250 ℃，氦气载气，柱流量为1.0 mL/min，以分流方式进样，分流比为250 ∶1。
(3)质谱条件：采用EI电离方式，电离能量70 eV，离子源温度250 ℃，接口温度230 ℃，分子质量扫描范围15～500 u。
按照本条件进行正构烷烃混合对照品C8～C20的GC-MS分析，以正构烷烃的保留时间计算祁连圆柏精油中各组分的保留指数(kovats index,KI)。计算公式(2)如下：
(2)
式中：tx，被分析组分流出峰的保留时间，min；tn，碳原子数为n的正构烷烃流出峰的保留时间，min；tn+1，碳原子数为n+1的正构烷烃流出峰的保留时间，min；且tn<tx<tn+1。
1.3.4 精油抑菌活性的评价
1.3.4.1 培养基的制备
PDA培养基:马铃薯块茎200 g，1 000 mL蒸馏水，煮沸30 min，4层纱布过滤，滤液加葡萄糖20 g、琼脂18～20 g，补充蒸馏水至1 000 mL，装入三角瓶灭菌备用。
液体培养基:牛肉膏0.9 g、蛋白胨3.0 g、NaCl 1.5 g、蒸馏水300 mL、pH 7.4～7.6，灭菌备用。
1.3.4.2 菌悬液的制备
真菌：分别将4种真菌在PDA中培养7 d后，在培养皿中加入无菌水约15 mL，用玻璃涂布棒刮取孢子，4层纱布过滤于50 mL的三角瓶中，充分振荡，用血球计数器计数，调至浓度为1×106 ～3×106 CFU/mL备用。
细菌：将活化后的细菌接种于液体培养基，在摇床37 ℃恒温培养24 h，备用。
1.3.5 祁连圆柏精油对真菌的抑菌效果
1.3.5.1 祁连圆柏精油对真菌菌落生长的影响
参考HABA等[11]的方法并略做修改。在无菌条件下，将1.3.4.2中制备的菌悬液接种在对应的固体培养基上，培养皿盖中心放入灭菌后的滤纸片(直径为6 mm)，滤纸片上滴加6、12、24、48 μL的精油，使其在培养皿内空间浓度分别为0.125、0.25、0.5、1 μL/mL，以无菌水做空白对照，密封倒置，28 ℃培养箱内恒温孵育7 d，以十字交叉法测定菌落直径，取其平均值，试验重复3次。
按照浓度梯度测定最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)和最低杀菌浓度(minimum fungicidal concentration, MFC)。以48 h内抑制率为100%精油浓度为其MIC；连续培养72 h，若仍没有菌生长，则为MFC。
1.3.5.2 祁连圆柏精油对真菌孢子萌发的影响
采用纸片扩散法测定孢子萌发率。在无菌条件下，用打孔器制取直径为9 mm、质量分数为2%的琼脂培养基，置于灭菌载玻片上，滴加孢子悬浮液20 μL，再用灭菌镊子夹取无菌滤纸片置于培养皿盖中央，在滤纸片上分别滴加6、12、24、48 μL的精油，以无菌水作对照，于27 ℃孵育后镜检观察孢子萌发情况，当对照组孢子萌发率达到80%时开始计时。每次镜检100个真菌孢子，每次实验重复3次。孢子萌发抑制率计算如公式(3)所示：
孢子萌发抑制率/%
(3)
1.3.5.3 祁连圆柏精油对真菌生物量的影响
在无菌条件下，将1×106 CFU/mL菌悬液接种在铺有玻璃纸的培养基上，在培养皿盖中心放入灭菌后的滤纸片，分别在滤纸片上滴加6、12、24、48 μL精油，使其在培养皿内空间浓度分别为0.125、0.25、0.5、1 μL/mL，以无菌水做空白对照，密封倒置，在28 ℃ 培养箱内恒温孵育7 d后取下玻璃纸，称重，实验重复3次。
1.3.6 祁连圆柏精油对细菌的抑菌效果
采用滤纸片法测定不同浓度精油对4种细菌的抑菌圈直径。用移液枪吸取150 μL(106～107CFU/mL)菌液，均匀涂布于培养基表面。将已灭菌的圆形滤纸片呈四边形形状铺在培养基表面，每个培养皿中放4个滤纸片，再分别移取3、6、9、12 μL的精油滴在滤纸片上，每个培养皿只滴加同一个浓度的精油。将培养皿置于37 ℃的生化恒温培养箱中培养24 h，十字交叉法测量抑菌圈的直径，无菌水为对照，试验平行3次，记录数据，结果取重复实验的平均值来评价抑菌效果。
用微量稀释法测定精油对4种细菌的MIC和最低杀细菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)值[12]。将供试菌菌悬液与精油溶液置于96孔板孔内,使其精油浓度分别为150～0.29 μL/mL，置于37 ℃培养24 h后观察。顺浓度梯度由大到小，第1个透明孔所对应的浓度值为MIC。将浓度为MIC和2 MIC孔继续培养24 h后观察，透明孔所对应的浓度值为MBC。无菌水为对照，所有实验重复3次。
1.4 数据分析
本试验数据采用Microsoft Excel 2013计算平均值和标准误差(±SE)；采用SPSS Statistics 25.0 软件进行Duncan′s显著性分析(P<0.05)；使用Origin 2017软件进行绘图。
2 结果与分析
2.1 精油提取得率
用水蒸馏法对祁连圆柏进行精油提取，得到的精油为淡黄色的油状液体，精油得率为2.83%。
2.2 精油的化学成分
从祁连圆柏精油中总共鉴别出47种化学成分(表1)，其中从已鉴定出的挥发精油化学成分类型看，主要成分为单萜烯类、倍半萜烯及其含氧衍生物，其他为少量的酯。其中相对含量较多的组分为桧烯(19.59%)、α-杜松醇(11.81%)、(-)-4-萜品醇(10.90%)、γ-松油烯(5.55%)、香茅醇(5.06%)、月桂烯(3.70%)和D-柠檬烯(3.34%)，占总成分的63.535%。此外，还有少量的酯类化合物，祁连圆柏精油可能是通过多种化学成分协同发挥作用从而产生抗菌效果。
表1 祁连圆柏精油挥发性成分
Table 1 Volatile components of Sabina przewalskii Kom.essential oil
保留时间/min名称分子式KI相对含量/%6.8桧烯4-methylene-1-(1-methylethyl)-C10H1697819.59±0.0128.236α-杜松醇α-cadinolC15H26O4 06511.81±0.0213.412(-)-4-萜品醇4-methyl-1-(1-methylethyl)-C10H18O1 18510.90±0.029.393γ-松油烯γ-terpineneC10H161 0595.55±0.0125.923(2E,4S,7E)-4-异丙基-1,7-二甲基环-2,7-二醇C15H26O1 5776.55±0.01(2E,4S,7E)-4-isopropyl-1,7-dimethylcyclodeca-2,7-dienol15.222香茅醇 citronellolC10H20O1 2415.06±0.018.804萜品油烯1-methyl-4-(1-methylethylidene)-C10H161 0163.58±0.017.327月桂烯β-myrceneC10H169943.70±0.018.411D-柠檬烯D-limoneneC10H161 0273.34±0.0115.333(R)-(+)-β-香茅醇(3R)-3,7-dimethyloct-6-en-1-olC10H20O1 2442.43±0.017.556(+)-4-蒈烯 (+)-4-careneC10H161 0011.92±0.0125.3061,5-环丙氨酸,1,5-cyclodecadieneC15H241 5561.75±0.0125.141[1R-][1],3],4]-4-乙基-α,α,4-三甲基-3-[1-甲基苯甲酸酯甲醇]C15H26O1 5500.10±0.01cyclohexanemethanol, 4-ethenyl-α,α,4-trimethyl-3-(1-methylethenyl)
续表1
保留时间/min名称分子式KI相对含量/%8.274邻异丙基甲苯 o-cymeneC10H141 0231.06±0.019.048β-罗勒烯β-ocimeneC10H161 0470.91±0.0111.3523-甲基-3-丁基酯 butanoic acid, 3-methyl-, 3-methyl-3-butenyl esterC10H18O21 1220.88±0.0113.775α-松油醇α-terpineolC10H18O1 1960.75±0.0123.057大根香叶烯 D-germacrene C15H241 4781.17±0.0110.749芳樟醇 linaloolC10H18O1 1010.81±0.0115.992乙酸芳樟酯 linalyl acetateC12H20O22 5660.77±0.0111.632顺式-1-甲基-4-异丙基-2-环己烯-1 醇C10H18O1 1410.78±0.012-cyclohexen-1-ol, 1-methyl-4-(1-methylethyl)-, cis-27.446沉香螺萜醇 agarospirolC15H26O1 6300.46±0.0122.94γ-依兰油烯 γ-muuroleneC15H241 4740.65±0.0124.7681,2,4a,5,6,8a-六氢-4,7-二甲基-1-甲基乙基萘C15H241 5370.64±0.011,2,4a,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-1-methylethyl naphthalene15.8833-甲基-6-(1-甲基乙基)-2-环己烯-1-酮C10H16O1 2620.52±0.012-cyclohexen-1-one, 3-methyl-6-(1-methylethyl)-10.935异戊酸异戊酯 3-methylbutyl 3-methylbutanoateC10H20O21 1060.52±0.0126.981(+)-荜澄茄油烯醇 epicubenolC15H26O1 6130.35±0.0112.503(+)-香茅醛 6-octenal, 3,7-dimethyl-, (R)-C10H18O1 1560.44±0.0119.001乙酸松油酯 α-terpinyl acetateC12H20O21 3470.35±0.0125.588反式-橙花叔醇 1,6,10-dodecatrien-3-ol, 3,7,11-trimethyl-, (E)-C15H26O1 5650.28±0.017.661α-水芹烯 α-phellandreneC10H161 0010.21±0.0116.363顺-4-癸烯-1-醇 (Z)-4-decen-1-olC10H20O1 2770.24±0.0125.76顺式-3-己烯醇苯甲酸酯 3-hexen-1-ol, benzoate, (Z)-C13H16O21 1940.26±0.0111.086反式玫瑰氧化物 trans-rose oxideC10H18O1 1110.31±0.0121.411荜澄茄油烯 cubeneneC15H241 5320.17±0.0116.933醋酸冰片酯 bornyl acetateC12H20O21 2580.15±0.0114.8498,9-去百里香酚 8,9-dehydrothymolC10H12O1 2290.21±0.0113.106苯甲酸乙酯 benzoic acid, ethyl esterC9H10O21 2090.12±0.0122.171α-石竹烯 humuleneC15H241 4460.22±0.016.069莰烯 campheneC10H169540.16±0.0118.0282,4-癸二烯醛 2,4-decadienalC10H16O1 3290.09±0.0112.393-甲基丁-2-烯基戊酸酯 valeric acid, 3-methylbut-2-enyl esterC10H18O21 1520.05±0.0120.803甲基丁香酚 methyleugenolC11H14O21 4160.07±0.0113.894(Z)-4-癸烯醛 cis-4-decenalC10H18O1 1990.08±0.017.825蒈烯 careneC10H161 0090.06±0.0120.076β-波旁烯 (-)-β-bourboneneC15H241 3760.09±0.018.7243-蒈烯 3-careneC10H161 0370.03±0.01
2.3 精油对真菌的抑菌活性
2.3.1 精油对菌落生长的影响
随着祁连圆柏精油处理浓度的增加，对真菌菌落生长的抑制率逐渐增大(P<0.05)，说明祁连圆柏精油对4种真菌具有良好的抑制效果，且抑制效果与精油浓度密切相关(图1)。在同一浓度处理下，精油对不同菌种的菌落生长抑制率也不同，说明不同菌种对精油的耐受性不同。从4个浓度的抑菌效果可以看出(图2)，青霉对精油的敏感性更强，根据精油对4种真菌菌落生长的抑制作用由强到弱可以排序为：扩展青霉﹥硫色镰刀菌﹥粉红单端孢﹥互隔交链孢。
图1 精油处理对真菌菌落生长的影响
Fig.1 Effect of essential oil treatment on fungal colony expansion
图2 精油处理对真菌菌落生长的抑制作用
Fig.2 Essential oil treatment inhibited the colony growth of fungi
注：大小写字母分别代表组间和组内差异显著性(P<0.05)(下同)
2.3.2 精油对孢子萌发的影响
祁连圆柏精油处理有效抑制了4种真菌孢子的萌发，其抑制作用随着祁连圆柏精油浓度的增加而逐渐增强(图3)。同一浓度下，精油对4种菌孢子萌发的抑制作用差异性不大，不同浓度的处理下，精油对青霉孢子萌发的抑制效果最佳。当精油处理浓度达到1 μL/mL时，对4种真菌的孢子萌发抑制率皆在60%以上。
图3 精油处理对真菌孢子萌发的抑制作用
Fig.3 Essential oil treatment inhibited fungal spore germination
2.3.3 精油对菌丝生物量积累的影响
祁连圆柏精油处理能够显著降低4种真菌的生物量(P<0.05)(图4)，其抑制效果有着显著的浓度依赖性，即随着祁连圆柏精油处理浓度的增加，真菌的生物量显著降低。当精油处理浓度为1 μL/mL时，4种真菌中扩展青霉的生物量最小。
a-互隔交链孢；b-扩展青霉；c-硫色镰刀菌；d-粉红单端孢
图4 精油处理对真菌生物量的降低作用
Fig.4 Essential oil treatment reduced the biomass of fungi
2.4 精油对细菌的抑制活性
祁连圆柏精油对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)以及革兰氏阴性菌(大肠杆菌、粪产碱杆菌)均有明显的抑制作用(图5)。而且，同一精油浓度对不同菌种的抑制效果不同。在精油等梯度浓度增加时，4种菌抑菌圈直径变化的幅度也有差异，对粪产碱杆菌的抑制效果较好，抑菌圈直径可达21.29 mm；而对金黄色葡萄球菌的抑制效果较差，抑菌圈直径为18.67 mm(表2)。
2.5 MIC值和MBC/MFC值
扩展青霉和硫色镰刀菌的MIC和MFC值分别为0.875、1 μL/mL，比互隔交链孢和粉红单端孢的MIC和MFC值低，说明扩展青霉和硫色镰刀菌对精油的敏感性要强于互隔交链孢和粉红单端孢。通过对4种细菌的MIC和MBC值的比较可以发现(表3)，2种革兰氏阴性菌有较高的MIC和MBC值，这表明祁连圆柏精油对革兰氏阳性菌的抑菌效果强于革兰氏阴性菌。革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC值都为2.34 μL/mL；革兰氏阴性菌大肠杆菌和粪产碱杆菌的MIC值为4.68 μL/mL，是革兰氏阳性菌的2倍。大肠杆菌的MBC值为9.36 μL/mL，在4种供试菌中最高，表明祁连圆柏精油对大肠杆菌的抑制效果较差。
表2 祁连圆柏精油对4种细菌的抑制作用
Table 2 Inhibitory effect of essential oil of Sabina przewalskii Kom. on four bacteria species
供试菌种抑菌圈直径/mm3 μL/mL6 μL/mL9 μL/mL12 μL/mL革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌12.52±0.2713.49±0.4515.49±0.4518.67±0.36枯草芽孢杆菌 12.16±0.1713.38±0.5318.22±0.1620.25±0.96革兰氏阴性菌粪产碱杆菌 14.26±0.1415.60±0.3319.57±0.5321.29±0.37大肠杆菌 14.37±0.0517.45±0.3519.67±1.2620.63±0.85
图5 精油处理对细菌生长的影响
Fig.5 Effect of essential oil treatment on bacterial growth
表3 MIC值和MBC/MFC值 单位：μL/mL
Table 3 MIC and MBC/MFC values
指标金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌粪产碱杆菌大肠杆菌互隔交链孢扩展青霉硫色镰刀菌粉红单端孢MIC2.342.344.684.681.1250.8750.8751.125MBC /MFC4.684.684.689.361.25111.25
3 讨论
精油是植物源天然产物中具有较强杀菌或抑菌活性的物质，对于细菌、真菌等微生物都具有显著的抑制作用，有替代传统化学合成杀菌剂的潜力[13]，但某些植物由于其独特的功效或特殊的生长条件，使其自身价格昂贵。而柏科类植物资源丰富，生态适应幅度宽，一般用作绿化植物，更适合作为精油提取的廉价材料。刘林芳[7]和刘喜梅等[14]发现不同海拔高度的祁连圆柏精油成分和含量存在差异性。本实验以天祝县祁连圆柏为材料提取的精油得率为2.83%，且成分中共鉴别出47种化合物。在前人研究中发现，5种挥发精油化学组成存在差异，相同成分有7种，分别为α-蒎烯、γ-松油烯、(R)-(-)-4-萜品醇、大根香叶烯、(+)-δ-杜松烯、榄香醇和柏木脑,且这5种精油中α-蒎烯含量都在20%以上。而本实验所提取的精油成分中不含有α-蒎烯、(+)-δ-杜松烯、榄香醇和柏木脑，其他相同成分的含量也有很大差异。这说明不同地区及不同海拔高度的变化对祁连圆柏挥叶油成分及其质量分数有一定的影响，这可能是因为挥发油的主要成分是单萜及其含氧衍生物和部分倍半萜类化合物，而萜类物质的种类、质量分数会受到海拔高度、大气温度、薄雾天气相对数量、太阳辐射等环境因素的影响，所以会使精油成分种类和质量分数发生变化。
RYU等[15]研究发现刺柏针叶中木脂素类化合物具有一定抗炎、抗病毒等生物活性。蒋继宏等[16]对6树种的植物挥发油的抑菌活性进行了研究，结果表明龙柏挥发油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较好的抑制效果。DERWICH 等[17]对7种细菌进行了体外抗菌活性实验，结果发现刺柏精油对供试细菌菌株表现出有效的杀菌活性，MIC为 0.02～0.40 mg/mL。本研究也发现，祁连圆柏精油对4种细菌均有一定的抑制作用，这与刘林芳[7]的研究结果一致，而且祁连圆柏精油对4种真菌(P. expansum、F.sulphureum、A.alternata及T.roseum)也具有抑制活性。植物精油具有较强抑菌活性的原因是成分中有酚类、萜烯类、醛酮类等物质[18]。GARRE等 [19]通过研究发现D-柠檬烯与热处理结合能够有效提高D-柠檬烯的抑菌活性。胡小刚等[20]研究发现R-和S-芳樟醇均具有良好的抗菌活性。本研究结果表明，祁连圆柏精油成分中含有大量的萜烯类物质，其对4种真菌和4种细菌均有明显的抑制作用，而D-柠檬烯、芳樟醇、丁香酚、香茅醇等物质都在祁连圆柏精油中被检测出来，结合丁华等[21]、郭峰等[22]发现丁香酚、香茅醇等物质也具有抗菌功效，这能够证实祁连圆柏具有抑菌活性的基础，也可以作为精油单体提取优先选择的材料。虽然这几种物质含量占比不太高，但是微量成分在抗菌活性中也会有至关重要的作用，这可能是成分之间相互作用产生的协同作用[23]。综合以上研究发现，柏科植物的抑菌效果具有普遍性，这为发现和开发柏科植物资源的利用价值提供新的思路。
4 结论
本研究所提取的祁连圆柏精油得率可达2.83%，经GC-MS分析测定的主要成分为桧烯、α-杜松醇、(-)-4-萜品醇、γ-松油烯、香茅醇、萜品油烯、月桂烯、D-柠檬烯等物质，占总成分的63.535%。该精油对4种果蔬腐败真菌孢子萌发和菌落生长均有较好的抑制活性，且抑制活性存在显著浓度依赖性。对革兰氏阳性菌的抑菌活性强于革兰氏阴性菌。以上结果对祁连圆柏精油的开发利用提供依据，以期为开发天然绿色抑菌剂提供新材料。
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